Name: Etiquetado de los vasos sanguíneos en el cerebro Teleost y la hipófisis usando perfusión cardíaca con un-fijador DiI (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Aprenda a etiquetar vasos sanguíneos en cerebro e hipófisis de peces teleósteos mediante perfusión cardíaca con DiI en fijador usando Oryzias latipes. Este método eficiente permite estudiar la anatomía vascular y sus relaciones con neuronas.

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Agradecemos al Dr. Shinji Kanda la demostración de perfusión cardiaca con solución fijadora en medaka, la Sra. Lourdes Carreon G tan para obtener ayuda con la cría de medaka y el Sr. Anthony Peltier para las ilustraciones. Este trabajo fue financiado por la NMBU y por el Consejo de investigación de Noruega, concesión número 248828 (programa de vida de Noruega digital).

Todo el manejo de los animales se realizó de acuerdo con las recomendaciones para el cuidado y el bienestar de los animales de investigación en la Universidad Noruega de Ciencias de la vida, y bajo la supervisión de los investigadores autorizados.
1. preparación de instrumentos y soluciones
<ol><li>Preparar la solución de acción DiI disolver 5 mg de cristal DiI en 1,5 mL tubo de plástico con 1 mL de 96% EtOH. Vórtice durante 30 s y manténgase cubierto con papel de aluminio. Nota: La solución de la acción DiI se puede conservar en la oscuridad a-20 ° c durante varios meses.</li>
	<li>Preparar el soporte para peces (figura 1a) cortando un trozo de poliestireno a 5 cm de longitud, 3 cm de ancho, y 2 cm de espesor, y encolado a un plato de plástico de 9 cm de diámetro. Hacer un agujero en forma de bote de 3 cm con una hoja de bisturí en el poliestireno.</li>
	<li>Prepare el sistema de perfundiendo (figura 2) añadiendo una cánula de plástico de 30-50 cm de largo en el extremo de la aguja.</li>
	<li>Preparar 40 mL de solución fresca de paraformaldehído al 4% (PFA) diluyendo 10 mL de 16% de PFA con 30 mL de solución salina tampón de fosfato (PBS) en un tubo de plástico de 50 mL.</li>
	<li>Prepare 10 mL de solución Fixative/DiI diluyendo 1 mL de la solución de acción DiI en 9 mL de PFA recién preparada al 4% en un tubo de plástico de 10 mL. Mantener en la oscuridad hasta su uso. Nota: Los cristales DiI que no se disuelven se pueden mantener en el tubo de solución de stock, y se puede añadir nuevo etanol para preparar nueva solución de la acción DiI (ver paso 1,1).</li>
	<li>
Preparar 50 mL de acción de tricaína (MS-222).
	<ol>
<li>Disolver 200 mg de Tricaine en polvo en 48 mL de H2O. Añadir 2 ml de la base de Tris de 1 M (pH 9). Ajustar a pH 7 con 1 M HCl y almacenar a-20 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluir 5 mL de la culata de Tricaine en 50 mL de agua limpia en un vaso pequeño.</li>
	<li>Prepare varias pipetas de vidrio de 5 cm (figura 2) estirando un capilar de vidrio con un extractor de piletas siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>2. disección y perfusión
Nota: La PFA es un compuesto tóxico volátil, por lo tanto, la disección y la perfusión se deben realizar en una campana o en una habitación ventilada, y el usuario debe llevar una máscara de gas.
<ol><li>Prepare las herramientas de disección incluyendo tijeras pequeñas, y un fórceps afilado y uno fuerte antes de la disección.</li>
	<li>Llene la jeringa con la solución preparada de PFA/DiI colocándola en el tubo de 50 mL y dibujando. A continuación, coloque la aguja con la cánula en el extremo de la jeringa (figura 2).</li>
	<li>Fije la jeringa al Banco utilizando varios trozos de cinta colocados en diferentes direcciones, ajuste la posición del microscopio y el asiento para obtener una buena posición para la disección y para presionar el pistón de la jeringa (figura 1B). Nota: En este protocolo, el codo se utiliza para presionar hacia abajo el pistón de la jeringa, pero se pueden utilizar otras opciones de posibilidades, por ejemplo, la asistencia de otra persona.</li>
	<li>Eutanasia al pez con una sobredosis de tricaína colocando el pez en la solución preparada en el paso 1,7. Espere 30 s y pruebe los reflejos del pez agarrando su aleta caudal con el fórceps. El pez se puede utilizar cuando ha dejado de responder a los estímulos.</li>
	<li>Coloque el pez en el sostenedor del pez con su abdomen hacia arriba y PIN una aguja en la extremidad de la cabeza y otra encima de la cola para mantener el pescado en su lugar.</li>
	<li>Abra el abdomen anterior con las tijeras cortando horizontalmente la capa superficial de la piel.</li>
	<li>Con fórceps, retire la piel por encima del corazón hasta que se provea un acceso claro al ventrículo y al bulbo arterioso (figura 3).</li>
	<li>Añadir una Piera de vidrio en la extremidad del capilar y romper el extremo de la punta de la Piera de vidrio. Nota: El orificio de la punta rota debe ser lo suficientemente grande como para dejar salir el líquido, pero todavía lo suficientemente pequeño para entrar fácilmente en el tejido. La Piera de vidrio se puede reutilizar si no está rota o obstruida.</li>
	<li>Acerque la Piela de vidrio al ventrículo y agregue presión al pistón de la jeringa con el codo para forzar la salida del líquido.</li>
	<li>Fijar el ventrículo cardíaco con la Piera de vidrio y añadir presión a la jeringa.</li>
	<li>Directamente después, perforar el seno venoso con fórceps para permitir que la sangre deje la circulación. Nota: El ventrículo cardíaco se vuelve más frágil debido al fijador. También se vuelve menos rojo como la sangre se diluye con la solución Fixative/DiI.</li>
	<li>Desde el ventrículo, ajuste el ángulo de la Piera de vidrio para encontrar la entrada del el bulbo arterioso. Traiga la Piera que se abre dentro del bulbo arterioso como se muestra en la figura 2, y agregue más presión a la jeringa. Nota: El bulbo arterioso es transparente y el tejido es elástico. Al reemplazar la sangre con DiI/fijador, la Piera de vidrio dentro del corazón debe ser más visible y añadiendo presión, el tamaño del bulbo arterioso debe expandirse. Este paso es crucial para asegurarse de que se ha utilizado suficiente presión para reemplazar toda la sangre con la solución Fixative/DiI, y que todos los vasos sanguíneos se han alcanzado. A menudo, cuando se tiene éxito, el PFA provoca contracciones musculares y el pez se va a mover.</li>
	<li>Continúe añadiendo presión sobre la jeringa durante 30-60 s aún manteniendo la Piera de vidrio en el interior del el bulbo arterioso.</li>
	<li>Retire la de vidrio y las agujas del pescado.</li>
	<li>Diseccionar el cerebro y la hipófisis, e incubar los tejidos en fresco 4% PFA en PBS para 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente. Nota: La disección del cerebro y la hipófisis anteriormente se ha descrito en detalle de dos maneras diferentes por Fontaine et al.26 y Ager-Wick et al.27. Debido a la fijación, el tejido se vuelve bastante duro y el eslabón frágil entre el cerebro y la hipófisis puede romperse. Después de la disección, el procesamiento posterior a la fijación también se puede realizar durante la noche a 4 ° c.</li>
	<li>Enjuague el tejido dos veces en PBS durante 10 minutos antes de prepararse para la toma de imágenes. Nota: A continuación, se puede montar el tejido entre el deslizamiento y el resguardo de la cubierta con espaciadores entre el medio y el soporte de montaje para la imagen confocal (ver figura 4), o seccionado con un vibratomo como se describe detalladamente en Fontaine et al.26 antes de montar entre deslizamiento y tapa para la toma de imágenes con un microscopio Estereomicroscopio (ver figura 4).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

La perfusión cardíaca con DII previamente se ha utilizado para etiquetar los vasos sanguíneos en varias especies modelo24, incluyendo el pez teleósteo13.
Como DiI es entregado directamente a la membrana de la célula endotelial por perfusión en la vasculatura, es posible aumentar la relación señal-ruido mediante el aumento de la concentración de DiI en la solución fijadora. Además, el fluoróforo proporciona una coloración intensa cuando...

Los vasos sanguíneos desempeñan una parte esencial del cuerpo vertebrado, ya que proporcionan los nutrientes necesarios, el oxígeno y las señales hormonales a todos los órganos. También, desde el descubrimiento de su participación en el desarrollo del cáncer1, han recibido mucha atención en la investigación clínica. Aunque una serie de publicaciones han investigado los mecanismos que permiten el crecimiento de los vasos sanguíneos y la morfogénesis, y un gran número de genes importantes para su formación se han identificado2, queda mucho por entender en cuanto a la interacción entre las células o los tejidos y la sangre circulante.
La visualización de la vasculatura sanguínea en el cerebro y la hipófisis es importante. Las neuronas en el cerebro requieren un alto suministro de oxígeno y glucosa3, y la hipófisis contiene hasta ocho importantes tipos de células productoras de hormonas que utilizan el flujo sanguíneo para recibir la señal del cerebro y enviar sus respectivas hormonales a diferentes órganos periféricos4,5. Mientras que en los mamíferos, el sistema del portal en la base del hipotálamo llamado la eminencia mediana, une el cerebro y la hipófisis6, tal un puente sanguíneo claro no se ha descrito en el pez teleósteo. De hecho, en teleosts, neuronas preoptico-hipotalámica proyectar directamente sus axones en el pars nerviosa de la hipófisis7 y en su mayoría inervate los diferentes tipos de células endocrinas directamente8,9. Sin embargo, algunas de estas neuronas tienen sus terminaciones nerviosas ubicadas en el espacio extravascular, cerca de los capilares sanguíneos10. Por lo tanto, la diferencia entre el pez teleósteo y los mamíferos no es tan clara, y la relación entre la vasculatura sanguínea y el cerebro y las células pituitarias requiere una mayor investigación en los peces teleósteo.
El pez cebra tiene, en muchos aspectos, un sistema vascular anatómico y funcionalmente comparable a otras especies de vertebrados11. Se ha convertido en un poderoso modelo de vertebrados para la investigación cardiovascular principalmente gracias al desarrollo de varias líneas transgénicas donde los componentes del sistema vascular están etiquetados con proteínas reporteras fluorescentes12. Sin embargo, la anatomía exacta del sistema circulatorio puede variar entre especies, o incluso entre dos individuos pertenecientes a la misma especie. Por lo tanto, la visualización de los vasos sanguíneos puede ser de gran interés también en otras especies teleósteo para las cuales no existen herramientas de transgénesis.
Se han descrito varias técnicas para etiquetar los vasos sanguíneos tanto en mamíferos como en teleostos. Estos incluyen la hibridación in situ para genes específicos de la vasculatura, la tinción de fosfatasas alcalinas, la microangiografía y las inyecciones de tinte (para una revisión ver13). Colorante indocarbocianine catiónico fluorescente lipofílico (DII) primero se utilizó para estudiar la movilidad lateral de lípidos de membrana, ya que se retiene en las bicapas de lípidos y puede migrar a través de él14,15,16. De hecho, una molécula de DiI se compone de dos cadenas de hidrocarburos y cromos. Mientras que las cadenas de hidrocarburos se integran en la membrana de la célula bicapa lipídica de las células en contacto con ella, los cromos permanecen en su superficie17. Una vez en la membrana, las moléculas DiI se difunden lateralmente dentro de la bicapa lipídica que ayuda a manchar las estructuras de la membrana que no están en contacto directo con la solución DiI. Inyectar una solución DiI a través de la perfusión cardíaca, por lo tanto etiquetará todas las células endoteliales en contacto con el compuesto permitiendo el etiquetado directo de los vasos sanguíneos. Hoy DiI también se utiliza para otros fines de tinción, como la imagen de una sola molécula, mapeo del destino, y rastreo neuronal. Curiosamente, existen varios fluoróforos (con diferentes longitudes de onda de emisión) permitiendo la combinación con otras etiquetas fluorescentes, y la incorporación, así como la difusión lateral de DiI puede ocurrir en los tejidos vivos y fijos18, 19.
El formaldehído, descubierto por Ferdinand Blum en 1893, se ha utilizado ampliamente hasta el día de hoy como el producto químico preferido para la fijación del tejido20,21. Muestra una amplia especificidad para la mayoría de los objetivos celulares y preserva la estructura celular22,23. También preserva las propiedades fluorescentes de la mayoría de los fluoróforos, y por lo tanto se puede utilizar para fijar animales transgénicos para los cuales las células dirigidas expresan proteínas reporteras fluorescentes.
En este manuscrito, un protocolo anterior desarrollado para etiquetar los vasos sanguíneos en pequeños modelos experimentales de mamíferos24 se ha adaptado al uso en peces. Todo el procedimiento tarda solo un par de horas en realizarse. Se demuestra cómo perfumar una solución fijadora de formaldehído que contiene DiI en el corazón de pescado con el fin de etiquetar directamente todos los vasos sanguíneos en el cerebro y la hipófisis de la medaka modelo de pescado. Medaka es un pequeño pez de agua dulce originario de Asia, que se encuentra principalmente en Japón. Es un organismo modelo de investigación con un conjunto de herramientas moleculares y genéticas disponibles25. Por lo tanto, la identificación de los vasos sanguíneos en esta especie, así como en otros permitirá mejorar nuestra comprensión sobre cómo el cerebro y las células pituitarias interactúan con la vasculatura sanguínea en tejido entero o rebanadas de tejido grueso.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehído al 16%</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>RT 15711</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Jeringa PP/PE sin aguja</td><td>Jeringas</td><td>Sigma</td><td>Z116866-100EA</td></tr><tr><td>Agujas de jeringa BD Precisionglide Sigma</td><td></td><td>Z118044-100EA</td><td>agujas 18G (1,20*40)</td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato 10 cm de diámetro exterior 1,2 mm</td><td>instrumento sutter</td><td>BF120-94-10</td><td>pipeta</td></tr> <tr><td>de vidrioDiI (1,1&prime;-Dioctadecil-3,3,3&prime;,3&prime;-tetrametililindocarbocianina perclorato)</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de LDPE O.D 1,7 mm e I.D 1,1 mm</td><td>Portex</td><td>800/110/340/100</td><td>cánula</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato solución salina (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico</td><td>VWR</td><td>391-0442</td><td></td></tr><tr><td>Superglue gel</td><td>loctite</td><td>c4356</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (ms-222)</td><td>sigma</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

etiquetado de los vasos sanguíneos en el cerebro teleost y la hipófisis usando perfusión cardíaca con un-fijador dii

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Los vasos sanguíneos inervan todos los tejidos en los vertebrados, lo que permite su supervivencia proporcionando los nutrientes necesarios, oxígeno, y las señales hormonales. Es uno de los primeros órganos que empiezan a funcionar durante el desarrollo. Los mecanismos de formación de los vasos sanguíneos se han convertido en un tema de alto interés científico y clínico. En los adultos sin embargo, es difícil visualizar la vasculatura en la mayoría de los animales vivos debido a su localización profunda dentro de otros tejidos. Sin embargo, la visualización de los vasos sanguíneos sigue siendo importante para varios estudios como Endocrinología y Neurobiología. Mientras que varias líneas transgénicas se han desarrollado en el pez cebra, con los vasos sanguíneos directamente visualizados a través de la expresión de proteínas fluorescentes, no existen tales herramientas para otras especies teleósteo. Usando medaka (Oryzias latipes) como modelo, el protocolo actual presenta una técnica rápida y directa para etiquetar los vasos sanguíneos en el cerebro y la hipófisis mediante el perfundiendo a través del corazón con fijador que contiene DII. Este protocolo permite mejorar nuestro entendimiento sobre cómo las células cerebrales y pituitarias interactúan con la vasculatura sanguínea en tejidos enteros o rebanadas gruesas de tejido.

Este protocolo demuestra un procedimiento paso a paso para etiquetar los vasos sanguíneos en el cerebro de medaka y la hipófisis, y al mismo tiempo fijar el tejido. Después del etiquetado por inyección cardíaca de una solución fijadora que contiene DiI en el corazón, los vasos sanguíneos se pueden observar en rodajas usando un estereomicroscopio fluorescente (figura 4) o en tejido entero usando un microscopio confocal (figura 5). Ya sea en la rebanada de tejido ...

El artículo describe un protocolo rápido para etiquetar los vasos sanguíneos en un pez teleósteo por perfusión cardíaca de DII diluido en fijador, usando medaka (Oryzias latipes) como modelo y centrándose en el cerebro y el tejido pituitario.

Etiquetado de los vasos sanguíneos en el cerebro Teleost y la hipófisis usando perfusión cardíaca con un-fijador DiI

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar los vasos sanguíneos en el cerebro y la hipófisis de los peces teleost, y utilizamos perfusión cardíaca con un fijador que contiene DiI en la especie modelo medaka. Así que esta técnica que es simple y eficiente ayudará a responder preguntas importantes sobre la anatomía vascular en el cerebro y la hipófisis de los peces teleost, así como la relación entre las neuronas o células endocrinas y vasos sanguíneos. Algunas ventajas de esta técnica incluyen una preparación rápida y fácil y sencilla, y su adaptabilidad a las especies de peces teleost.Para preparar un soporte de pescado, corte un trozo de poliestireno a una longitud de cinco centímetros, un ancho de tres centímetros y un grosor de dos centímetros, y pegue el poliestireno a una placa de plástico de nueve centímetros de diámetro. Luego usa un bisturí para hacer un agujero en forma de barco de tres centímetros en el poliestireno. Para preparar el sistema de perfusión, añada una cánula de plástico de 30 a 50 centímetros de largo en la extremidad de la aguja del sistema de perfusión.Para preparar pipetas de vidrio de cinco centímetros, utilice un tirador de pipetas para esti

labeling-blood-vessels-teleost-brain-pituitary-using-cardiac

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se demuestra el uso de la pistola de genes para introducir tintes fluorescentes, como DII, en las neuronas en secciones de cerebro de los roedores y primates no humanos de diferentes edades. En este caso particular, utilizamos ratones adultos (3-6 meses de edad) y adultos de los monos cynomologus (9-15 años). Esta técnica, descrita originalmente por el laboratorio del Dr. Lichtman...

Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

En este artículo se describe un método para el etiquetado de la piel embrionaria y los vasos sanguíneos del timo.

Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones

Aquí se describe un bajo costo, procedimiento rápido, fijación controlada y uniforme usando 4% de paraformaldehído perfundido a través del sistema vascular: a través del corazón de la rata para obtener la mejor conservación posible del cerebro.

Animal entero fijación por perfusión de los roedores

Circuitos neuronales están topográficamente organizadas en compartimentos funcionales con determinados perfiles moleculares. Aquí, ofrecemos los pasos prácticos y técnicos para revelar la topografía global del cerebro mediante un método versátil wholemount tinción inmunohistoquímica. Se demuestra la utilidad del método que utiliza la citoarquitectura bien entendida y la circuitería de cerebelo.

La inmunohistoquímica wholemount de Topografía Revelando Complex Brain

Análisis de la anatomía cerebrovascular roedor juega un papel importante en la investigación de accidente cerebrovascular experimental. En este contexto, la perfusión intravascular con látex de color ha sido considerado como una herramienta estándar para varios años. Sin embargo, esta técnica implica distintas limitaciones técnicas, que socavan su reproducibilidad. Aquí se describe un método simple para visualizar los vasos cerebrales de una manera reproducible. La inyección de una mezcla de...

La perfusión intravascular de Carbono Negro Tinta fiable permite la visualización de los vasos cerebrales

Usando una técnica lipofílica de tinción de perclorato de 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina (DiI), Ambystoma mexicanum puede someterse a perfusión vascular para permitir una fácil visualización de la vasculatura.

La perfusión como un método para la visualización vascular<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Aquí presentamos un ensayo de permeabilidad vascular de cerebro de ratón mediante inyección intraperitoneal de trazadores fluorescentes seguido de perfusión que es aplicable a los modelos animales de disfunción de la barrera blood - brain. Una hemi-cerebro se utiliza para evaluar cuantitativamente la permeabilidad y el otro para tracer visualización/immunostaining. El procedimiento toma 5-6 h por 10 ratones.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Este protocolo describe un enfoque eficiente y reproducible para los estudios histológicos cerebrales de ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes.

Inmunotinción flotante de cerebros de ratón

La capacidad de marcar permanentemente las células madre y su progenie con un fluoróforo utilizando una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la multipotencia.

Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

La investigación preliminar confirma que la hemorragia subaracnoidea (HSA) causa la muerte de los pericitos cerebrales. La evaluación de la contractilidad de los pericitos después de la HSA requiere la diferenciación entre pericitos cerebrales viables y no viables. Por lo tanto, se ha desarrollado un procedimiento para marcar pericitos cerebrales viables y no viables simultáneamente en secciones cerebrales, lo que facilita la observación utilizando un microscopio confocal de alta resolución.

Obtención de imágenes de pericitos cerebrales vitales y no vitales en cortes de cerebro después de una hemorragia subaracnoidea

Demostramos la inducción química de la dilatación de grandes vasos sanguíneos en ratones como modelo para investigar la disfunción cerebrovascular, que se puede utilizar para el modelado de la demencia vascular y la enfermedad de Alzheimer. También demostramos la visualización de la vasculatura mediante la inyección de compuesto de caucho de silicona y proporcionamos una guía visual clara para medir los cambios en el tamaño de los vasos sanguíneos.

Un enfoque visual para inducir dolicoectasia en ratones para modelar la disfunción cerebrovascular mediada por grandes vasos

Aprenda a etiquetar vasos sanguíneos en cerebro e hipófisis de peces teleósteos mediante perfusión cardíaca con DiI en fijador usando Oryzias latipes. Este método eficiente permite estudiar la anatomía vascular y sus relaciones con neuronas.

Etiquetado de los vasos sanguíneos en el cerebro Teleost y la hipófisis usando perfusión cardíaca con un-fijador DiI

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