Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Het bestuderen van de effecten van door tumor uitgescheiden Paracrine liganden op macrofaag activering met behulp van co-cultuur met permeabel membraan ondersteunt
Chapters
Summary November 28th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een methode met behulp van permeabele membraan ondersteuningen om de studie van contactloze paracrine signalering die door tumorcellen wordt gebruikt om de immuunrespons te onderdrukken te vergemakkelijken. Het systeem is vatbaar voor het bestuderen van de rol van tumor-uitgescheiden factoren bij het demping van macrofaag activering.
Transcript
Deze Transwell co-cultuur methode wordt gebruikt om paracrine signalering gebruikt door tumorcellen om de immuunrespons te onderdrukken bestuderen. Deze methode kan worden gebruikt om nieuwe afgescheiden liganden te ontdekken, evenals de mechanistische onderbouwing van hun immuunonderdrukkende effecten. We hebben deze methode eerder gebruikt om te laten zien hoe tumor-gesecreteerde factoren macrofaag pro-inflammatoire gentranscriptie kunnen dempen.
Wij geloven dat deze tool heeft brede implicaties in de studie van tumor-afgeleide immuun onderdrukking. Een van de belangrijkste voordelen van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om paracrine signalering tussen tumorcellen en immuuncellen te bestuderen zonder de potentieel verwarrende variabele van cel-naar-cel contact. Dit platform is ook vatbaar voor een verscheidenheid aan moleculaire biologische technieken voor downstream analyse.
Na het oogsten van buikvliesmacrofagen, plaat ze direct in de bovenste kamers van een 0,4 micrometer polyester membraan insert co-cultuur zes-put plaat. Vervolgens toegevoegd aangevuld DMEM aan de put zodanig dat de bovenste kamer bevat een milliliter en de onderste kamer bevat 1,5 milliliter. Incubeer gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide.
Ten eerste, cultuur commercieel beschikbare tumorcellen in hun respectieve medium, volgens ATCC aanbevolen weefsel cultuur methoden. Was vervolgens de aanhangende tumorcellen eenmaal met PBS. Voeg 0,05% trypsine in EDTA toe en broed op 37 graden Celsius totdat de cellen loskomen.
Stel vervolgens de cellen opnieuw op in media die FBS bevatten. Gebruik een hemocytometer of celteller om het totale aantal cellen te kwantificeren en centrifuge op 220 keer G gedurende vijf minuten te pelleteren. Tijdens centrifugatie, aspirate het medium uit de bovenste en onderste kamers van de macrofaag met permeabele membraan steunplaten en vervangen door vers medium.
Voor de onderste kamers waar tumorcellen zullen worden verguld, vul met een milliliter medium in plaats van 1,5 milliliter om voldoende volume te verlaten voor celtoevoeg. Wanneer de centrifugatie is voltooid, het medium uit de pelleted tumorcellen aanzuigen en de cellen in de aangevulde DMEM opnieuw opschorten bij een concentratie van 300.000 cellen per milliliter. Voeg 0,5 milliliter van deze celsuspensie toe aan de onderste kamer van de gewenste putten.
Om macrofaag pro-inflammatoire genexpressie te induceren, behandelt u afzonderlijk of co-gekweekte macrofagen door interferonmama toe te voegen bij een concentratie van 100 nanogram per milliliter en LPS bij een concentratie van 50 nanogram per milliliter. Varieer de duur van de behandeltijden in de cultuur als dat nodig is. Macrofaag activering vindt plaats binnen twee uur, en sommige tumor-gemedieerde onderdrukking optreedt door acht uur.
Co-cultuur gedurende 24 uur levert robuuste en consistente tumor-afgeleide onderdrukking. Als een negatieve controle, cultuur macrofagen afzonderlijk en laat onbehandeld. Behandel als een positieve controle afzonderlijk gekweekte macrofagen met interferon gamma en LPS in dezelfde concentraties die voor de monsters worden gebruikt.
Nadat de gewenste incubatietijd is verstreken, isoleer het cellysaat of conditiecultuurmedium naar wens, afhankelijk van de testbehoeften. Om het cellysaat te isoleren voor kwantitatieve polymerase kettingreactieanalyse, het medium uit beide kamers van de put aan tezuilen en eenmaal te wassen met twee milliliter PBS. Breng RNA lysis buffer aan op de bovenste kamer met de macrofagen.
Schraap hierna voorzichtig het membraan om het cellysaat vrij te geven en breng het over naar een opvangbuis voor verdere verwerking volgens het protocol van de fabrikant van de RNA-isolatiekit. De hier beschreven co-cultuurmethode omvat de cultuur van macrofagen en tumorcellen zonder fysiek contact. Peritoneale macrofagen gekweekt in afwezigheid van tumorcellen worden gebruikt als negatieve en positieve controles.
Peritoneale macrofagen co-gekweekt in aanwezigheid van B16F10 tumorcellen, maar zonder activerende stimuli niet verhogen expressie van pro-inflammatoire geassocieerde genen. Dit impliceert dat tumor-uitgescheiden liganden ofwel niet voldoende zijn om pro-inflammatoire genexpressie zelf te induceren, of als er immuunactivering door tumorafscheidingen is, paracrine liganden voldoende zijn om het tot zijn oorspronkelijke niveaus te onderdrukken. Deze co-cultuur methode illustreert dat wanneer macrofagen gepolariseerd door interferon gamma en LPS worden gekweekt in de aanwezigheid van tumorcellen, onderdrukking van ontsteking-geassocieerde genexpressie werd verminderd met maar liefst 60%Een vergelijkbaar niveau van macrofaag pro-inflammatoire genonderdrukking wordt waargenomen wanneer de murine macrofaag cel lijn J774 wordt vervangen door peritonealphages.
Eerder werk heeft eiwit S geïdentificeerd als een tumor-uitgescheiden factor die macrofaagactivering kan remmen, dus het permeabele membraanondersteuning co-cultuurmodel wordt gebruikt in combinatie met een lysA om de concentratie van eiwit S in geconditioneerde media na 24 uur te testen. In geconditioneerde media van interferon gamma en LPS-behandelde B16F10 melanoomcellen, wordt eiwit S uitgedrukt in een concentratie van ongeveer 475 nanogram per milliliter. Peritoneale macrofagen behandeld in dezelfde omstandigheden uitgedrukt eiwit S op ongeveer 61 nanogram per milliliter.
Interessant is dat toen co-gekweekt, de concentratie van eiwit S in de interferon gamma en de LPS-behandelde put was ongeveer 86 nanogram per milliliter. Dit suggereert dat ofwel macrofagen tumor-gedecretde eiwit S innemen of dat de hoeveelheid eiwit S afgescheiden door B16F10 cellen aanzienlijk is afgenomen wanneer in aanwezigheid van macrofagen. Deze resultaten benadrukken diepgaande veranderingen van macrofaagactivering en paracrinesignalering wanneer macrofagen worden co-gekweekt met tumorcellen.
De Transwell co-cultuur methode kan een verscheidenheid aan vragen met betrekking tot paracrine signalering te beantwoorden. Westerse vlekanalyse kan worden uitgevoerd om te bepalen hoe tumor-gesecreteerde eiwitten verschillende signaleringstrajecten in macrofagen veranderen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
