Name: Uso di celle Drosophila S2 per limaging live della divisione cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Impara a visualizzare in tempo reale la divisione cellulare nelle cellule S2 di Drosophila utilizzando proteine fluorescenti e microscopia time-lapse. Questo metodo consente di analizzare l'assemblaggio del fuso mitotico e la segregazione cromosomica.

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Questo lavoro è stato finanziato dai National Institutes of Health (R01 GM108756). Siamo grati a Gary Karpen (Università della California, Berkeley) per averci generosamente fornito un stock di linee cellulari GFP:CID S2 da cui è statageneratala nostra linea GFP:CID/mCherry:

1. Preparazione delle cellule S2 per il trattamento con RNAi
<ol><li>
Da una coltura stock di cellule s2 confluenti di pMT:GFP:CID e pMT:mCherry: z-tubulina stabilmente trasincate cellule S2 (-80% vitale; coltivate a 24-28 gradi C), le cellule di semi in una piastra di coltura di 6 well welle ad una densità di 1 x 106 cellule/mL in siero bovino fresco, riscaldato, 10% di bovine (FBS) integrato i supporti per insetti di Schneider (SIM). NOTA: le cellule S2 trascantate in modo stly possono essere generate seguendo un protocollo del DrSC https://dgrc.bio.indiana.edu/Protocols?tab=cells (DrSC) di Drosophila RNAi Anche se la specifica linea stabile S2 utilizzata nel presente documento utilizza GFP e mCherry, esistono numerose alternative sia all'interno di questi spettri fluorescenti che in altri. Una discussione dettagliata di queste proteine fluorescenti esula dall'ambito di questo protocollo, ma le loro proprietà e i potenziali vantaggi/svantaggi sono stati sapientemente rivisti altrove 11.<ol>
<li>Utilizzando un contatore cellulare o un emocitometro, determinare la densità dello stock di cellule confluenti.</li>
		<li>Determinare il volume di sospensione cellulare confluente necessario per ottenere 1 x 106 celle / mL in un volume totale di 4 mL (ad es., 4 x 106 celle totali). Aggiungere questo volume di stock di celle a un volume di SIM fresca per fare 4 mL / volume totale di pozzi. Determinare la densità dello stock di cellule (celle/mL) diluindo 100 l di cellule direttamente dal pallone di riserva con 100 L di supporti e contando questa diluizione 1:2 manualmente con un emocitometro o con un contatore di celle automatico, se disponibile. NOT:</</c7> Se si utilizzano cellule S2 non trattate stabilmente, può essere eseguito un effetto transitorio di trasfezione con tag fluorescenti (GFP, mCherry, ecc.) e un marcatore di DNA (CENP-A, Histone H2B, ecc.) e un marcatore di DNA (CENP-A, Histone H2B, ecc.). Inoltre, linee cellulari opportunamente trascate con vari spindle mitotico e marcatori di DNA sono disponibili presso il Drosophila Genetics Resource Center che può meglio soddisfare le esigenze sperimentali esatte dell'utente (https://dgrc.bio.indiana.edu/cells/Catalog).</li>
		<li>Collocare le cellule appena semiate in un'incubatrice a 24-28 gradi centigradi per 36-48 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Trattamento delle cellule di semi con dsRNA contro i geni di interesse
 NOT:</</c0> L'esempio seguente e la sezione Results useranno Shortstop (Shot), un agente che collega l'atto-microtubulo come gene di interesse. Utilizzare un trattamento fittizio senza dsRNA o con dsRNA diretto contro un gene irrilevante (ad esempio, beta-galactosidase, lacà) come controllo negativo.
<ol><li>I mezzi di insetto di Warm Schneider non integrati con FBS (Sirum free media; in cubatrice 24-28 gradi centigradi.</li>
	<li>
Trasferire le cellule dal pozzo precedentemente seminato (dal punto 1.1.2) in un tubo sterile da 15 mL, notando il volume totale delle cellule trasferite.
	<ol>
<li>Conservare un piccolo volume di celle (100 dollari l) per il conteggio in un contatore di cellule o in un emocitometro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pellere delicatamente le cellule centrifugondo a 1.000 x g per 3 min a temperatura ambiente.<ol>
<li>Durante la centrifugatura delle cellule, determinare la concentrazione di cellule per mL utilizzando un contatore cellulare o un emocitometro. Moltiplicare questo numero per il volume totale centrifugato (notato in 1.2.2.) per ottenere il numero totale di cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirare il supernatale dalle cellule pellete.</li>
	<li>
Sospendere nuovamente le cellule nella SFM riscaldata per ottenere una concentrazione di 3 x 106 cellule/mL.
	<ol>
<li>Trasferire 1 mL delle celle risospese in un nuovo pozzo in un pozzo 6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungete 10-50 g di dsRNA (diluito in 100 gradi di acqua senza RNAase) contro Shot (o il gene bersaglio di interesse) direttamente alle cellule e girano la piastra per mescolare. Incubano la piastra per 1 h nell'incubatrice a 24-28 gradi per consentire l'assorbimento diretto del dsRNA nelle cellule.</li>
	<li>Durante l'incubazione di 1 h, riscaldare la SIM integrata 10% FBS nell'incubatrice 24-28 gradi centigradi.</li>
	<li>Dopo aver incubato cellule con dsRNA per 1 h, aggiungere 2 mL di 10 % FBS integrato SIM direttamente al pozzo senza rimuovere il 1 mL di supporto.</li>
	<li>Collocare le cellule in incubatrice a 24-28 gradi centigradi per 3-7 giorni. NOT:</</c7> Come per la concentrazione di dsRNA, potrebbe essere necessario ottimizzare il tempo totale del trattamento per il gene bersaglio desiderato. Per valutare l'efficacia dell'RNAi, eseguire una macchia occidentale sull'intero lisato cellulare utilizzando un anticorpo contro il gene bersaglio. Se la sequenza di destinazione iniziale del dsRNA si rivela inefficace, progettare dsRNA alternativi mirati a sequenze uniche all'interno del gene bersaglio.</li>
</ol>3. Induzione dell'espressione proteica fluorescente e preparazione delle cellule per l'imaging
<ol><li>Se cellule trattate stabilmente sono state generate utilizzando il plasmide pMT (contenente un inducibile metallothionein promotor) come descritto qui, indurre l'espressione di proteine fluorescenti trattando le cellule con solfato di rame (CuSO4) ad una concentrazione finale di 500 M per 24-36 h prima dell'imaging e 4 giorni dopo il trattamento dell'RNAi. L'uso di plasmidi di espressione coniugale come pAct non richiede l'induzione del rame.</li>
	<li>
Preparare le celle per l'imaging
	<ol>
<li>Riscaldare la SIM integrata fBS al 10% nell'incubatrice 24-28 gradi centigradi per 1 h.</li>
		<li>Trasferire le cellule in un tubo sterile da 15 mL, notando il volume totale delle cellule trasferite.<ol>
<li>Conservare un piccolo volume di celle (100 dollari l) per il conteggio in un contatore di cellule o in un emocitometro.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pellere delicatamente le cellule centrifugondo a 1.000 x g per 3 min a temperatura ambiente.<ol>
<li>Durante la centrifugatura delle cellule, determinare la concentrazione (cellule/mL) utilizzando un contatore cellulare o un emocitometro. Moltiplicare questo numero per il volume totale centrifugato (notato in 2.2.2.) per ottenere il numero totale di cellule.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aspirare il supernatale dalle cellule pellete.</li>
		<li>Risospendere le cellule in fresco, riscaldato 10% FBS integrato SIM per ottenere una concentrazione di 2 x 106 cellule / mL. Aggiungere una quantità appropriata di CuSO4 per mantenere una concentrazione di 500 M.</li>
		<li>Trasferire 200-500 l di cellule ri-sospese in un pozzo di una camera a cellule vive multi-bene e posizionarle al microscopio fluorescente invertito. Lasciare che le cellule si stabilizzino nella camera per 15-30 minuti prima degli esperimenti di imaging. NOT:</</c8> I pozzi della camera a cellule vive possono essere prerivestiti con poli-L-lisina per un'ulteriore aderenza.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Impostare un programma Live Cell Imaging
 NOT:</</c0> Live Cell Imaging in questo esperimento è stato eseguito utilizzando un sistema di imaging invertito e il relativo software (ad esempio, Olympus IX83 con il pacchetto software cellSens Dimensions). I dettagli saranno diversi dal produttore del microscopio e dal pacchetto software; pertanto, le linee guida e le operazioni generali sono elencate di seguito.
<ol><li>
Utilizzando il software che esegue il microscopio fluorescente invertito, preparare un programma per l'imaging di una cellula (o cellule) nel tempo.
	<ol>
<li>Aprire il software facendo doppio clic sull'icona del desktop del software.</li>
		<li>Creare un nuovo file sperimentale facendo clic su File, quindi su Nuovo filesperimentale .</li>
		<li>In primo luogo, inserire un ciclo di time lapse su cui verranno scattate le immagini. A tale scopo, fare clic sull'icona Del cronometro (iconaLoop Time-lapse) dalla barra delle icone. Impostare l'intervallo in s nella scheda Gestione esperimenti, quindi impostare il numero di cicli nella stessa scheda dividendo la lunghezza complessiva dell'esperimento desiderata (in s) per l'intervallo. Lasciare che il ciclo si ripeta nel periodo di tempo totale desiderato. NOT:</</c7> Tipicamente, le immagini vengono scattate ogni 30-60 s in un periodo di 3-4 h.</li>
		<li>All'interno del livello del ciclo di intervallo di tempo, inserire un controllo di messa a fuoco a infrarossi per mantenere la messa a fuoco dell'obiettivo (se disponibile). A tale scopo, aggiungere un passaggio di compensazione di z-drift (DC) all'interno del livello Ciclo Time-lapse facendo clic sull'icona Quadrato con due frecce (Sposta XY icona) e selezionando Compensazione di deriva da z dal menu a discesa. NOT:</</c10> Il termine controllo di messa a fuoco a infrarossi si riferisce a un sistema mediante il quale un impulso infrarosso viene utilizzato per mantenere una distanza costante tra l'obiettivo e la camera di scorrimento /imaging. Molti microscopi hanno un tale sistema, ognuno con la propria nomenclatura proprietaria. I lettori devono consultare il manuale operativo o il rappresentante per informazioni di denominazione specifiche.</li>
		<li>Dopo il controllo della messa a fuoco a infrarossi, aggiungere un passaggio nel programma per eseguire un'immagine multicanale (ad esempio, FITC per GFP e TRITC per mCherry) su un 3-5 z-stack inserendo prima un passo dello stack z, quindi specificando il canale. A tale scopo, aggiungere un livello Gruppo multicanale all'interno del livello loop Time-lapse facendo clic sull'icona Ruota colore (iconaGruppo multicanale). Successivamente, aggiungere un livello Loop di stack z all'interno del livello Gruppo multicanale facendo clic sull'icona a 3 livelli (icona Loopstack z). Impostare le dimensioni del passo e il numero di sezioni desiderate nella scheda Gestione esperimenti e impostare l'esposizione di ogni canale il più basso possibile per ridurre al minimo il fotosbiancamento. NOT:</</c16> L'intervallo z-stack, il tempo di esposizione e la percentuale di trasmissione per i LED possono variare. Tipico in questi esperimenti, utilizzare tre z-stack assunti su un intervallo di 3 m, dando un intervallo di 1 m tra ogni pila. Definire il centro della cella piuttosto che la parte superiore e inferiore tende a portare ai migliori risultati. Le immagini vengono quindi raccolte per ogni canale a un'esposizione di 50 ms e una percentuale di trasmissione del 50% senza filtro a densità neutra (ND).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Immagine dividendo le celle utilizzando il programma di imaging delle celle dal vivo
 NOT:</</c0> Le cellule S2 non richiedono CO2 e crescono in modo ottimale a 23-27 gradi centigradi. Tutte le immagini sono state eseguite a temperatura ambiente in una stanza ben controllata.
<ol><li>Utilizzando l'oculare, trovare l'angolo superiore (o inferiore) del pozzo e mettere a fuoco l'obiettivo (40-60x immersione dell'olio) sulle cellule utilizzando il canale mCherry (z-tubulin).</li>
	<li>Eseguire la scansione lungo la parte superiore (o inferiore) del pozzo per allontanarsi dal divisore del pozzo verticale. NOT:</</c0> L'imaging troppo vicino ai divisori di pozzo può interferire con i controlli di messa a fuoco infrarossi.</li>
	<li>Trovare una cella (o cellule) che si trovano nella fase M2 o nella fase M iniziale. NOT:</</c1> Queste cellule possono essere meglio identificate con l'esistenza di esattamente due strutture di microtubuli "stella-like" (centrisomi) e un nucleo intatto (indicato da una regione circolare di luce rifratta all'interno della cellula), entrambe facilmente distinguibili usando la z-tubulina (rosso) filtro di eccitazione. La selezione delle cellule nella precedente interfase, notevole da uno o zero centrosoni facilmente visibili, può causare uno spredamenti di tempo a causa di un ritardo nella progressione G2/M. Al contrario, la selezione delle cellule dopo il NEBD impedirà un calcolo accurato della temporizzazione mitotica e l'imaging dell'assemblaggio precoce del mandrino e delle dinamiche cromosomiche. Inoltre, le cellule S2 spesso contengono >2 centrosomi. Anche se questi tipicamente cluster in un mandrino bipolare12, si consiglia agli utenti di evitare queste cellule se non diversamente voluto per la progettazione sperimentale. Le immagini e la discussione delle celle appropriate da selezionare sono disponibili nella sezione Risultati rappresentativi.</li>
	<li>Fate clic sul pulsante Vista Dal vivo per iniziare a visualizzare le celle nella schermata del software. Utilizzando la manopola di messa a fuoco fine del microscopio, mettere a fuoco la cellula (o le cellule) di interesse. Impostare il controllo della messa a fuoco a infrarossi facendo clic sul pulsante Imposta messa a fuoco.</li>
	<li>Avviare il programma di imaging time lapse facendo clic sul pulsante Start. Regolare gli istogrammi in base alle esigenze selezionando il canale desiderato e regolando l'intensità media dei pixel per vedere chiaramente la cella (o le celle) di interesse.</li>
	<li>Consentire l'esecuzione del programma, controllando la cella dopo 15-20 min per garantire che si sia verificata la rottura dell'involucro nucleare (NEBD), che è determinata dalla scomparsa del buio rotondo, un punto rifratto vicino al centro della cella.</li>
	<li>Continuare a consentire l'esecuzione del programma, controllando in modo intermittente (ogni 15-20 min) per determinare una volta che si è verificato l'insorgenza dell'anafase. Arrestare il programma a questo punto se c'è più tempo rimanente nel periodo di tempo totale e salvare il file. In alternativa, se gli eventi durante la telofase e la citochina sono di interesse, consentire al programma di eseguire un tempo sufficiente per visualizzare anche questi processi.</li>
	<li>
Eseguire l'analisi del NEBD alla temporizzazione dell'esordio anaphase notando il tempo di NEBD (tNEBD) in min e il tempo di separazione cromosomica iniziale (tanaphase insorgenza) in min e sottraendo tNEBD dall'insorgenza di tanaphase per ottenere NEBD all'anaphase tempo di insorgenza per una determinata cella.
	<ol>
<li>A tale scopo, fare clic sul pulsante fotogramma e annotare i fotogrammi in cui si verificano l'insorgenza di NEBD e anaphase, sottraendoli per determinare il numero totale di fotogrammi di scaduta e moltiplicandolo per l'intervallo di tempo tra i fotogrammi di imaging.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Continuare la scansione per le celle di pre-divisione per ottenere più n per una determinata condizione. Le cellule possono essere immagini nel pozzo della camera della cella animata fino a 12 h dopo il loro assestamento iniziale.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Identificazione di una cella appropriata
La chiave per l'imaging che divide le cellule S2 è prima individuare la cellula corretta. Il tempo può essere sprecato in celle di imaging che sono erroneamente ritenute pronte a dividersi, ma che non riescono a farlo in un lasso di tempo ragionevole. Devono essere identificate cellule che abbiano due centrisomi distinti e visibili e un nucleo intatto. I centrosori devono avere fibre di microtubuli che emanano da loro, dando loro un aspetto "stellato". Un nucleo intatto rifrange la luce quando regola la messa a fuoco, e rende anche il centro approssimativo della cellula più scuro nell'aspetto. Il nucleo conterrà anche il GFP:CID "punti", un'altra caratteristica distintiva per aiutare nella sua identificazione. Le cellule con >2 centrosomi, puncta di tubulina senza fibre di tubulina emananti da loro, o le cellule con un solo centrosome dovrebbe essere evitato. Inoltre, se due centrosoni sono visibili, ma un nucleo non lo è, NEBD si è già verificato e la cellula è troppo avanzata nella sua divisione per essere immaginata se si desidera un'analisi completa della fase M. Una volta trovata una cella appropriata, la velocità di avvio dell'imaging è fondamentale in quanto il NEBD si verifica rapidamente (in genere entro 3-5 min) e ritardare l'inizio dell'imaging può portare a opportunità perse. Concentrare rapidamente la cella nel software di imaging in modo che entrambi i centrisomi siano visibili, o se i centrisomi sono fuori piano tra loro, impostare il punto focale tra i due, in modo che ciascuno possa essere catturato quando vengono raccolti gli stack di z sopra e sotto il centro definito punto. Una volta messa a fuoco, impostare immediatamente l'offset tra lo stadio e la superficie della camera della camera della cella attiva utilizzando il controllo della messa a fuoco a infrarossi (se disponibile) e iniziare il programma di imaging. Anche se il protocollo qui presentato è specificamente su misura per gli esperimenti che valutano le dinamiche NEBD-anaphase, semplici modifiche potrebbero soddisfare i lettori che studiano eventi mitotici alternativi. Per l'imaging da NEBD a metafase e da anaphase a telofase, suggeriamo intervalli di acquisizione delle immagini di 10 s poiché questi processi sono altamente dinamici e si verificano rapidamente nelle celle S2 (5-10 min). La transizione metafase-anafase (il nostro tipico obiettivo sperimentale) è un processo più lungo (20-30 min) nelle cellule S2 e raccogliamo immagini a intervalli di 30 s. Infine, la telophase-through-cytocinesisi si verifica abbastanza lentamente nelle cellule S2, e suggeriamo intervalli 60 s fornendo una risoluzione sufficiente per questo processo approssimativo della durata di un'ora.
Mantenere la messa a fuoco durante tutto il programma di imaging
Se non è disponibile un dispositivo di controllo della messa a fuoco a infrarossi, assicurarsi di evitare di urtare il microscopio o la tabella su cui si trova, in quanto ciò può causare lo spostamento della cella fuori fuoco durante il programma di imaging, portando a risultati ambigui e non interpretabili. Pre-rivestimento dei pozzi camera cellulare dal vivo con Poly-L-lysina può aiutare nell'aderenza cellulare, che può aiutare a evitare il movimento cellulare ed è particolarmente utile per le configurazioni senza controlli di messa a fuoco infrarossi. Inoltre, le configurazioni, tra cui piattaforme antiurto o tavoli d'aria, possono ulteriormente aiutare a evitare che le cellule si muovano fuori fuoco. Infine, alcuni programmi software hanno funzioni di pausa che consentono all'utente di rifocalizzare e riprendere il programma.
Imaging di più celle
Utile per l'accumulo di dati è che spesso più celle pronte per la divisione possono essere collocate all'interno dello stesso campo visivo per l'imaging. Ciò può essere particolarmente utile per gli esperimenti in cui le cellule hanno lunghe durate di fase M o un arresto prolungato (ad esempio, condizioni che inducono l'attivazione del SAC). Per queste cellule, in genere immaginiamo fino a quando le cellule sono fotosbiancate (circa 2-3 h), ma la tempistica completa delle cellule arrestate dovrebbe essere a discrezione del ricercatore. A volte le più celle di pre-divisione possono trovarsi in piani focali diversi, nel qual caso può essere utile aggiungere z-stack per ospitare tutte le celle. L'aggiunta di più stack z può anche aiutare a migliorare la risoluzione. Attenzione dovrebbe essere presa nel fare questo, tuttavia, in quanto esporrà le cellule a più radiazioni e porterà a una fotosbiancatura più veloce, così come portare a grandi dimensioni di file su dispositivi di archiviazione del disco rigido.
Evitare il fotobleaching e la fototossicità
Il nostro metodo descrive impostazioni specifiche per i tempi di esposizione, gli intervalli di imaging, le pile z e la trasmissione percentuale per la nostra sorgente luminosa a LED che generalmente funzionano per la nostra configurazione sperimentale e i risultati desiderati. Poiché i microscopi e gli obiettivi sperimentali possono variare, ciò che potrebbe funzionare bene per il nostro sistema può portare a fotosbiancamento prematuro o fototossicità in altri. I danni fotografici possono presentare una mancanza di movimento del mandrino, la frammentazione dei microtubuli, la dinamica difettosa dei microtubuli e l'attivazione prolungata del checkpoint del mandrino. Un metodo potenziale per evitare tali insidie è quello di limitare il tempo di esposizione. La maggior parte delle telecamere moderne ora possiede ampie gamme dinamiche e gli istogrammi possono essere regolati per visualizzare le strutture anche a esposizioni molto basse. Un'altra tecnica consiste nell'aumentare l'intervallo di imaging (ad esempio, a diversi minuti tra le immagini) in modo che il numero di volte in cui una cella viene esposta alla luce in un intervallo di raccolta totale viene ridotto. Questo è vantaggioso in particolare nell'imaging per periodi di tempo più lunghi (molte ore) e può anche aiutare a ridurre le dimensioni del file di tali esperimenti. Limitare il numero di pile z prese può anche aiutare a ridurre l'esposizione alla luce, utilizzando 2 o anche solo 1 invece di 3. Inoltre, regolare la percentuale di trasmissione della luce (per le sorgenti luminose a LED) o utilizzare filtri a densità neutra (ND) (sia per la lampada Halogen che per le sorgenti luminose a LED) diminuirà l'intensità della luce e accoppiato con tempi di esposizione più lunghi può preservare la visibilità . Scegliendo cellule con centrisomi già separati, l'esposizione complessiva può essere limitata in quanto queste cellule di solito entrano nella mitosi rapidamente (entro un minuto o due) dopo l'inizio dell'imaging. Si può anche limitare il tempo che le cellule possono essere immagini prima di NEBD. Il nostro laboratorio in genere imposta questa volta a 10 min, ma un limite più conservativo può essere facilmente imposto dall'utente. Inoltre, una misura più "invasiva" che raccomandiamo è il trattamento con dsRNA mirato contro un componente del SAC (come Rod o Mad2). Se un fenotipo dell'arresto è dovuto a danni cellulari non specifici (ad esempio, dinamiche di microtubuli difettose), tale trattamento è meno probabile che sopprimere l'arresto rispetto a un effetto in buona fede del gene di interesse nell'esperimento originale.
Indicazioni future
Il metodo qui descritto può essere utilizzato in un microscopio epifluorescente relativamente semplice per creare rapidamente un'immagine delle divisioni di cellule vive e può essere facilmente adattato per adattarsi alla progettazione e agli obiettivi sperimentali specifici di un ricercatore. Sono stati pubblicati diversi metodi eccellenti per la coltura, gli approcci di abbattimento dell'RNAi, la trasfezione transitoria e la microscopia a fluorescenza per S2 e altre cellule di Drosophila 9,14,15, 16 , 17. Il nostro protocollo offre un paio di vantaggi. (1) L'uso di una doppia linea cellulare stabile (GFP:CID, mCherry:z-Tubulin) segna contemporaneamente due strutture mitotiche chiave, evita il fastidio e le potenziali complicazioni della trasparenza transitoria e assicura che quasi tutte le cellule esprimano marcatori fluorescenti come potenziali candidati per l'imaging. (2) L'adattamento alla mitosi si aggiunge ai protocolli pubblicati che esaminano le dinamiche citoscheletriche nelle cellule motili e non dividende e si estende all'esame degli eventi mitotici in tempo reale. Mentre crediamo che la nostra sia una tecnica potente che si aggiunge al repertorio degli altri, ci possono sempre essere miglioramenti fatti. Una particolare area della divisione cellulare che abbiamo trovato difficile da immaginare è la divisione centrosome. Ciò si verifica prima del NEBD ed è difficile determinare quando un singolo centrosome è pronto a separarsi in due. L'utilizzo di marcatori fluorescenti del ciclo cellulare (Cyclin A e Cyclin B) potrebbe aiutare a risolvere questo problema, ma viene a scapito dei canali che potrebbero essere utilizzati per visualizzare i componenti della divisione cellulare. La nostra migliore strategia per tentare di visualizzare la divisione centrosome è quella di aggiungere l'acquisizione multipunto al programma di imaging (definendo diversi punti nel piano XY per l'immagine), ma questo può comportare file di grandi dimensioni e può anche richiedere (a seconda del numero di punti) aumentando l'intervallo tra la raccolta di immagini, riducendo la risoluzione del tempo del filmato risultante. Un'altra soluzione potrebbe essere la sincronizzazione delle cellule in una fase del ciclo cellulare desiderato utilizzando farmaci che prendono di mira i regolatori del ciclo cellulare seguiti da un successivo lavaggio prima dell'imaging, anche se questi metodi potrebbero non essere affidabili nelle cellule S2 in modo specifico.
Il protocollo qui presentato fornisce una base per le future applicazioni anche nell'imaging delle cellule vive. Grazie a una migliore tecnologia di imaging e software, potrebbero essere possibili adattamenti di velocità effettiva veramente elevati di questo protocollo utilizzando una capacità più elevata, le piastre multicamera. Tali innovazioni renderebbero gli schermi RNAi su larga scala, come quelli già realizzati nei preparati fissi12,18, più trattabili in un formato di cella dal vivo. Anche schermi di farmaci di piccole molecole potrebbero essere concepiti come un mezzo per identificare nuovi composti mirati ai processi di divisione cellulare. Il miglioramento dei fluorofori e dei filtri ottici potrebbe anche portare all'imaging di più componenti mitotici (non solo dei due che descriviamo), consentendo l'imaging di specifici regolatori mitotici e le loro interazioni con il DNA e/o il mandrino. Ad esempio, generare cellule con reporter fluorescenti che esprimono in seguito al danno del DNA o durante l'apoptosi sarebbero strumenti utili per identificare nuovi geni coinvolti in questi processi. Approcci simili potrebbero essere utilizzati per esaminare le dinamiche del ciclo cellulare utilizzando l'espressione di cicline fluorescenti19.

La Divisione Cellulare è un processo critico per tutti gli organismi multicellulari, sia nel loro sviluppo che nell'omeostasi1. La Drosophila è stata a lungo utilizzata come modello per lo studio della divisione cellulare, con esperimenti in vari tipi di tessuto e condizioni genetiche che forniscono informazioni chiave sul processo. Mentre molte di queste intuizioni provengono da condizioni cellulari fisse, la divisione cellulare è una procedura dinamica con molte parti in movimento, rendendo la visualizzazione delle cellule vive integrale alla valutazione degli effetti di RNAi o di knockout genetico su numerose parti della divisione cellulare, tra cui formazione di mandrini, congresso cromosomico e segregazione, e citocinesi.
Molti protocolli sono stati sviluppati e utilizzati nel corso degli anni per visualizzare le divisioni cellulari della Drosophila in vivo. Vari gruppi hanno coltivato tecniche per l'immagine divisioni in entrambi i dischi larvali e cervelli larvali2,3,4,5,6,7,8 . Queste tecniche, sebbene utili per l'imaging in tessuti specifici, sono limitate nella produttività e spesso richiedono la generazione e il mantenimento di scorte genetiche per generare componenti fluorescenti e alterare l'espressione di geni di interesse. Le cellule S2 coltivate della Drosophila forniscono un'alternativa più elevata alla produttività per testare rapidamente gli effetti di vari geni nella divisione cellulare. Inoltre, con la capacità di trasfecare varie proteine fluorescenti, le cellule S2 possono essere rapidamente modificate per determinare gli effetti del knockdown RNAi su numerosi componenti della divisione cellulare. I geni fluorescenti di interesse possono essere osservati anche nella divisione cellulare, consentendo una caratterizzazione dinamica della loro funzione9.
Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'imaging dal vivo delle cellule Mitotiche S2 utilizzando metodi che abbiamo recentemente descritto10. Il nostro metodo utilizza cellule trascate stabilmente con marcatori fluorescenti per microtubuli e centrimeri la cui espressione è sotto il controllo di un promotore inducibile di rame (metallothionein; pMT). Questa metodologia può essere utilizzata per immagini dinamiche del mandrino e del cromosoma in tutte le fasi della mitosi utilizzando un microscopio fluorescente relativamente semplice con un software di imaging di base. Può essere ulteriormente personalizzato per soddisfare le esigenze di ricerca individuali, con la trasfezione transitoria e l'RNAi che offre possibilità ampliate per determinare il ruolo dei geni candidati nella mitosi. A causa della relativa semplicità del protocollo, può essere utilizzato per schermi di perdita di funzione su piccola scala per identificare i geni per i quali sarebbe utile un ulteriore studio in vivo, consentendo sforzi e efficienza più mirati con i successivi manipolazione nelle mosche.

<table><tbody><tr><td>Ematocitometro Bright-Line</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td>per conteggio cellulare</td></tr><tr><td>software di imaging cellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Pallone per colture cellulari, 50 mL, 25 CM2, PS, filtro rosso Tappo a vite, trasparente, sterile, 10 pz/sacchetto</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Piastra multipozzetto per colture cellulari, 6 pozzetti, PS, trasparente, TC, coperchio con anelli di condensazione, sterile, confezione singola</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>eppendorf</td><td>Cat. 022623508</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di rame(II) pentaidrato, minimo 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3036-250G</td><td></td></tr><tr><td>Corning Siero fetale bovino</td> Fisher <td>Scientific</td><td>MT35015CV</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per trasfezione Effectene 1 mL</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>per trasfezione transitoria</td></tr><tr><td>IX-83 Microscopio a epifluorescenza invertita</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabTek Inserto per vetrini camerati</td><td>Applied Scientific Instruments</td><td>I-3016</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione MEGAscript T7</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1334</td><td>Per la produzione di dsRNA</td></tr><tr><td>MOXI Z Mini kit contatore di cellule automatizzato</td><td>ORFLO</td><td>MXZ001</td><td>per il conteggio</td></tr> <tr><td>delle celluleMS-2000 XY Flat-Top Automated Stage e controller</td><td>Strumenti scientifici</td><td></td><td></td>applicati</tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Coverglass a camera (senza vetro borosilicato da 1,5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td><td></td>a 8 pozzetti</tr><tr><td>Fotocamera Orca-Flash 4.0 LT</td><td>Hammamatsu Photonics K.K.</td><td>C11440-42U</td><td></td></tr><tr><td>pMT/V5-His Vettore di espressione A Drosophila</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>V412020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Purificatore Logic+ Classe II, Tipo A2 Armadi di biosicurezza</td><td>Labconco</td><td>302310000</td><td></td></tr><tr><td>Medium per insetti di Schneider</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Tub Provette per centrifuga</td><td>VWR</td><td>470224-998</td><td></td></tr><tr><td>Uner Counter BOD Incubator</td><td>Sheldon manufacturing (VWR)</td><td>89409-346</td><td></td></tr><tr><td>X-CITE 120 LED</td><td>ExcelitasTechnologies</td><td></td><td>Sorgente luminosa a led</td></tr><tr><td>Z -Drift Compensator (ZDC)</td>Controllo <td>della messa a fuoco a infrarossi</td> <td>Olympus</td><td></td></tr></tbody></table>

uso di celle drosophila s2 per l'imaging live della divisione cellulare

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila Le cellule S2 sono uno strumento importante nello studio della mitosi nella coltura tissutale, fornendo informazioni molecolari su questo processo cellulare fondamentale in modo rapido e ad alta produttività. Le cellule S2 si sono dimostrate suscettibili sia alle applicazioni di imaging a cellule fisse che a quella con cellule vive. In particolare, l'imaging a cellule vive può fornire informazioni preziose su come la perdita o l'abbattimento di un gene può influenzare la cinetica e la dinamica degli eventi chiave durante la divisione cellulare, tra cui l'assemblaggio del mandrino mitotico, il congresso cromosomico e la segregazione, nonché temporizzazione complessiva del ciclo cellulare. Qui utilizziamo le cellule S2 trattate stabilmente con mCherry: z-tubulina fluorescente per contrassegnare il mandrino mitotico e GFP:CENP-A (chiamato gene 'CID' in Drosophila) per contrassegnare il centromero per analizzare gli effetti dei geni mitotici chiave sulla tempistica di divisioni cellulari, dalla profase (in particolare a Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) all'inizio dell'anafase. Questo protocollo di imaging consente anche la visualizzazione del microtubulo del mandrino e delle dinamiche cromosomiche in tutta la mitosi. Qui, ci proponiamo di fornire un protocollo semplice ma completo che permetterà ai lettori di adattare facilmente le celle S2 per esperimenti di imaging dal vivo. I risultati ottenuti da tali esperimenti dovrebbero ampliare la nostra comprensione dei geni coinvolti nella divisione cellulare definendo il loro ruolo in diversi eventi simultanei e dinamici. Le osservazioni fatte in questo sistema di coltura cellulare possono essere convalidate e ulteriormente studiate in vivo utilizzando l'impressionante toolkit di approcci genetici nei moscerini.

I metodi che descriviamo sopra porteranno all'identificazione e all'imaging delle cellule della Drosophila S2 sottoposte a divisione cellulare. Le cellule che stanno per dividersi (cioè, poco prima di entrare nella fase M) possono essere prese di mira dalla presenza di due centrisomi e da un nucleo intatto indicato dalla luce rifratta e da un punto più scuro all'interno della cella quando vengono visualizzati nel canale z-tubulina (Figura 1, pannelli più a sinistra, canale rosso; freccia nella figura 1A). Stimiamo che circa il 2-5% delle cellule rientri in questa categoria, e tra esperimenti di imaging, di solito passiamo un massimo di 2-3 minuti a scansionare per un'altra cella qualificata. NEBD può essere visualizzato attraverso la scomparsa di questa macchia scura, con conseguente colorazione uniforme del citoplasma (Figura 1, pannelli contrassegnati "00:00", rosso). Dopo la NEBD, il tempo che ogni cellula impiega per formare il mandrino, i cromosomi congressuali e separare i cromosomi può essere misurato semplicemente notando i punti temporali di questi eventi rispetto al NEBD.
Utilizziamo queste divisioni per valutare la tempistica mitotica, in particolare di NEBD per l'insorgenza dell'anaphase, notando il punto in cui i cromosomi iniziano a separarsi. La maggioranza (90%) di cellule indotte dal rame, espresse sia mCherry:z-tubulina che GFP:CID. Una piccola percentuale di celle (10%) espresso solo un marcatore o nessuno dei due. Queste cellule sono state evitate durante la selezione delle cellule. In genere, le celle S2 visualizzano NEBD per anaphase insorgenza di tempi compresi tra 20-30 minuti (Figura1A, Controllo). Successivamente abbiamo trattato le cellule con dsRNA mirate contro Shortstop (Shot), una proteina che collega l'atto-microtubulo che sospettavamo possa influenzare la dinamica del ciclo cellulare. Infatti, a seguito di cellule a seguito di Shot knockdown cellule hanno mostrato un significativo ritardo mitotico (Figura 1B, ShotRNAi ritardo), con molte cellule arresto in metafase e mai la transizione ad anaphase durante l'intero esperimento di imaging 2-3 ore (Figura 1D, Arresto di ShotRNAi). Abbiamo motivato questo fenotipo di ritardo/arresto potrebbe essere probabilmente dovuto all'attivazione del checkpoint di assemblaggio del mandrino (cioè il checkpoint della fase M). Per testare direttamente questa ipotesi, abbiamo co-trattato le cellule con dsRNA contro Colpo e Rough deal (Rod), una componente importante di questo checkpoint13. Ciò ha portato a una soppressione del fenotipo di arresto, con conseguente NEBD a tempi di anaphase simili al controllo (Figura 1C, ShotRNAi-RodRNAi). Così, questo protocollo di imaging dal vivo ci ha permesso di concludere che Shot è necessario per la progressione tempestiva della fase M e che la sua perdita porta all'attivazione del checkpoint che ritarda o arresta le cellule mitotiche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60049/60049fig01.jpg"> Figura 1: l'imaging dinamico dinamico rivela i difetti del ciclo cellulare dovuti all'attivazione del checkpoint mitotico nelle celle S2. In tutte le condizioni, l'imaging a cellule vive è stato condotto su cellule S2 co-trascate stabilmente con GFP:CID inducibile e mCherry: (A) I cartoni animati illustrano importanti punti di riferimento durante la mitosi, e le immagini corrispondenti sono mostrate da filmati rappresentativi di genotipi indicati con punti temporali relativi a NEBD (t-00:00) indicati. Le celle di controllo in genere avanzano verso l'anafase entro 20-30 min. Le cellule trattate con ShotRNAi mostrano un ritardo NEBD-anaphase (B) e spesso subiscono l'arresto della metafase, senza mai entrare in anaphase all'interno dell'esperimento di imaging (D). Il co-trattamento delle cellule con ShotRNAi e RodRNAi, un componente del checkpoint di assemblaggio del mandrino, sopprime il fenotipo Shot che porta alla cinetica ad esordio anaphase simile alle cellule di controllo (C). Le frecce in (A) indicano le strutture centrosomere 'stella-like' e la grande punta della freccia indica il nucleo. Ogni barra della scala rappresenta 5 micron. Questa cifra viene adattata e ripubblicata con il permesso di10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60049/60049fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Video 1: Filmato time-lapse della divisione cellulare S2 di controllo. Il video mostra un filmrappresentativo della divisione cellulare S2 nel genotipo 'Controllo'. Questo filmato corrisponde alla figura 1A. Questo video è adattato e ripubblicato con il permesso da10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60049/Dewey_2019_JoVE_Video_1_(Control).mov" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Video 2: Filmato time-lapse della divisione cellulare S2 ritardata 'ShotRNAi'. Il video mostra un film rappresentativo della divisione cellulare S2 nel genotipo 'ShotRNAi' che porta a un ritardo mitotico fenotipica. Questo filmato corrisponde alla figura 1B. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60049/Dewey_2019_JoVE_Video_2_(ShotDelay).mov" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Video 3: Film time-lapse della divisione cellulare S2 'ShotRNAi'RodRNAi'. Il video mostra un film rappresentativo della divisione cellulare S2 nel genotipo 'ShotRNAi'RodRNAi'. Questo filmato corrisponde alla figura 1C. Questo video è adattato e ripubblicato con il permesso da10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60049/Dewey_2019_JoVE_Video_3_(ShotRod).mov" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Video 4: Film time-lapse della divisione cellulare S2 arrestata 'ShotRNAi'. Il video mostra un film rappresentativo della divisione cellulare S2 nel genotipo 'ShotRNAi' che porta ad un arresto mitotico fenotipica. Questo filmato corrisponde alla figura 1D. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60049/Dewey_2019_JoVE_Video_4_(ShotArrest).mov" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>

Le divisioni cellulari possono essere visualizzate in tempo reale utilizzando proteine fluorescenti e microscopia time-lapse. Utilizzando il protocollo qui presentato, gli utenti possono analizzare le dinamiche di temporizzazione della divisione cellulare, l'assemblaggio del mandrino mitotico e il congresso cromosomico e la segregazione. I difetti in questi eventi a seguito del knockdown genico mediato dall'RNA (RNAi) possono essere valutati e quantificati.

Uso di celle Drosophila S2 per l'imaging live della divisione cellulare

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Il nostro protocollo può essere utilizzato per determinare eventi dinamici spaziali e temporali durante la mitosi e può anche essere utilizzato per visualizzare gli effetti dei regolatori miotici in tempo reale. L'uso dell'imaging a doppio colore consente un'analisi simultanea di due marcatori molecolari. Ad esempio, possiamo visualizzare i microtubuli del mandrino miotico e la struttura cinetica del nucleo dei cromosomi replicati.Per indurre l'espressione proteica fluorescente, quattro giorni dopo il trattamento di interferenza dell'RNA, esporre le cellule trasfette inducibili del promotore metallo-tianina a una concentrazione finale di 500 solfati di rame micromolare per 24-36 ore. Per preparare la proteina fluorescente che esprime le cellule per l'imaging, trasferire le cellule in un tubo sterile da 15 millilitri e, dopo aver contato, sedimentare le cellule mediante centrifugazione. Rimescolare il pellet in SIM riscaldata fresca di 25 gradi Celsius, integrata con 10%FBS, a una concentrazione di rame due volte 10 a 6 celle per millilitro, e trattare le cellule con ulteriore solfato di rame micromolare 500.Quindi aggiungere da 200 a 500 microlitri di cellule a un pozzo di una camera cellulare multi-ben vivo, e posizionare la camera su uno stadio di microscopio fluorescente invertito. Mentre le cellule si sistemano nella camera, apri il software di imaging delle cellule dal vivo e fai clic su nuovo e sperimenta. Per inserire un ciclo time lapse su cui verranno scattate le immagini, fare clic sull'icona del ciclo time lapse.Impostare l'intervallo su secondi e dividere la durata complessiva dell'esperimento desiderata in secondi per l'intervallo per impostare il numero di cicli. Lasciare che il ciclo si ripeta nel periodo di tempo totale desiderato. Per inserire un controllo dello stato attivo a infrarossi per mantenere lo stato attivo dell'obiettivo, fate clic sull'icona sposta XY e selezionate Compensazione deriva Z per aggiungere un passo di compensazione della deriva Z entro il livello del ciclo di time lapse.Per consentire l'acquisizione di un'immagine multicanale, fate clic sull'icona del gruppo multicanale per aggiungere un livello di gruppo multicanale e fate clic sull'icona aggiungi ciclo stack Z per aggiungere un livello loop stack Z. Quindi impostare la dimensione del passo e il numero di fette desiderati e impostare l'esposizione di ogni canale sul più basso possibile per ridurre al minimo lo sbiancamento delle foto. Per immagini una divisione di celle, selezionare un obiettivo di immersione dell'olio 40 o 60 volte, e il canale di florescence mCherry, e allineare l'obiettivo lungo la parte superiore o inferiore del pozzo.Quindi allontanati dal divisore verticale del pozzo per evitare interferenze con il gradino di compensazione della deriva Z. Individuare una cella o celle in fase G2 o M iniziale e fare clic sul pulsante visualizzazione dal vivo per iniziare a visualizzare le celle nella schermata software. Trovare cellule appropriate nella transizione da G2 a M è fondamentale per l'imaging di una divisione cellulare.Individuare una cella con un nucleo intatto ed esattamente due centrosomi per ottenere i migliori risultati. Utilizzando la manopola di messa a fuoco fine del microscopio, concentrarsi sulle celle di interesse e fare clic su trova offset per impostare il controllo dello stato attivo a infrarossi. Fare clic sull'inizio per avviare il programma di imaging time lapse e selezionare il canale desiderato e regolare le intensità media dei pixel per regolare gli istogrammi in base alle esigenze, per visualizzare chiaramente le celle di interesse.Controllare le celle dopo 15-20 minuti per confermare che il guasto dell'involucro nucleare si è verificato, come determinato dalla scomparsa del punto rotondo e scuro rifratta vicino al centro della cellula. Dopo altri 15-20 minuti, verificare se si è verificata l'insorgenza dell'anafase. Quindi interrompere il programma e salvare il file.Per determinare la ripartizione dell'involucro nucleare in fase di insorgenza dell'anafase, fare clic sul pulsante frame up per determinare il tempo di rottura dell'involucro nucleare e il tempo di separazione cromosoma iniziale in minuti, e sottrarre il tempo di rottura dal tempo di insorgenza per ottenere la rottura dell'involucro nucleare al tempo di insorgenza dell'anafase per una data cellula. Quindi continuare la scansione per pre-dividere le celle per ottenere più estremità per una determinata condizione per un massimo di 12 ore dalla sedimentazione iniziale. Le cellule che stanno per dividersi possono essere prese di mira dalla presenza di due centrosomi e di un nucleo intatto, come indicato dalla luce rifratta e da una macchia più scura all'interno della cellula se viste nel canale della tubulina alfa.La rottura dell'involucro nucleare può essere vista attraverso la scomparsa di questa macchia scura, con conseguente colorazione uniforme del citoplasma. Dopo la rottura dell'involucro nucleare, il tempo che ogni cellula impiega per formare il mandrino e per congressare e separare i cromosomi può essere misurato notando i punti di tempo di questi eventi relativi alla rottura dell'involucro nucleare. Il trattamento con RNA a doppio filamento mirato contro lo shortstop, una proteina di reticolo di microtubuli actina sospettata di influenzare la dinamica del ciclo cellulare provoca un significativo ritardo miotico.Questo trattamento si traduce in un ritardo significativo, con molte cellule che arrestano la metafase e non vengono mai transitione all'anafase durante l'intero esperimento di imaging di due o tre ore. Il co-trattamento con RNA a doppio filamento contro il colpo e l'affare approssimativo, un componente importante di questo checkpoint, porta alla soppressione del fenotipo di arresto, con conseguente rottura dell'involucro nucleare a tempi di anafase simili alle cellule controllate e non trattate. Assicurarsi di selezionare le celle appropriate e non perdere tempo a diagnosticare le celle che non iniziano la divisione.Se una cella non inizia a dividersi entro 20 minuti, trovare un'altra cella. I ricercatori possono seguire questa procedura per aiutare a identificare nuovi regolatori miotici, o forse nuovi composti secchi che influenzano eventi specifici nella divisione cellulare.

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