Name: 3D球形模型作为癌症相关纤维细胞分化和入侵体内研究的更多生理系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 了解如何使用3D球形培养模型研究肿瘤相关纤维细胞（CAF）的分化行为。该方法利用甲基纤维素基质模拟肿瘤微环境，结合免疫荧光和活细胞成像技术，为癌症生物学研究提供更接近生理条件的体外实验系统。

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我们感谢Barbara Schedding在制备BM2和lebein-1过程中的帮助。感谢Àgnes Noel分享其在球体实验方面的专业知识。感谢Sonja Schelhaas和Michael Schäfers在生物安全二级条件下进行慢病毒转染操作时提供的协助。我们感谢Sabine von Rüden在从胰腺癌组织中制备癌症相关成纤维细胞（CAFs）过程中提供的帮助。
获得这些结果的研究得到了欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）下的人才计划（玛丽·居里行动）的资助，项目编号为REA资助协议 n◦ (316610)，授予 J.A.E。此外，J.A.E. 和 A.C.M.C. 还得到了德国研究基金会（DFG）在“运动中的细胞”卓越集群（EXC 1003-CiM）内的财政支持。本项目还得到了威廉·桑德基金会（Wilhelm Sander Stiftung）的资助（资助编号：2016.113.1，授予 J.A.E.）。

1. 利用不同TGF-β1抑制剂和细胞-基质相互作用化合物建立三维类球体作为成纤维细胞/癌相关成纤维细胞体外分化模型
<ol>
	<li>将1份6 mg/mL的甲基纤维素溶液与3份细胞培养基（MEM）混合，MEM中添加1%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素，以制备用于球体形成的溶液。</li>
	<li>将 freshly thawed 的永生化正常成纤维细胞（iNFs）、永生化癌症相关成纤维细胞（iCAFs）或整合素 α3β1 基因敲除的 iCAF（传代不超过25代）重悬于上述球体形成溶液中。若准备一块96孔板，需配制过量的球体形成溶液（10 mL），并加入75,000个细胞，注意每个球体由750个细胞组成，每孔加入100 µL溶液。</li>
	<li>若实验中需加入细胞因子或整合素抑制剂，应将这些化合物添加至细胞悬液中，以便在球体形成过程中将其包埋入球体内。注意：iNFs需用10 ng/mL TGF-β1刺激，以诱导其分化。如适用，可将抑制剂化合物与TGF-β1一同加入，例如20 µg/mL BM2或10 µg/mL lebein 1。</li>
	<li>以相同方式制备CAF同源球体，但无需添加TGF-β1刺激，因其已处于分化状态。制备整合素 α3 基因敲除的CAF同源球体时，不添加任何化合物。</li>
	<li>将球体形成溶液以每孔100 µL的量加入圆底96孔板中。每次向孔板中分配溶液时，均需通过反复吹打充分混匀。</li>
	<li>将板置于细胞培养孵育箱中孵育24小时，使每个孔中形成一个球体。</li>
	<li>约24小时后收集球体，并用于后续不同实验：免疫荧光染色、实时定量（RT）q-PCR和流式细胞术。为检测球体内细胞内和细胞外抗原的表达，包括细胞外基质蛋白在球体内的沉积情况，可采用免疫荧光染色。将球体解离为单细胞后，可通过流式细胞术定量分析膜锚定受体的表达。为检测基因激活及转录水平变化，可对从球体细胞中提取的mRNA进行RT q-PCR分析。</li>
</ol>
2. 类球体的免疫荧光染色
<ol>
	<li>在培养约24小时后，将每种实验条件或每种待分析蛋白的类球体收集至一个1.5 mL离心管中。例如，将经TGF-β1刺激的iNF类球体置于与未处理对照组iNF类球体不同的离心管中。为避免因剪切力过强导致类球体破裂，可剪去移液器吸头末端以扩大孔径。每个离心管中至少包含5–10个类球体，以便设置重复样本，并考虑洗涤步骤中可能发生的损失。</li>
	<li>使用台式离心机在1,000 × g 条件下离心类球体约30–60秒。小心吸去含甲基纤维素的上清液，避免扰动沉淀的类球体。</li>
	<li>用50 µL的1× PBS洗涤一次。重复步骤2.2中的离心操作，并小心吸去PBS。</li>
	<li>根据待染色蛋白的不同，加入50 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下固定20分钟（适用于αSMA、NG2和整合素α3β1），或加入50 µL甲醇在-20 °C下固定10分钟（适用于层粘连蛋白-332亚基）。</li>
	<li>重复步骤2.2–2.3中所述的洗涤步骤。</li>
	<li>加入含0.1% Triton-X的PBS溶液，在室温下孵育4分钟以通透细胞。</li>
	<li>重复步骤2.2–2.3中所述的洗涤步骤三次。</li>
	<li>将类球体置于含5% FBS和2% BSA的PBS溶液中，在室温下孵育1小时，以封闭非特异性蛋白结合位点。</li>
	<li>加入30 µL含一抗的PBS溶液（含2.5% FBS和1% BSA），在4 °C下孵育过夜。所使用的一抗如下：Cy-3标记的抗αSMA抗体和抗NG2抗体，浓度为5 µg/mL；BM2抗层粘连蛋白α3、6F12抗层粘连蛋白β3以及抗层粘连蛋白γ2抗体，浓度为20 µg/mL。</li>
	<li>重复步骤2.2–2.3中所述的洗涤步骤三次。</li>
	<li>加入30 µL含二抗的PBS溶液（含2.5% FBS和1% BSA），在室温下孵育90分钟。所使用的二抗如下：Alexa 488标记的抗兔和抗小鼠二抗（5 µg/mL）。</li>
	<li>重复步骤2.2–2.3中所述的洗涤步骤三次。</li>
	<li>加入30 µL DAPI染色液，在室温下孵育4分钟。</li>
	<li>重复步骤2.2–2.3中所述的洗涤步骤。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德移液管将类球体转移至载玻片上的一滴PBS中。</li>
	<li>在激光扫描共聚焦显微镜下以10倍物镜进行荧光成像。对类球体在不同光学层面（z-stack，共15–20层）采集多个光学横截面图像。为确定显微镜的激光参数设置，可使用不含目标抗原的细胞构成的类球体，或仅用二抗染色的类球体作为对照。所有待比较样本应使用相同的成像参数。</li>
	<li>使用ImageJ软件分析显微图像，方法如先前文献所述14。步骤总结见补充图1。背景信号通过测定无细胞区域（ROI）的积分信号密度确定。总校正细胞荧光（TCCF）计算公式如下： 
	<img alt="荧光数据分析TCCF公式：显微图像中的积分信号密度。" src="/files/ftp_upload/60122/60122eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式1"></li>
	<li>将TCCF根据类球体面积和堆叠层数进行归一化，计算类球体的总校正荧光（TCF）。 
	<img alt="TCF静态平衡公式，展示类球体面积关系，教学示意图。" src="/files/ftp_upload/60122/60122eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式2"></li>
</ol>
3. 同源类球体的RT q-PCR
<ol>
	<li>为进行RT-qPCR，将至少288个类球体（相当于三个96孔板）收集至一个50 mL离心管中。以1,000 × g离心5分钟，并用移液器小心吸除含甲基纤维素的上清液，注意不要扰动沉淀的类球体。</li>
	<li>用1 mL 1× PBS洗涤，将类球体转移至1.5 mL离心管中。使用台式离心机以1,000 × g离心约30–60秒。用移液器小心吸除PBS，注意不要扰动沉淀的类球体。</li>
	<li>在37 °C条件下，用250 µL含4 mg/mL胶原酶B、50 µg/mL DNase I、2% BSA和1 mM CaCl2的PBS溶液轻柔涡旋并每隔5分钟间歇性脉冲振荡数秒，处理约30–45分钟，以解离类球体。</li>
	<li>重复步骤3.2中所述的洗涤步骤。</li>
	<li>根据生产商说明书，使用商用RNA提取试剂盒从解离后的类球体细胞中提取总RNA。</li>
	<li>根据生产商说明书，使用商用试剂盒将分离的mRNA逆转录为cDNA。</li>
	<li>通过实时PCR在重复样本中定量转录水平。所用引物如下：α-SMA：Fw 5′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3′，Rev 5′-ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3′15；层粘连蛋白α3链：Fw 5′-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3′，Rev 5′-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3′16；层粘连蛋白β3链：Fw 5′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3′，Rev 5′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3′17；层粘连蛋白γ2链：Fw 5′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3′，Rev 5′-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3′16；NG2：Fw 5′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3′，Rev 5′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3′18；整合素α3亚基：Fw 5’-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3’，Rev 5’-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3’19；TOP-1：Fw 5′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3′，Rev 5′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3′20。</li>
	<li>使用公式2- ΔΔCt对内源性参照基因（如TOP-1）的Ct值进行校正。ΔΔCt = ΔCt（目标样本） – ΔCt（参照样本），其中ΔCt = 目标基因或参照基因的Ct值 – TOP-I的Ct值。</li>
</ol>
4. 整合素表达的流式细胞术分析
<ol>
	<li>进行流式细胞术分析时，将至少288个类球体（相当于三个96孔板）收集至一个50 mL反应管中。在1,000 × g条件下离心5分钟，并用移液器小心吸除含甲基纤维素的上清液。</li>
	<li>用1 mL 1× PBS洗涤，并将类球体转移至1.5 mL反应管中。重复离心步骤，并用移液器小心吸除PBS。</li>
	<li>按照步骤3.3所述方法解离类球体。</li>
	<li>按照步骤4.2所述方法重复洗涤步骤。</li>
	<li>为阻断非特异性结合位点并防止检测相关抗体与Fcγ受体（CD16、CD32和CD64）结合，将细胞在含有2%马血清（或实验中不使用其抗体的其他动物种属血清）和0.1% BSA的100 µL PBS中，于4 °C旋转孵育20分钟。</li>
	<li>若需染色细胞内标志物，请按照步骤2.2–2.5所述方法对细胞进行固定和透化处理。</li>
	<li>将细胞与一抗在含有2%马血清和0.1% BSA的100 µL PBS中混合，于4 °C旋转孵育30分钟。将一抗稀释至10 µg/mL。</li>
	<li>用100 µL PBS + 0.1% BSA洗涤三次，每次之间在台式高速离心机中以1,000 × g离心。</li>
	<li>将细胞与二抗在含有2%马血清和0.1% BSA的100 µL PBS中混合，于4 °C旋转孵育30分钟。将二抗稀释至10 µg/mL。</li>
	<li>按照步骤4.7所述方法重复洗涤步骤。</li>
	<li>在流式细胞仪中分析2.0 × 104个染色细胞。通过FSC-SSC散点图设门选取单个活细胞，并在对应所选荧光染料的通道中分析门控细胞的荧光信号。</li>
</ol>
5. 利用异质类球体进行侵袭实验
<ol>
	<li>根据表1中总结的内容，配制用于异质类球体（heterospheroids）形成的溶液，其中包含不同类型的细胞及其相应的培养基。这些细胞此前已通过携带编码mCherry或GFP表达载体的慢病毒进行转导。</li>
	<li>向每孔中加入100 µL类球体形成溶液，并将培养板置于细胞培养箱中孵育24小时，使每个孔中形成一个类球体。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中配制60 µL凝胶状基质混合物，其中包含2 mg/mL大鼠尾胶原I、30%商用凝胶化基质以及2.5 µg/mL层粘连蛋白-332（laminin-332）。迅速将15 µL混合物分配至µ-载玻片血管生成腔室（µ-slide angiogenesis chamber）的3个孔中。将一个类球体嵌入每个已含有凝胶的孔中。</li>
	<li>如有必要，在显微镜下使用移液器迅速调整类球体至孔中央位置。</li>
	<li>对后续的异质类球体重复步骤5.2–5.3，并同样对同质类球体（homospheroids）重复上述操作。</li>
	<li>将凝胶在培养箱中孵育1小时使其凝固，随后轻柔地在凝胶表面覆盖细胞培养基。</li>
	<li>使用激光扫描共聚焦显微镜对类球体进行荧光显微成像。在z轴堆栈的不同光学层面以及不同侵袭时间点（例如0 h、24 h、48 h和72 h）获取类球体的不同光学横截面图像。</li>
	<li>通过计数侵袭性癌细胞的数量来分析图像。侵袭细胞是指已离开类球体并进入侵袭区域的细胞。侵袭区域定义为：以侵袭实验开始时类球体边界为内周，以最远侵袭细胞位置为外周所形成的环形区域，如补充图2所示。</li>
</ol>

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作者声明不存在利益冲突。本材料仅反映作者的观点，欧盟对其中所含信息的任何使用不承担任何责任。

建立一个合适的体外模型来研究癌相关成纤维细胞（CAF）的分化是一项具有挑战性的任务。在尝试了多种方法后，我们得出结论：三维球体模型是一种更为实用、生理相关且具有临床意义的模型，可用于研究胰腺癌细胞与永生化CAF之间的相互作用。该模型可防止成纤维细胞因人为应激因素（如细胞培养塑料表面的刚度）而发生自发性分化，至少在短期培养条件（长达48小时）下如此。尽管本研究中所用球体的确切刚度未进行测量，但Ito等人曾利用集成机器人技术的微流控芯片评估了人脐静脉内皮细胞与间充质干细胞异质球体的刚度22。他们在球体组装后第1天和第3天测定了异质球体的平均刚度指数。球体尺寸有所不同，间充质干细胞（MSC）似乎增强了其聚集能力，导致球体尺寸随时间减小（从135.5 µm减小至99.8 µm）21,22。因此，球体的刚度也从5.0 × 10-3 增加至7.5 × 10-3 Pa22。然而，由CAF与AsPC...

肿瘤微环境是一个非常复杂的生态位，对肿瘤细胞的维持和进展极为重要1。它不仅由癌细胞构成，还包括间质成纤维细胞。肿瘤细胞被一种特异且不同于正常组织间质的基质所包围2。层粘连蛋白-332（Laminin-332）是一种在多种肿瘤间质中异位表达的细胞外基质蛋白，例如胰腺导管腺癌3。此外，细胞外基质（ECM）的生化组成及其生物物理特性（如刚度和张力）在肿瘤组织内部也会发生变化4。这种肿瘤间质，即&#34;反应性间质&#34;，是成纤维细胞对邻近癌细胞适应以及招募其他关键组分共同作用的结果，从而形成有利于肿瘤进展的支持性环境。间质成纤维细胞的分化可产生癌症相关成纤维细胞（CAF）。这些细胞可通过多种标志物进行鉴定，例如α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）5或神经/胶质抗原2（NG2）6。
使用癌症相关成纤维细胞（CAFs）来重建肿瘤微环境（TME）的最合适的&#160;体外模型难以选择。在构建此类模型系统时，必须考虑以成本效益高且可重复的方式模拟TME生理参数的方法。在TME中，会发生多种不同的生物学过程，例如不同类型细胞的增殖、分化、迁移和侵袭。这些细胞过程可通过不同的方法分别进行研究。然而，实验条件必须考虑细胞与肿瘤间质细胞外基质（ECM）之间的相互作用，因为基质的刚度会影响CAF的分化过程。R.G. Wells曾指出基质刚度对细胞行为的影响，并强调在体外培养的细胞中观察到的细胞骨架组织和分化状态可能是人为假象7。CAF分化似乎受到多种刺激因素的影响，包括机械张力5,7。为避免这一问题，二维软基质可能是进行分化研究的可行方案，因其可规避刚性培养皿塑料表面带来的干扰。一种可用于培养成纤维细胞的软性二维表面是I型胶原包被的聚丙烯酰胺凝胶，其凝胶刚度可通过调节聚丙烯酰胺浓度和交联剂比例来控制。随着凝胶刚度增加，成纤维细胞中富含αSMA的应力纤维的黏附与形成也会增强8。这些结果凸显了采用软基质支架构建更接近生理状态的体外分化模型的重要性。然而，在我们实际操作中，这类凝胶的实验可重复性和成像均存在挑战。为克服这些不足，我们将二维软基质系统替换为三维球状体模型，用于分化与侵袭研究。该模型具有更高的临床相关性，并且类似于体外类器官，能够模拟体内细胞间的相互作用、细胞外基质的生成与沉积以及细胞行为9。
当细胞缺乏可附着的基质时，会形成球状体。当细胞处于无黏附性表面的环境中，便会聚集形成或多或少呈球形的结构。若球状体由一种细胞组成，则称为同质球状体；若由两种或两种以上不同类型的细胞组成，则形成异质球状体。
在多种类球体构建方法中，我们采用非黏附性圆底96孔板进行实验操作。该方法在成本方面具有显著优势。本实验中，我们既构建了成纤维细胞、CAFs或缺失整合素α3亚基的CAFs的同源类球体，用于研究其分化过程；同时也构建了CAFs或整合素α3基因敲除的CAFs与胰腺导管癌细胞（AsPC-I和PANC-I）共培养的异源类球体，以研究细胞向周围基质的侵袭行为。
这些研究的目的是使用从人胰腺癌活检组织中分离得到的原代CAFs。然而，用于获取细胞的活检组织十分稀缺，因此本研究中所用的CAFs通过含有HTERT的慢病毒进行了永生化处理。这类细胞被称为iCAFs，其相应的正常对照细胞——原代人胰腺成纤维细胞——则称为iNFs。人胰腺成纤维细胞以及胰腺导管癌细胞AsPC-I和PANC-I均可从商业途径获得。
本方案用于研究层粘连蛋白-332与整合素相互作用在CAFs分化过程中的影响。为验证该相互作用的特异性及其功能，使用了抑制剂化合物：BM2，一种单克隆抗体，可阻断整合素与层粘连蛋白-332 α3链的结合位点10；以及lebein 1，一种来源于蛇毒的化合物，可阻断与层粘连蛋白结合的整合素α3β1、α6β1和α7β111,12。
在侵袭实验中，细胞通过慢病毒转导，携带编码mCherry（iCAFs和整合素α3基因敲除的iCAFs）或GFP（AsPC-I和PANC-I）的cDNA，以区分异质类球体中的不同细胞类型。关于通过转导使细胞永生化和/或标记荧光蛋白（mCherry和GFP）表达的方法已在先前的研究中描述13，更多细节可参考该文献。

<table><tbody><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D9542-10</td><td></td></tr><tr><td>6F12 抗层粘连蛋白 &amp;beta;3 亚基 小鼠（单克隆）</td><td></td><td></td><td>自制</td></tr><tr><td>A3IIF5 抗体&amp;alpha;小鼠整合素β3亚基（单克隆）</td><td></td><td></td><td>由波士顿达纳-法伯癌症研究所 M. Hemler 教授惠赠</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白第五组分 - BSA</td><td>AppliChem</td><td>A1391</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊（多克隆）抗小鼠</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊（多克隆）兔</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>抗层粘连蛋白 &amp;gamma;2 亚基 小鼠（单克隆）</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-28330</td><td></td></tr><tr><td>抗NG2兔多克隆抗体 Millipore, AB5320</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>抗-&amp;alpha;-肌动蛋白-小鼠单克隆抗体-Cy3标记</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1细胞系</td><td>ATCC</td><td></td><td>由 Jorg Haier 教授实验室惠赠</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-589-620</td><td>萌发</td></tr><tr><td>BM2 抗层粘连蛋白 &amp;alpha;3 亚基 小鼠（单克隆）</td><td></td><td></td><td>由法国里昂国家科学研究中心（CNRS）Patricia Rousselle 教授惠赠</td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fluka</td><td>21074</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>Multifuge 1S-R</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>康宁</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶B</td><td>罗氏</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原蛋白，大鼠尾部</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 700 和 800</td></tr><tr><td>DMEM（高糖 4.5 g/L）</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>罗氏</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>FACSCaliburTM</td></tr><tr><td>凝胶化基质</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1413202</td><td>基质胶，Geltrex</td></tr><tr><td>山羊IgG，同型</td><td>DAKO</td><td>X 0907</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>12449-C</td><td></td></tr><tr><td>人原代胰腺成纤维细胞</td><td>PELOBiotech</td><td>PB-H-6201</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Heraeus</td><td>B6060</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白-332</td><td>基底膜蛋白</td><td>LN332</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>96孔U型底微孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG，同种型</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I8765</td><td></td></tr><tr><td>多轴旋转混合器</td><td>CAT</td><td>RM5 80V</td><td></td></tr><tr><td>PANC-I</td><td>ATCC</td><td></td><td>由Jorg Haier教授实验室惠赠</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Riedel-de Ha&amp;euml;n</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect 反转录试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>205310</td><td></td></tr><tr><td>大鼠IgG，同型</td><td>Invitrogen</td><td>10700</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 反应管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR仪</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Rotor-Gene Q</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Rotor Gene SYBR Green PCR 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>204074</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>加入葡萄糖至 4.5 g（0.2 μm 滤器）和 1% 丙酮酸钠</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X100RS</td><td></td></tr><tr><td>V&amp;oacute;rtex</td><td>科学工业公司</td><td></td><td>Vortex-Genie 2</td></tr><tr><td>&amp;mu;- 未包被的滑片血管生成</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td></td></tr></tbody></table>

一种更接近生理条件的三维球体模型用于癌相关成纤维细胞分化与侵袭的体外研究

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

确定体外研究的理想模型至关重要，尤其是在研究细胞分化等生理过程时。在肿瘤间质中，宿主成纤维细胞受到癌细胞的刺激而发生分化，从而获得一种促进肿瘤微环境形成并支持肿瘤进展的表型。我们利用球状体模型建立了一种三维体外模型系统，用于分析层粘连蛋白-332及其受体整合素α3β1在此分化过程中的作用。该球状体模型不仅更准确地模拟了肿瘤微环境的条件，而且具有高度的灵活性，可适用于多种下游实验，例如对细胞内和细胞外标志物以及沉积的细胞外基质蛋白进行免疫荧光染色。此外，还可利用该模型开展转录水平的qPCR分析、流式细胞术分析以及细胞侵袭实验。本文中，我们描述了一种球状体模型的实验方案，用于评估癌相关成纤维细胞（CAFs）的整合素α3β1及其异位沉积的配体层粘连蛋白-332在分化过程及支持胰腺癌细胞侵袭中的作用。

该实验设计的结果已发表于Martins Cavaco等人13的研究中，建议进一步阅读该文献以了解从这些实验中得出的结论。
图1为免疫荧光球体的代表性图像，显示了永生化正常成纤维细胞和永生化癌症相关成纤维细胞（CAFs）中整合素α3亚基的免疫染色结果（图1A），以及整合素α3亚基的免疫荧光定量分析（图1B）和通过qPCR检测的整合素α3亚基基因的转录水平（图1C）。该组结果表明，与正常对照相比，iCAFs中整合素α3表达上调。这证明整合素α3β1可作为胰腺成纤维细胞分化的标志物。流式细胞术研究也证实了这一结论13。
...

本实验方案的目的是建立一种三维体外模型，用于在类似肿瘤组织的环境中研究癌相关成纤维细胞（CAFs）的分化过程，该模型可应用于多种分析系统，如免疫荧光、转录分析和活细胞成像。

确定体外研究的理想模型至关重要，尤其是在研究细胞分化等生理过程时。在肿瘤……

将成纤维细胞在球状体中进行培养，比在坚硬塑料表面常用的二维系统更能真实地模拟肿瘤组织。该方法可实现在类似肿瘤的环境中研究成纤维细胞的分化。在此培养体系中，细胞培养塑料表面的刚性不会人为影响成纤维细胞的分化过程。相反，可以在体外分析细胞基质相互作用对肿瘤诱导的成纤维细胞分化的影响。开始该实验步骤时，准备细胞培养基，即添加了1%热灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的MEM培养基。同时，准备6毫克/毫升的甲基纤维素溶液。将甲基纤维素与细胞培养基按1:3的比例混合，制备类球体形成溶液。用该类球体形成溶液重悬 freshly thawed 的永生化正常成纤维细胞或其他文本方案中列出的细胞类型。若研究中包含细胞因子或整合素抑制剂，需将这些化合物加入细胞悬液中，以便在类球体形成过程中将其包埋入内。必要时，加入抑制剂化合物及10 纳克/毫升 TGF-β1，以诱导永生化正常成纤维细胞发生分化。将100 微升类球体形成溶液加入至圆底96孔板的每孔中。用移液器将每孔中的溶液上下吹打数次以混匀。然后，将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的细胞培养孵育箱中孵育24小时，使每个孔中形成一个类球体。首先，剪掉移液器吸头末端以扩大其开口。孵育完成后，使用这种剪过的移液器将类球体收集到每个实验条件或每种待分析蛋白对应的1.5毫升离心管中。将球状体在1000 × g条件下离心约30至60秒。用移液器小心吸除含有甲基纤维素的上清液，注意不要扰动沉淀的球状体。在将球状体转移至反应管时需格外小心。通过切割尖端确保不产生剪切漂移力。收集所有类球体也非常重要。在洗涤步骤中，务必注意通过吸液时不要丢失类球体。洗涤类球体时，加入50微升1×PBS。在1000 × g条件下离心30至60秒，然后用移液器小心吸除PBS。根据待染色的蛋白，将类球体用50微升4%多聚甲醛和PBS在室温下固定20分钟。用PBS按前述方法洗涤类球体。用0.1% Triton X和PBS在室温下对细胞透化处理4分钟。然后，按照先前所述方法用 PBS 洗涤类球体三次。向类球体中加入含有 5% FBS 和 2% BSA 的 PBS，室温孵育一小时，以阻断非特异性蛋白结合位点。接着，将类球体与 30 微升一抗溶液（溶于含 2.5% FBS 和 1% BSA 的 PBS 中）于 4 摄氏度孵育过夜。第二天，按照之前所述方法用 PBS 洗涤类球体三次。随后，将类球体与 30 微升含 2.5% FBS 和 1% BSA 的 PBS 中的二抗在室温下孵育 90 分钟。再次按照之前所述方法用 PBS 洗涤类球体三次。接下来，在室温下用 30 微升 Dappy 染色液孵育细胞 4 分钟。按照前述方法用 PBS 洗涤类球体一次。使用玻璃巴斯德吸管将类球体转移至载玻片上，并加入一滴 PBS。使用激光扫描显微镜以10倍放大倍数通过荧光显微镜对类球体进行成像。在Z堆栈的不同光学平面获取类球体的不同光学横截面。正常胰腺成纤维细胞同源类球体与永生化癌相关成纤维细胞同源类球体的免疫荧光染色代表性图像显示，分化细胞中α3亚基信号增强。然后利用3D球状体的Z轴层扫图像对球状体中细胞的荧光信号进行定量，并通过qPCR测定整合素α3亚基基因的转录水平。所有这些结果表明，与正常对应细胞相比，永生化的癌症相关成纤维细胞中整合素α3表达上调。这证明整合素α3β1可作为胰腺成纤维细胞分化的标志物。该方法特别适用于模拟通常存在于器官和肿瘤组织中的自体组织，其中细胞外基质的硬度决定细胞命运。类球体培养是一种多功能模型，可在类球体解离后结合其他分析检测方法，如定量实时 PCR 和流式细胞术。用于类球体固定的多聚甲醛是一种危险化学品。应佩戴手套和护目用品以提供保护。

a-3d-spheroid-model-as-more-physiological-system-for-cancer

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

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