Biochemistry
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Detección de inhibidores de la quinasa en microarrays de proteínas humanas autoensamblados
Chapters
Summary October 23rd, 2019
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Se presenta un protocolo detallado para la generación de microarrays de proteínas humanas autoensamblados para el cribado de inhibidores de la quinasa.
Transcript
NAPPA es una potente plataforma de microarray proteico que se puede utilizar para el estudio de la actividad de las proteínas y la función de una manera imparcial de alto rendimiento. Las proteínas mostradas en NAPPA se producen en un sistema de expresión basado en humanos utilizando ribosomas y chaperones derivados humanos con el fin de mejorar la probabilidad de plegado natural y actividad. El uso de matrices NAPPA para el cribado de inhibidores de la quinasa proporciona una nueva plataforma para la prueba de nuevos fármacos y mutaciones de quinasa clínicamente relevantes.
Los microarrays proteicos generados por la metodología NAPPA se pueden utilizar para muchas aplicaciones distintas, incluyendo el descubrimiento de biomarcadores, las interacciones proteína-proteína, la identificación de sustratos y la detección de fármacos. Realice pasos de control de calidad en el camino. Pruebe la calidad de su preparación de ADN, el microarray de ADN y el microarray proteico.
Si en cualquier paso la calidad no es buena, simplemente empezar de nuevo. Demostrando el procedimiento estará Lisa Miller, una técnico de mi laboratorio. Para preparar el crecimiento bacteriano para la mini-preparación de alto rendimiento en la casa, primero inocular las bacterias en la placa de barrena en un formato de 96 pozos, y dejar que crezca durante 16 horas.
Al día siguiente, llenar cada pozo de la placa de pozo profundo con 1,5 mililitros de excelente medio de caldo, complementado con ampicilina de anticuerpos. El anticuerpo depende del marcador de selección del plásmido. A continuación, esteriliza un dispositivo de 96 pines con 80% de etanol y llama.
Utilice el dispositivo estéril de 96 pines para recoger colonias de la placa de agar incubada durante la noche y sumergirse en los pozos de la placa de pozos profundos para inocular el cultivo. Cubra el bloque con un sello permeable al gas e incubar una coctelera durante 22 a 24 horas a 37 grados centígrados y 300 a 800 rpm. Después de eso, los cultivos de pellets y resuspend las culturas según el manuscrito.
Lyse bacterias mediante la adición de 200 microlitros de solución dos en cada pozo, sellar la placa con un sello de aluminio, e invertir cinco veces. Incubar las células durante exactamente cinco minutos. Para neutralizar la solución, agregue 200 microlitros de solución tres, selle la placa con un sello de aluminio e invierta cinco veces.
Luego, gire la placa a 3800 G, cuatro grados Celsius, durante 30 minutos para limpiar el sobrenadante de izado. Para preparar las placas de resina de intercambio de anión, primero, mezcle la suspensión de intercambio de aniones y vierta la lodo en una cubeta de vidrio. Apilar placas de filtro en la parte superior de una placa de pozo profundo para actuar como un recipiente de recogida de residuos.
A continuación, utilizando puntas P1000 de placa ancha, mezcle la suspensión y transfiera 450 microlitros de la suspensión a cada pozo de las placas de filtro. Centrifugar y desechar el flujo a través. Ahora, transfiera los sobrenadantes de izado a la pila de placa de resina y bloque de pozo profundo.
Gire las placas apiladas durante cinco minutos a 30 veces G con la velocidad de aumento más lenta y deseche el flujo a través. Para lavar la columna, agregue 400 microlitros de solución N3 tampón de lavado a cada pozo. Transfiera la placa de resina al colector de vacío para quitar el tampón de lavado.
Repita el paso de lavado tres veces y luego retire cualquier tampón de arandela restante con un breve giro de cinco minutos a 30 veces G.To eluir el ADN, coloque la placa de resina en una placa de recolección limpia de 800 microlitrotros. Añadir 300 microlitros de solución N5 a cada pozo y dejar reposar a temperatura ambiente durante diez minutos. Luego, gire las placas apiladas durante cinco minutos a 20 veces G con una velocidad de aumento lenta a 233 veces G durante un minuto.
Almacene las placas a 20 grados centígrados negativos antes de su uso. En primer lugar, coloque los portaobjetos en un bastidor y sumerja los portaobjetos en un depósito de vidrio que contenga la solución de recubrimiento de 2%reactivo de aminosilano en acetona. Mece los toboganes durante 15 minutos.
A continuación, enjuague los portaobjetos en acetona seguido de un enjuague final en agua. A continuación, seque los portaobjetos con aire a presión. Soplando sobre ellos desde todos los ángulos durante unos tres minutos hasta que se hayan eliminado todas las gotas de agua.
Guarde los portaobjetos recubiertos a temperatura ambiente en un estante metálico dentro de una caja herméticamente sellada. Ahora, proceda a precipitar el ADN como se describe en el manuscrito. Luego, resuspender el pellet de ADN en 20 microlitros de agua ultrapura y agitar a 1000 rpm durante dos horas.
Para preparar la muestra de matriz, agregue 10 microlitros de mezcla de impresión recién preparada que contenga el anticuerpo, el reticulante y la poli lisina a cada muestra de ADN. Selle las placas con papel de aluminio y agite a temperatura ambiente durante 90 minutos a 1000 rpm. Guarde las placas durante la noche a cuatro grados centígrados.
El día de la impresión, vórtice brevemente y gire las placas. Transfiera 28 microlitros de cada muestra a una placa de 384 pozos. Coloque los portaobjetos recubiertos de aminosilano y la placa de pozo 384, en la cubierta del arrayer, e inicie el programa de impresión de microarray.
Una vez realizada la impresión, etiquete las microarrays. Las microarrays se pueden almacenar durante meses hasta su uso posterior. Para medir los niveles de ADN, coloque las diapositivas en una caja de pipetas y bloquee con 50 mililitros de tampón de bloqueo.
Incubar los portaobjetos en una coctelera a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, deseche la solución y añada 20 mililitros de tampón de bloqueo y 33 microlitros de colorante fluorescente de ADN intercalado. Incubar durante 15 minutos con agitación.
Una vez finalizada la incubación, enjuague rápidamente los portaobjetos con agua ultra pura y séquelos con aire a presión. Los microarrays están listos para ser escaneados. Para expresar los microarrays, bloquee los portaobjetos como se muestra anteriormente y luego enjuáguelos con agua ultra pura, y séquelos con aire comprimido filtrado.
Fije una junta de sellado a cada diapositiva. Añadir 130 mililitros de transcripción in vitro y mezcla de traducción en los portaobjetos, y masajear suavemente las juntas de sellado para que la transcripción in vitro y la mezcla de traducción se extiendan y cubra toda el área de la matriz sin ninguna burbuja. Aplique los sellos de puerto redondo pequeños a ambos puertos.
Incubar durante 90 minutos a 30 grados Celsius para la expresión de proteínas, seguido de 30 minutos a 15 grados Celsius para la inmovilización de la proteína de consulta. A continuación, retire la junta, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada uno en 15 mililitros TBST con leche y bloquee la misma solución durante una hora. Para la detección de las proteínas en la matriz, retire el TBST con leche, coloque los portaobjetos en una placa de rejilla y aplique 600 microlitros de anticuerpo primario, anti-bandera del ratón, diluido de uno a doscientos, y 1x TBST complementado con 5% de leche.
Incubar durante una hora a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos con 50 mililitros de 1x TBST y 5% de leche en la coctelera mecedora tres veces durante cinco minutos cada una. Repita el procedimiento para el anticuerpo secundario.
Después de que termine la incubación de una hora, lave los portaobjetos con 1x TBST en la coctelera mecedora tres veces durante cinco minutos cada una. A continuación, enjuague rápidamente los portaobjetos con agua ultra pura y séquelos con aire a presión. Las diapositivas están listas para ser escaneadas.
Para realizar el tratamiento de fosfatasa y DNase, lave y bloquee las diapositivas expresadas con TBST complementadas con 3%BSA como se describe en el manuscrito. A continuación, coloque las diapositivas en una placa de rejilla y aplique 200 microlitros de solución de DNase fosfatasa. Coloque un resbalón de la cubierta de microarray en la parte superior para evitar la evaporación.
Incubar a 30 grados centígrados durante una hora y 30 minutos en el horno. A continuación, lave los portaobjetos con 1x TBST y 0,2 molares de cloruro sódico en el agitador de balanceo tres veces durante cinco minutos cada uno. Para realizar el tratamiento farmacológico y la reacción quinasa, coloque los portaobjetos en la placa de la red y aplique 200 microlitros de solución de quinasa de fármaco.
Coloque un resbalón de cubierta en la parte superior para evitar la evaporación. Incubar durante una hora a 30 grados centígrados en el horno. La clave de los datos reproducibles es el tiempo de incubación coherente en todas las diapositivas.
Esto es especialmente importante durante la reacción quinasa. Se debe tener en cuenta el tiempo necesario para procesar cada diapositiva. Después de eso, lave los portaobjetos con 1x TBST y 0,2 molar de cloruro sódico en el agitador de balanceo tres veces durante cinco minutos cada uno.
Repetir la detección de proteínas utilizando como anticuerpo primario anticuerpo fosfotirosina anticuerpo diluido de uno a 100 en TBST, complementado con 3%búptarica sérica bovina. Utilice 1x TBST y 3%búbrica de suero bovino para lavar después de la incubación con anticuerpos primarios, y TBST para lavados después de incubaciones con anticuerpos secundarios. Lavar y secar como antes.
Para la adquisición de imágenes, cargue las microarrays en el cargador del portaobjetos. Cargue el cargador en el escáner de microarray. Escanee todas las microarrays con la configuración optimizada y recuerde desactivar la ganancia automática al comparar imágenes entre experimentos.
Transfiera las imágenes a un software de cuantificación, alinee la cuadrícula con los puntos y cuantifique la intensidad de la señal de cada entidad en el microarray. Continúe con el análisis estadístico. En este estudio, el microarray mostró que la mayoría de las manchas que contenían ADN complementario mostraban con éxito niveles detectables de proteína.
Los microarrays de quinasa NAPPA mostraron una buena reproducibilidad entre los portaobjetos, con la correlación de los niveles de visualización de proteínas entre lotes de impresión distintos superiores a 0,88. Los resultados representativos de la actividad quinasa en matrices de quinasa de NAPPA mostraron altos niveles de fosforilación proteica después de la expresión. La comparación entre microarrays en los que se midieron los niveles de fosforilación justo después del tratamiento con fosfatasa, y después de 60 minutos de reacción de autofosforilación, sugiere la presencia de quinasas proteicas activas en la matriz.
En los arreglos de mezclas de quinasas NAPPA, imatinib mostró una reducción significativa en la actividad de ABL1 y BCR-ABL1, mientras que otras quinasas no se veron afectadas en su mayoría. La actividad quinasa se normalizó contra la matriz desfosforilada y representó como un porcentaje de la microarray de control positivo mostró inhibición selectiva de imatinib hacia ABL1 y BCR-ABL1. Los resultados típicos obtenidos para el cribado de ibrutinib mostraron que la actividad quinasa de ABL1 no es relevante no se ve afectada.
BtK objetivo canónico, y ERBB4 potencial nuevo objetivo, Mostró una menor actividad en presencia de ibrutinib. Los datos sugieren que ERBB4 puede ser inhibido por ibrutinib de una manera específica de la dosis. El éxito de los cribados de microarrays proteicos depende en gran medida de la calidad de la microarray en sí.
Se deben utilizar varias características de control positivas y negativas para permitir el análisis de datos adecuado. El ensayo de quinasa NAPPA es una plataforma de cribado y, como tal, los datos obtenidos deben validarse en ensayos de seguimiento, que pueden incluir ensayos de quinasa in vitro, o ensayos basados en células. Dado que nuestro protocolo comienza con el ADNC, cualquier mutación o variación de la quinasa se puede incorporar fácilmente en el microarray y estudiarse en un alto rendimiento.
Durante la preparación de la mezcla de resina de intercambio de aniones y placas, se recomienda el uso de máscaras para evitar la posible inhalación de las partículas de resina.
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