Name: 在无进料和异种定义的条件下,从人类多能干细胞中血性内皮物分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 了解如何在无饲养层和无异种成分的条件下，利用LM511-E8涂层从人多能干细胞高效分化造血内皮细胞。该方法可稳定获得CD34阳性造血祖细胞，适用于血液学和免疫学研究中的疾病建模与药物筛选。

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我们感谢Alina Li和Seiko Benno提供的技术协助。同时感谢渡边春美女士提供的行政支持，以及Peter Karagiannis博士对论文的编辑工作。本研究得到了日本医疗研究开发机构（AMED）再生医学实现研究支援网络iPS细胞研究核心中心的支持[M.K.S.]、AMED难治性疾病iPS细胞研究项目（17935423）[M.K.S.]以及日本科学技术振兴机构（JST）创新中心项目[R.O.和M.K.S.]的资助。

1. 试剂
<ol>
	<li>细胞系（人多能干细胞）：获取人胚胎干细胞（ESC）或iPSC细胞系409B2、201B7(317-9)和CBA11。</li>
	<li>试剂配制
	<ol>
		<li>多能干细胞接种培养基：将多能干细胞维持培养基与10 µM Y-27632混合，4 °C保存。</li>
		<li>多能干细胞球状体铺板培养基：使用前，将多能干细胞维持培养基与625–1,250 ng/mL人重组层粘连蛋白-511 E8片段（LM511-E8）（根据细胞系确定浓度）混合。 
		注意：LM511-E8可直接加入培养基中15。其他基质（如全长层粘连蛋白-511）需预先包被，即使如此，在分化过程中也无法有效维持中胚层类器官的贴附。</li>
		<li>第0天分化培养基：将中胚层基础培养基与2 µM CHIR99021、80 ng/mL 骨形态发生蛋白4（BMP4）和80 ng/mL 血管内皮生长因子（VEGF）混合。</li>
		<li>第2天分化培养基：将造血前体基础培养基与1 µM SB431542、80 ng/mL VEGF和100 ng/mL 干细胞因子（SCF）混合。</li>
		<li>配制不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）（见材料表）。</li>
		<li>1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液：将1 mL 0.5 M EDTA加入500 mL PBS中。</li>
		<li>EHT培养基：将造血基础培养基与50 ng/mL SCF、20 ng/mL 血小板生成素（TPO）、50 ng/mL Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt-3L）、20 ng/mL 白细胞介素-6/白细胞介素-6受体α（IL-6/IL-6Rα）、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺、L-谷氨酰胺以及青霉素/链霉素/两性霉素B混合。</li>
		<li>FACS缓冲液：将PBS与2%胎牛血清和1 mM EDTA混合。</li>
		<li>配制磁珠分选缓冲液（见材料表）。</li>
		<li>配制甲基纤维素基础培养基（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 多能干细胞集落形成
<ol>
	<li>将hPSCs在0.5 µg cm的培养皿中培养至70–80%汇合度-2 在37 °C、5% CO₂培养箱中，将LM511-E8包被的6孔板置于mTeSR1培养基中2.</li>
	<li>PSC 解离（第 -4 天）
	<ol>
		<li>吸弃培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。用消化液冲洗细胞。37 °C 孵育 15 分钟（在此期间细胞不会干燥）。</li>
		<li>将细胞悬浮于PSC维持培养基中，转移至适当大小的离心管，于200 x g条件下离心细胞 g 孵育3分钟。吸除上清液，将细胞重悬于PSC贴壁培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以每平方厘米48,000 – 70,000个细胞的密度接种PSC悬液-2 （根据细胞系的不同）接种至微加工塑料容器中，于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育过夜2. 
	注意： 我们推荐每孔使用 100 μL-1 在96孔微加工塑料容器中加入细胞悬液。通常每孔接种20,000个细胞-1 在96孔板中培养，以获得约100个球状体。</li>
	<li>PSC类球体的铺展 LM511-E8 （第 -3 天）
	<ol>
		<li>使用P1000移液器将PSC类球体轻轻转移至15 mL锥形管中，室温静置2 min，使其依靠重力沉降。吸除上清液。</li>
		<li>在非包被的6孔培养板中，用类球体铺板培养基重悬，以每平方厘米4个类球体的密度接种悬浮液-2 并在37 °C、5% CO₂培养箱中培养2 三天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 造血诱导（第0天）
<ol>
	<li>吸去培养基，加入第0天分化培养基，并在37 °C、5% O2 和 5% CO2 的培养箱（低氧培养箱）中培养。</li>
	<li>在第0天分化培养基中培养两天后，吸去培养基，然后加入第2天分化培养基，并在低氧培养箱中继续培养。</li>
</ol>
4. 造血内皮细胞的分离（第4天）
<ol>
	<li>两天后，吸除培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。用解离溶液冲洗细胞。在含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1 mM EDTA 轻柔重悬细胞，使其解离至单细胞水平，将细胞悬液转移至 50 mL 圆底离心管中，在 200 × g 条件下离心 3 分钟。吸除上清液，用 300 µL 磁性分离缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>加入 100 µL CD34+ 磁珠，轻柔吹打混匀。室温孵育 30 分钟。每 100 μL CD34+ 磁珠最多可处理 2000 万个细胞。</li>
	<li>用 40 µm 细胞滤网过滤细胞悬液。</li>
	<li>使用磁性分离器分离 CD34+ 细胞。</li>
</ol>
5. 诱导内皮细胞向造血细胞转变（EHT）
<ol>
	<li>纤连蛋白包被
	<ol>
		<li>通过将1 mg/mL的纤连蛋白用PBS稀释，配制所需体积的5 µg/mL纤连蛋白包被溶液。</li>
		<li>向24孔培养板的每孔中加入0.5 mL包被溶液，在室温下孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将分选后的CD34+细胞以200 x g离心3分钟，弃上清，用1 mL EHT培养基重悬细胞沉淀。</li>
	<li>使用细胞计数仪测定活细胞密度，并通过添加EHT培养基将细胞密度调整至200,000 cells mL-1。</li>
	<li>吸除纤连蛋白包被孔中的包被溶液并弃去，向每个包被孔中加入0.5 mL CD34+细胞悬液。</li>
	<li>在低氧培养箱中孵育一周。</li>
</ol>
6. 造血细胞的流式细胞术分析
<ol>
	<li>悬浮细胞收集：将培养基转移至15 mL锥形管中，在200 × g 条件下离心3分钟，吸除上清液。</li>
	<li>贴壁细胞收集
	<ol>
		<li>用0.5 mL PBS洗涤细胞两次。</li>
		<li>用解离液冲洗细胞，吸除多余液体。</li>
		<li>将培养板置于37 °C培养箱中孵育5分钟。</li>
		<li>用1 mL FACS缓冲液重悬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>混合悬浮细胞与贴壁细胞。</li>
	<li>在200 × g 条件下离心细胞3分钟，吸除上清液，加入50 µL FACS缓冲液重悬细胞。在室温避光条件下，用抗CD34和抗CD45抗体孵育细胞1小时。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞两次，200 × g 离心3分钟，吸除上清液后加入含0.5 µg/mL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚的0.5 mL FACS缓冲液重悬细胞。</li>
	<li>通过流式细胞仪检测CD34和CD45的表达水平。</li>
</ol>
7. 造血细胞的菌落形成单位（CFU）检测
<ol>
	<li>造血细胞收集：将培养液转移至15 mL圆锥形离心管中。用PBS轻轻冲洗培养孔两次。</li>
	<li>以200 x g 离心3分钟。吸去上清液。用1 mL EHT培养基重悬细胞。使用细胞计数仪测定细胞数量。</li>
	<li>取相当于10,000个细胞的悬液体积，加入3 mL含抗生素的甲基纤维素培养基中，用16 G或18 G注射器充分吹打混匀5次。</li>
	<li>将全部甲基纤维素培养基悬液分装至6孔板的每个孔中。</li>
	<li>置于37 °C、含5% CO2的培养箱中孵育两周，保持湿润。切勿扰动培养皿，集落对运动敏感。</li>
	<li>两周后，在显微镜下计数集落。</li>
</ol>

<ol><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li>
<li>Lancrin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haemangioblast+generates+haematopoietic+cells+through+a+haemogenic+endothelium+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage.</a> Nature. 457, 892-895 (2009).</li>
<li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone%2C+Heart%2C+and+Other+Mesoderm+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li>
<li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+HOXA%2B+hemogenic+vasculature+that+resembles+the+aorta-gonad-mesonephros%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros.</a> Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).</li>
<li>Batta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).</li>
<li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+path+to+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Defining the path to hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).</li>
<li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+haematopoietic+stem+cell+development%3A+from+the+embryo+to+the+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li>
<li>Blaser, B. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+HSCs+in+vitro%3A+don%27t+forget+the+hemogenic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Speck, N., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+lineage+and+legacy%3A+the+development+of+mammalian+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+imunology%22%5BJournal%5D)">Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells.</a> Nature imunology. , (2008).</li>
<li>Niwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+serum-free+monolayer+culture+for+orderly+hematopoietic+differentiation+of+human+pluripotent+cells+via+mesodermal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors.</a> PLoS One. 6, e22261(2011).</li>
<li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+controls+the+specification+of+definitive+and+primitive+hematopoiesis+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).</li>
<li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+definitive+haemogenic+endothelium+and+arterial+vascular+endothelium+represent+distinct+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages.</a> Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).</li>
<li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7, 41165(2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

我们所采用的无饲养层且无异源成分的定义明确的诱导方法，提供了一个精确且经济高效的平台，可规模化地诱导生成造血内皮（HE）细胞。在传统方案中，由于无法精确控制多能干细胞（PSC）克隆的密度和大小，影响了基于形态发生素/细胞因子的定向分化效率，从而阻碍了功能完整的造血内皮的形成10,11,12,13,14。我们曾发现，采用传统方案在不同批次间造血内皮诱导效果存在不一致现象。本新方案实现了对PSC克隆密度和大小的严格调控，从而克服了造血内皮诱导过程中的批次间不一致性问题。
我们利用了类球体的均一化形成，并在此基础上建立了一种无饲养层且无异源成分的明确培养条件，可在总共4天内高效生成定型内胚层（HE）。我们通过三个独立的细胞系验证了类球体的形成能够确保HE细胞的稳定生成。作为代表性结果，在三次独立实验中，409B2细胞系产生的CD34+细胞效率为12.7%–23.6%。实现PSC类球体形成的关键因子是LM511-E8。根据我们的经验，不建议使用其他基质（如Matrigel或全长层粘连蛋白产品）替代该成分。我们发现，中胚层类器官容易从Matrigel上脱落，并在分化过程中丢失；此外，无论是Matrigel还是全长层粘连蛋白，若未经预先包被，均无法有效锚定细胞。
本方案的潜在局限性在于，我们依赖PSC维持培养基来维持PSC的生长状态。我们已测试过其他培养基，例如StemFit，但发现其对造血诱导产生不利影响。推测原因可能是细胞在较短时间（4天）的诱导方案中难以从多能状态退出。如果研究者使用其他培养基维持PSC，我们建议在进行分化前，先将细胞适应性培养于PSC维持培养基中，并传代数次。该技术平台将有助于对细胞进行系统性操控与分析，并实现造血细胞的即用型生产与大规模诱导，具有潜在的临床应用价值。该系统的长期目标是，在人源化小鼠模型中模拟免疫缺陷疾病，以研究相关的细胞与分子机制，并开展药物筛选。

由于缺乏基于患者多能干细胞（PSCs）来源的自体造血干细胞（HSCs）进行疾病建模和高通量药物筛选的稳健平台，血液系统和免疫系统疾病新疗法的开发一直受到阻碍。诱导性多能干细胞（iPSC）技术的突破为利用患者细胞建立疾病模型带来了希望，但从患者iPSCs中获得具有功能的HSCs仍极具挑战。为了从人PSCs中获得HSCs，关键在于正确诱导胚胎模式形成及相关转录程序1,2,3,4,5,6,7,8。近年来在造血发育领域的进展揭示了生血性内皮（HE）在HSC发育中的关键作用9。HE可由PSCs诱导产生，并适用于基因转导等下游干预操作10,11,12,13。以HE为平台，联合表达5种转录因子（ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1）已成功诱导出具有长期植入能力并可分化为多种谱系的功能性HSCs14。然而，PSCs向HE的诱导效率不稳定且偏低，限制了对造血发育过程中细胞的系统性操控与分析，也阻碍了临床应用所需即用型及大规模造血细胞的生产。
本文介绍了一种经济高效且精确的方法，可在4天内于无饲养层和无异源成分的确定性条件下诱导产生定型内胚层细胞。该方法中，PSC细胞在iMarix-511基质上形成球状体并自发重新铺展成单层，从而确保PSC克隆密度的一致性，这对于高效诱导定型内胚层细胞至关重要。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575</td><td>0.5 M EDTA</td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>40&amp;mu;M 细胞筛</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>6 孔板</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240-112</td><td>青霉素/链霉素/两性霉素 B</td></tr><tr><td>抗 CD34 抗体</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07776</td><td>抗 CD34 抗体</td></tr><tr><td>抗 CD45 抗体</td><td>Biolegend</td><td>304012</td><td>抗 CD45 抗体</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;D Systems</td><td>314-BP-010</td><td>BMP4</td></tr><tr><td>CD34 磁珠</td><td>Miltenyi</td><td>130-046-703</td><td>CD34 磁珠</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Wako</td><td>038-23101</td><td>CHIR99021</td></tr><tr><td>Essential 6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15165-01</td><td>造血基础培养基</td></tr><tr><td>Essential 8</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15169-01</td><td>中胚层基础培养基</td></tr><tr><td>Ezsphere SP 微孔板 96 孔</td><td>AGC</td><td>4860-900SP</td><td>微加工塑料容器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biosera</td><td>FB-1365/500</td><td>FCS</td></tr><tr><td>纤维连接蛋白</td><td>Millipore</td><td>FC010-100MG</td><td>纤维连接蛋白</td></tr><tr><td>Flt-3L</td><td>R&amp;D Systems</td><td>308-FK-005</td><td>Flt-3L</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>IL-6/IL-6R&amp;alpha;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>8954-SR</td><td>IL-6/IL-6R&amp;alpha;</td></tr><tr><td>iMatrix-511</td><td>Matrixome</td><td>892 001</td><td>LM511-E8</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500-056</td><td>胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺</td></tr><tr><td>MACS 缓冲液</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td>磁性分离缓冲液</td></tr><tr><td>Methocult 4435MethoCult&amp;trade; H4435 富集培养基</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>04435</td><td>甲基纤维素培养基</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>85850</td><td>多能干细胞维持培养基</td></tr><tr><td>PBS</td><td>nacalai tesque</td><td>14249-24</td><td>PBS</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Wako</td><td>031-24291</td><td>SB431542</td></tr><tr><td>SCF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>255-SC-010</td><td>SCF</td></tr><tr><td>Stemline II 造血干细胞扩增培养基</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0192-500ML</td><td>造血基础培养基</td></tr><tr><td>TPO</td><td>R&amp;D Systems</td><td>288-TPN</td><td>TPO</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604-021</td><td>解离溶液</td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>293-VE-010</td><td>VEGF</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>253-00513</td><td>Y-27632</td></tr></tbody></table>

无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

从人多能干细胞（PSCs）中获得具有功能的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）一直是实现治疗血液系统疾病和恶性疾病自体移植的难点。生血性内皮（HE）是一种可用于通过转录因子生成功能性HSPCs，或高效诱导淋巴细胞的可行平台。然而，目前获得HE的方法要么成本高昂，要么产量不稳定。在本方案中，我们建立了一种经济高效且精确的方法，可在无饲养层、无异源成分的明确条件下，于4天内获得HE。所获得的HE经历了内皮向造血转变过程，并产生了CD34+CD45+克隆形成性造血祖细胞。该平台在生成功能性HSPCs方面的潜力，将在疾病建模及治疗化合物筛选中具有广泛的应用前景。

PSC 克隆形成的示意图见图1A。PSC 悬浮球在微加工塑料培养容器中培养一天后形成。以代表性结果为例，每96孔微加工塑料培养容器可处理20,000个409B2细胞，尽管其他细胞系可能需要更高的密度（每96孔微加工塑料培养容器30,000–40,000个细胞）。当将这些细胞球接种至含有LM511-E8的培养皿中时，它们会自发铺展为接近二维的培养状态。
生血诱导的示意图如图1B所示。当PSC集落生长至直径达750 µm时，通过依次更换培养基诱导中胚层类器官。在向中胚层类器官分化过程中，随着培养基的逐步更换，PSC集落将逐渐转变为类似单面煎蛋的结构，直至第4天。在第4天，通过磁性分选从中胚层类器官中分离出造血内皮细胞，并将其接种至含纤维连接蛋白的EHT培养基中。由含100万PSC的球状体可获得约500万至1000万CD34+CD45-细胞（图1C）。
可以观察到细胞在形态上由内皮细胞转变为造血细胞（补充视频 1）。在造血诱导培养基刺激后的第 7 天，典型的造血祖细胞相差显微图像如 图 2A 所示。培养体系中出现了造血细胞克隆。 
代表性流式细胞术图谱见图2B。整个培养物用造血诱导剂刺激后，在第7天通过流式细胞术分析CD34和CD45的表达情况。造血祖细胞表达CD34和CD45。
菌落形成单位（CFU）实验显示，CD34+ CD45+ 造血祖细胞能够生成粒细胞/巨噬细胞集落（图2C）。每10,000个细胞中估计可形成38个CFU-G/M集落（图2D）
<img alt="干细胞分化示意图，显示流式细胞术及化学诱导过程结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：PSC 克隆铺展及通过生血内皮进行造血分化的示意图。（A）PSC 克隆形成的示意图过程。将 PSC 在涂有 LM511-E8 的 6 孔板中，使用 PSC 维持培养基进行培养。在第 -4 天，使用解离溶液将细胞解离并分散为单细胞水平，随后接种至微加工塑料容器中，并在含有 Y-27632 的 PSC 维持培养基中培养过夜以形成球体。在第 -3 天，将球体转移至含有 LM511-E8 的 PSC 维持培养基中继续培养三天。到第 0 天时，球体自发展平为近乎二维的培养状态。比例尺 = 200 µm。（B）在第 0 天，更换为第 0 天分化培养基，并在低氧培养箱中培养。在分化的第 2 天，更换为第 2 天分化培养基。在生血内皮富集的第 4 天，通过磁珠分选 CD34+ 细胞，并将其接种于纤连蛋白包被的 12 孔板中，在 EHT 培养基中培养 6 天。（C） 第 4 天经 CD34 分选后细胞的 CD45 和 CD34 表达的代表性流式细胞术图谱。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜细胞培养图像、流式细胞术图、细胞克隆实验、柱状图结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：造血特性的分析。（A）第7天使用造血诱导混合物刺激后，造血祖细胞的代表性相差显微图像。比例尺 = 200 µm。（B）第7天使用造血诱导混合物刺激后，全培养物中CD45和CD34表达的代表性流式细胞术图。（C）第11天造血祖细胞生成的粒细胞/巨噬细胞克隆的代表性相差显微图像。比例尺 = 500 µm。（D）每10,000个细胞的CFU数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养显微图像；用于生物研究的细胞结构可视化。" src="/files/ftp_upload/59823/59823vid1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="视频"> 
补充视频 1：EHT 视频。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/EHT_video.avi">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种在无饲养层且无异源成分的条件下，由人多能干细胞精确诱导生成生血性内皮细胞的实验方案。该方法在疾病建模及治疗性化合物筛选方面具有广泛的应用前景。

从人类多能干细胞（PSCs）中获得具有功能的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）一直是自体...

我们提供由人类多能干细胞生成血细胞的方法。该技术的主要优势在于能够获得稳定且精确数量的生血性内皮细胞。我们预计，该平台将广泛应用于疾病监测以及治疗性化合物的筛选。该技术对血液学和免疫学研究特别有益。该方法可应用于人血细胞的遗传干预或基因编辑，能够轻松地在造血内皮细胞中诱导载体。最关键的步骤是使用LM511-E8包被培养板以用于PSC克隆的培养。我们不建议省略包被步骤或使用其他基质替代。直观的演示非常重要，因为我们希望展示如何用解离缓冲液冲洗细胞，以及如何用LM511-E8对培养板进行包被。在 LM511-E8 包被的六孔板中，使用 mTeSR1 培养基将人多能干细胞（hPSCs）培养至 70% 到 80% 汇合度。造血诱导前四天，吸除培养基，用 PBS 洗涤两次。用消化液冲洗细胞，并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。将细胞重悬于PSC维持培养基中，并将悬液转移至1.5毫升微量离心管中。在200 × g下离心3分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于PSC接种培养基中。根据手稿说明，将PSC悬液接种到微加工塑料容器中，并过夜培养。在造血诱导前3天，轻轻将PSC类球体转移至15毫升锥形管中，在室温下静置2分钟，使其依靠重力沉淀。吸除上清液，用类球体接种培养基重悬类球体。将悬浮液接种至LM511-E8包被的10厘米培养皿中，接种密度为每平方厘米4个类球体，培养3天。3天后吸除培养基，加入第0天分化培养基，在低氧培养箱中继续培养2天。随后吸除第0天培养基，加入第2天分化培养基，再继续培养2天。两天后，吸除培养基，并用 PBS 洗涤细胞两次。用解离溶液冲洗细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 30 分钟。孵育结束后，通过在 1 毫摩尔 EDTA 中轻轻重悬细胞以解离细胞。将悬液转移至50毫升锥形管中，在200 × g条件下离心细胞3分钟。吸除上清液，并用300微升磁性分离缓冲液重悬细胞沉淀。向细胞中加入100微升CD34阳性微珠，轻轻吹打混匀。室温孵育30分钟，然后使用40微米细胞筛过滤悬液，并利用磁性分离器分离CD34阳性细胞。将0.5毫升浓度为5微克/毫升的纤维连接蛋白包被液加入24孔培养板的每孔中，于室温孵育30分钟。与此同时，将分选得到的CD34阳性细胞在200 × g条件下离心3分钟，并将沉淀重悬于1毫升EHT培养基中。使用细胞计数器测定活细胞密度，并通过添加EHT培养基将细胞密度调整至每毫升200,000个细胞。吸除并弃去纤维连接蛋白包被孔中的包被液，每孔加入0.5毫升CD34阳性细胞悬液。将细胞置于低氧培养箱中培养一周。为收集悬浮细胞，将培养基转移至15毫升锥形管中，在200 × g条件下离心3分钟，然后吸除上清液。为收集贴壁细胞，用0.5毫升PBS洗涤两次，并用解离缓冲液冲洗细胞。吸去多余液体，将培养板在37摄氏度下孵育五分钟。用一毫升Facs缓冲液重悬细胞，并混匀悬浮细胞与贴壁细胞。将混合细胞在200 × g 离心三分钟，然后吸去上清液，再将细胞重悬于50微升Facs缓冲液中。将抗CD34和抗CD45抗体用50微升Facs缓冲液稀释；加入细胞中，于室温避光孵育1小时。随后用PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后以200 × g离心3分钟。吸去上清液，将细胞重悬于0.5毫升含0.5微克/毫升dappy的Facs缓冲液中。通过流式细胞术检测CD34和CD45的表达。为收集造血细胞，将培养基转移至15毫升锥形管中。用PBS轻轻冲洗培养孔两次，收集残留细胞。将细胞在200 × g条件下离心3分钟，然后吸去上清液，并用1毫升EHT培养基重悬。计数细胞后，将10,000个细胞加入含抗生素的3毫升甲基纤维素培养基中，使用16号针头的注射器混匀5次。将全部培养基悬浮液分装至6孔板的每个孔中。为保持细胞湿润，请向培养板的空孔中加入水或 PBS。将细胞培养两周，注意不要扰动培养皿，因为细胞克隆对震动敏感。两周后，在显微镜下计数克隆。在造血诱导混合因子的刺激下，细胞从内皮细胞形态转变为造血细胞形态。培养物中出现造血细胞集落。造血祖细胞表达CD34和CD45，因此通过流式细胞术分析CD34和CD45的表达，以确认造血细胞集落的存在。集落形成单位实验表明，CD34阳性及CD45阳性的造血祖细胞可生成粒细胞或巨噬细胞集落。每10,000个细胞中集落数量估计为38个集落形成单位。最关键的步骤是计数PSC类球体。我们发现，表面参数是该方案效率的最主要决定性因素。该程序可用于现成的能产生能量的细胞（如天然存在的细胞和巨噬细胞）的制备。该平台可使研究人员探索人类造血发育中的关键决定性因素。

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发育生物学

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人诱导性多能干细胞向具有成熟免疫表型的脑微血管内皮样细胞的分化

了解如何在无饲养层和无异种成分的条件下，利用LM511-E8涂层从人多能干细胞高效分化造血内皮细胞。该方法可稳定获得CD34阳性造血祖细胞，适用于血液学和免疫学研究中的疾病建模与药物筛选。

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