Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس الأصفر لوسيفر
Chapters
Summary September 14th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
الخلايا النجمية هي خلايا معقدة من الناحية الشكلية، وتتمثل في عملياتها المتعددة وأراضيها الكثيفة. لتحليل مورفولوجيا تفصيلا، ونحن نقدم بروتوكول موثوق بها لأداء الأيونتوبهوريس الأصفر داخل الخلايا في الأنسجة الثابتة طفيفة.
Transcript
يمكن استخدام هذه الطريقة لتسهيل التصور من العمليات الفلكية غرامة جدا لتقييم التفاعلات العصبية الفلكية في المشبك أثناء المرض والدول ثابتة. يمكن تطبيق هذه التقنية أيضا في أي نموذج الماوس أو مجموعة الخلايا أو منطقة الدماغ. لإعداد قطب حاد مع مقاومة مناسبة، سحب قطب واحد للبرميل زجاج البورسليكات مع خيوط على سحب ميكرويبيت.
تخزين الأقطاب الكهربائية المسحوبة في حاوية مغلقة لمنع الغبار من دخول النصائح والحفاظ على الأقطاب مرتفعة من أسفل المربع لمنع النصائح من كسر. لملء قطب كهربائي مع محلول صبغ أصفر لوسيفر، وضع القطب في موقف عمودي مع الحافة التي تواجه الهبوط، والماصات واحد إلى اثنين من ميكرولترات من محلول أصفر لوسيفر في الجزء الخلفي من القطب. انتظر من خمس إلى عشر دقائق حتى ينتقل المحلّل إلى الطرف عبر عمل الشعيرات الدموية قبل تأمين القطب المليء برفق في حامل قطب كهربائي متصل بجهاز مناور مع السلك الفضي لمالك القطب الكهربائي المتلامس مع الأصفر المُلِك داخل القطب.
لاختبار طرد الصبغة، ضع بلطف شريحة الدماغ ثابتة طفيفة في طبق أسفل الزجاج مليئة 0.1 PBS الضرس في درجة حرارة الغرفة وعقد شريحة في مكان مع القيثارة البلاتين مع سلاسل النايلون. قم بتوصيل القطب الكهربائي بمصدر جهد كهربائي ووضع القطب الأرضي في الحمام الذي يحتوي على شريحة الدماغ. نقل الهدف من المجهر confocal إلى منطقة الدماغ من الفائدة وخفض القطب في الحل باستخدام عدسة غمر الماء 10X، ونقل القطب إلى مركز مجال الرؤية.
تحت الإضاءة في الميدان الساطع، قم بفحص القطب الكهربائي بعناية باستخدام عدسة غمر الماء 40X لضمان أن القطب يبدو واضحًا وبدون حطام أو فقاعات. قم بالتبديل إلى التصوير المجهري بالليزر confocal باستخدام ليزر 488 نانومتر. بدوره على محفز في 12 فولت لاختبار طرد صبغة.
وينبغي أن تكون سحابة صبغة الفلورسنت الكبيرة مرئية حول طرف القطب. ثم، تحت حقل مشرق انخفاض ببطء القطب نحو شريحة، ووقف فقط فوق السطح. لملء استروسيتي من الفائدة مع أيونتوبهورسيس، استخدم التداخل التفاضلي الأشعة تحت الحمراء النقيض لتحديد astrocytes مع سوماتا بيضاوية ممدود الشكل حوالي 10 ميكرومتر في القطر، 40 إلى 50 ميكرومتر تحت سطح الشريحة.
هذا هو شعاع الطبقة من قرن آمون مباشرة تحت طبقة الخلية الهرمية. ونحن نتحرك من خلال الأنسجة، يمكننا أن نرى الأوعية الدموية، والخلايا العصبية، الخلايا الفلكية، وأنواع الخلايا الأخرى. بمجرد اختيار استروسيتيت، قم بتحريك الخلية إلى مركز مجال الرؤية وخف ببطء طرف القطب الكهربائي إلى الشريحة، وانتقل عبر الأنسجة حتى يصبح القطب على نفس هيئة الخلية.
مرة واحدة في الجسم الخلية من astrocyte مرئيا بوضوح والمبينة، ببطء وبلطف تقدم القطب إلى الأمام، وتحريك القطب حتى تلميح impales سوما من الخلية. نقل التركيز من الهدف ببطء صعودا وهبوطا إلى ملاحظة إذا كان القطب الكهربائي داخل سوما. بمجرد أن يكون طرف القطب داخل الخلية، قم بتشغيل المحفّز عند 0.5 إلى فولت واحد لإخراج التيار باستمرار إلى الخلية.
باستخدام المجهر confocal، ومشاهدة فيلم الخلية، وزيادة التكبير الرقمي لتصور تفاصيل الخلية والتأكد من أن غيض من القطب مرئية داخل الخلية عند الضرورة. انتظر حوالي 15 دقيقة حتى تظهر الفروع والعمليات الدقيقة معرفة قبل إيقاف الجهد الكهربائي وسحب طرف القطب الكهربائي بلطف من الخلية. لصورة الخلية المعبأة، انتظر 15 إلى 20 دقيقة حتى تعود الخلية إلى شكلها الأصلي قبل ضبط الإعداد على المجهر confocal للتأكد من أن الفروع والعمليات الدقيقة تظهر محددة تحت الهدف 40X.
قم بإعداد مكدس Z بحجم خطوة 0.3 ميكرومتر، وتحريك الهدف أثناء التصوير حتى لا تكون هناك إشارة من الخلية وتعيين تلك الخطوة على أنها الأعلى. ثم نقل الهدف إلى أسفل، مع التركيز من خلال الخلية حتى لا يكون هناك إشارة وتعيين تلك الخطوة كما في أسفل. بعد اكتمال التصوير، تحقق من القطب الكهربائي للبحث عن طرد الصبغة.
إذا ظهرت سحابة صبغ كبيرة، يمكن استخدام القطب للشريحة التالية. خلاف ذلك، استبدال القطب. من خلال توليد إسقاط كثافة القصوى ، يمكن ملاحظة عرض مفصل لبنية الفلكية في مجالها.
وهناك أربعة X حجم التكبير في الفلكية يكشف عن إسقاط كثافة القصوى من فرع رئيسي واحد، والعديد من الفروع الثانوية، وتوزيع الفروع المحيطة والنشرات. هنا، يتم عرض الصورة الأصلية لـ CA1 astrocyte. يتم إعادة بناء جسم الخلية والفروع الرئيسية والعمليات وحجم الأراضي المحاطة بـ astrocyte في هذه الصور اللاحقة.
بعد إنشاء عمليات إعادة الإعمار، تم تحديد كميات من سوما، الخلية بأكملها، والأراضي. وعدد الفروع الرئيسية تم عدّه. كما يتم التعبير عن البروتين الخلوي الهيكلي أن التسميات خيوط الفلكية المتوسطة في soma الخلية، والفروع الرئيسية، وبعض فروع استروسيات الثانوية، ولكن ليس في الفروع والعمليات الدقيقة.
في هذا التحليل التمثيلي، لم يتم العثور على اختلافات كبيرة في عدد الفروع الأولية التي تحمل اسم البروتين حمضي الرجفاني الدغلي وتلك التي تصور بواسطة الأصفر لوسيفر. وعلاوة على ذلك، كانت منطقة الخلية وحجم استروسايت المسمى بالبروتين حمضي الرجيلي الدليليس أصغر بكثير من المنطقة والحجم المرئي مع الأصفر لوسيفر، مما يدل على أن البروتين حمضي الرجلين الدبقية هو علامة موثوق بها لوضع العلامات على الفروع الرئيسية ولكن ليست مفيدة لتحديد المنطقة الكلية أو حجم الخلية. كمية الصبغة التي تم إطلاقها من طرف القطب يعتمد على مقاومة القطب الذي يجب أن يكون عاليًا بما يكفي للسماح بتدفق ثابت من الصبغة ليتم إخراجه.
يمكن للدراسات المستقبلية دراسة المكونات المختلفة للبنية الفلكية عن طريق المجهر الخفيف فائق الدقة أو التحليل المناعي لبروتينات محددة داخل بنية الأستروسيات.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
