Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Avbildning av intracellulära ATP i Organotypic vävnad skivor av musen hjärnan med hjälp av bandet-baserade sensorn ATeam 1,03Yemk
Chapters
Summary December 19th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver ett protokoll för cell-typ specifikt uttryck för den genetiskt kodade FRET-baserade sensorn ATeam 1,03Yemk i organotypic slice kulturer av musen framhjärnan. Dessutom visar vi hur man använder denna sensor för dynamisk avbildning av cellulära ATP nivåer i nervceller och astrocyter.
Transcript
Här visar vi hur man använder den ATP-känsliga FRET-sensorn ATeam 1.03 YEMK för dynamiska mätningar av förändringar i neuronala och astrocytiska ATP-nivåer i organotypiskt odlade mus hippocampus skivor. Den största fördelen med denna teknik är att den som kan studera energimetabolism i levande hjärnvävnad i en kontrollerad inställning, en miljö med höga sensoruttrycksnivåer. Denna teknik kan bidra till att få insikter i pathomechanisms, underliggande sjukdomar, eller hjärnskador, till exempel, orsakas av energibrist, som ischemisk stroke.
Det kan, i princip, användas för att studera ATP-nivåer, inte bara i hjärnvävnad, men i andra organ också. För att framgångsrikt köra detta experiment, Det är viktigt att utföra alla steg som deltar i odling av vävnaden extremt försiktig och att upprätthålla sterilitet. Dessutom krävs viss kunskap om cellulär fluorescerande avbildning.
Vävnadshantering i de flesta sofistikerade tillvägagångssätt och en visualisering är avgörande för att förstå de korrekta förfarandena. Detsamma gäller för bildexperiment. Demonstrera förfarandet kommer att Rodrigo Lerchundi, en postdoc, och Na Huang, en Master student från laboratoriet.
I en iskall Petriskål fylld med ACSF, placera hjärnan på ett filtermembran. Separera halvkloten och utför ett parasagittal snitt i en vinkel på 45 grader. Fixera en halvsfär vid Vibratome vävnadsstadiet med superlim, och överför omedelbart vävnadsblocket till Vibratome-badet som innehåller iskall ACSF bubblade med 5%koldioxid och 95%-syre.
Rikta in vävnaden i Vibratome-badet. Håll den andra hjärnhalvan i iskall ACSF tills skivning. Justera Vibratome för att skära skivor vid 250 till 400 mikrometer.
Efter styckning av skiva, identifiera hippocampus formationen baserat på dess typiska morfologiska utseende och isolera den med hjälp av hypodermiska nålar, hålla den del av hjärnbarken intill hippocampus. Placera skivan på ett nät i ACSF, värms till 34 grader Celsius och bubblade med 5% koldioxid och 95% syre tills alla skivor samlas in. Överför skivorna till laminär flödesskåpet för att fortsätta under sterila förhållanden.
Med en inverterad, steril, glas Pasteur pipetter, försiktigt överföra skivor från ACSF i en av de förvörda Petriskålar fyllda med steril Hanks'saltlösning. Byt pipetten och överför skivorna till den andra odlingsskålen. Upprepa processen fem gånger totalt.
Överför så lite HBSS som möjligt till följande odlingsplattor. Med hjälp av en pipett, försiktigt placera en skiva i taget på toppen av kulturinsatsen. Undvik turbulenser i pipetten, och vänta tills skivan sjunker till spetsen av Pasteurpipett.
Upprepa processen för varje segment. Placera två skivor på ett membran. Ta försiktigt bort eventuellt överflödig Hank-lösning från insatsens överkant genom att använda en fin spets.
Håll kulturerna i en befuktad inkubator på 5%koldioxid och 37 grader Celsius tills dagen för experimentet. Byt ut mediet varannan till var tredje dag. Utan att vidröra vävnaden, applicera 0,5 mikroliter av den utspädda vektorn direkt på toppen av varje skiva.
Slutligen, placera skivorna tillbaka i inkubatorn och underhålla dem där i minst sex dagar. Strax innan du startar ett experiment, överför ett skär som innehåller odlade skivor i den sterila huven, och placera den i en 30 millimeters maträtt som innehåller en milliliter organotypisk skiva kultur medium, eller minimalt essentiellt medium. Placera skålen under stereoskopet och fokusera på skivans yta.
Använd två sterila injektionsnålar för att göra en kort korsskuren höger på de smala kanterna på en vald skiva, och i det övre lagret utan att skada vävnaden under. För att ta bort den förberedda skiva från skäret, håll kanterna på membranet med pincett och använda en steril skalpell för att göra raka, parallella skärningar till membranet, bildar en kvadrat eller en triangel med skiva i mitten. Om insatsen är värd för ytterligare skivor, överför den tillbaka till den ursprungliga plattan och in i inkubatorn.
Mediets ytspänning kommer att förhindra dess läckage på membranets yta. Förbered experimentell ACSF och få ett pH-värde på 7,4 genom att bubbla det med 95%syre och 5%koldioxid genom ett infogat slangar som är anslutet till karbogentillförseln i minst trettio minuter. Håll saltlösningen bubblad under hela experimentet.
Slå därefter på monokronometerns fluorescerande ljuskälla. Överför den organotypiska skiva kulturen i den experimentella kammaren. Placera ett rutnät ovanpå den organotypiska skiva kulturen med ramen ner, inte röra kulturen, och trådarna upp, röra vid membranet.
Placera kammaren på mikroskopet scenen och anslut den till perfusion systemet. Slå på peristaltiska pumpen vid ett flöde på 1,5 till 2,5 milliliter per minut. Kontrollera att det inte finns någon läcka av perfusionssystemet.
Med hjälp av transmissionsljus, för den odlade skivan i fokus och identifiera det område där experiment ska utföras. Innan du startar bildexperiment ska du vänta i minst 15 minuter så att skivorna kan anpassas till saltlösningsförhållandena och slå sedan på kameran och bildhanteringsprogrammet. Excitera givaren fluorescerande protein vid 435 nanometer.
Ställ in exponeringstiden på mellan 40 till 90 millisekunder. Sätt sedan in den dichroiska spegeln och filtren i strålklystnadsenheten. Dela fluorescensutsläppet vid 500 nanometer med en avgasbildsdelare och använd bandpassfilter vid 482 plus eller minus 16 och 542 plus eller minus 13,5 nanometer för att ytterligare isolera givaren och acceptorfluorescensen.
Välj en region av intresse som uppenbarligen saknar cellulär fluorescens för bakgrund subtraktion. Cirkel enstaka strukturer av märkt vävnad i bilden på skärmen för att skapa ROIs. Ställ in frekvensen för bildförvärv och den totala inspelningstiden.
För experiment som är längre än 30 minuter rekommenderas en förvärvsfrekvens på 0,2 till 0,5 Hertz för att förhindra fototoxicitet. Därefter startar inspelningen. För att framkalla förändringar i intracellulär ATP, växla perfusionsröret från standard ACSF till en saltlösning som innehåller metaboliska hämmare, till exempel, kemisk ischemilösning.
Alternativt, använd en saltlösning med förhöjd kaliumkoncentration vid åtta millimolar för att efterlikna frisättning av kaliumjon från aktiva nervceller. Direkt efter inspelningarna, utbyte den experimentella ACSF med högar-buffrade ACSF. Överför sedan inspelningskammaren som innehåller skivakulturen till det konfokala laserskanningsmikroskopet.
Ta Z stack bilder på högsta Z-upplösning möjligt vid den givna optiska konfigurationen. I detta protokoll, tio dagar efter en transduktion, nervceller uttrycker ATeam 1.03 YEMK hittades vid hög densitet i neocortex av odlade vävnad skivor på djup av upp till 50 mikrometer under skiva yta. Jämförbara resultat uppnåddes i hippocampus.
För astrocyter, ATeam 1.03 YEMK uttrycktes under kontroll av den mänskliga glialt fibrolary sura protein promotor, och organotypic skivor uttrycker ATeam 1.03 YEMK i hippocampus nervceller valts ROIs representerar somata av pyramidala celler. Efter att ha exponerat skiva till 5 millimolar natriumazid i avsaknad av extracellulära glukos i en minut, var motsatta förändringar induceras i utsläppsintensiteten av FRET paret. En reversibel minskning av ATeam FRET-kvoten observerades också.
Långsiktiga ATeam FRET-förhållande i 14 olika celler under baslinjeförhållanden i nervceller och astrocyter visar att ATeam är en pålitlig och stabil sensor. Observera att den kemiska ischemin resulterade i den förväntade starka nedgången i ATeam-förhållandet i båda celltyperna i slutet av detta experiment. En ökning av den extracellulära kaliumkoncentrationen från tre till åtta millimolar i tre minuter resulterade inte i en detekterbar förändring av nervcellerna som uttrycker ATeam 1.03 YEMK.
Däremot reagerade astrocyterna på ökningen av extracellulärt kalium genom en reversibel ökning av ATeam FRET-kvoten, vilket indikerar en ökning av intracellulära ATP-nivåer. Återigen orsakade kemisk ischemi en omedelbar minskning av ATeam-förhållandet, vilket visar att sensorn kan upptäcka förändringar i ATP. När man försöker FRET-baserad cellulär avbildning som beskrivs här, är det viktigt att tänka på att produktionen av högkvalitativa skivor i organotypiska kulturer är ett viktigt steg.
Dessutom krävs noggrant avlägsnande av det gliala ärret och avbildning på expertnivå. Efter detta förfarande, man bör också kunna utföra experiment införliva olika andra FRET-baserade nanosensor för cellulära metaboliter. Till exempel, de för glukos eller laktat.
Sist, men inte minst, måste det betonas att relevanta handlingar för skydd av djur alltid måste iakttas. Detta gäller också för de effektiva lagar som reglerar hanteringen av genetiskt modifierade organismer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
