Login processing...

JoVE Journal
Cancer Research

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Cancer Research

Studera effekterna av Tumörutsöndras Paracrine ligander på Makrofagaktivering med hjälp av co-kultur med permeabla membran stöder

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

Journal (Cancer Research)

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Journal (Cancer Research)

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Click here for the English version

Studera effekterna av Tumörutsöndras Paracrine ligander på Makrofagaktivering med hjälp av co-kultur med permeabla membran stöder

Article DOI: 10.3791/60453-v

November 28th, 2019 •

Kelly Pittman¹, Shelton Earp¹, Eric Ubil²

¹Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina at Chapel Hill, ²O'Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

November 28th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Här presenterar vi en metod med permeabla membran stöd för att underlätta studiet av icke-kontakt parakrin signalering används av tumörceller för att undertrycka immunförsvaret. Systemet är mottaglig för att studera rollen av tumör-utsöndras faktorer i dämpande makrofagaktivering.

Transcript

Denna Transwell co-kultur metod används för att studera paracrine signalering används av tumörceller för att undertrycka immunsvaret. Denna metod kan användas för att upptäcka nya utsöndring ligander, liksom mekanistiska underbyggnad av deras immun suppressiva effekter. Vi har tidigare använt denna metod för att visa hur tumör-utsöndring faktorer kan dämpa makrofag pro-inflammatoriska gen transkription.

Vi tror att detta verktyg har omfattande konsekvenser i studien av tumör-derived immun suppression. En av de största fördelarna med denna teknik är att den kan användas för att studera paracrine signalering mellan tumörceller och immunceller utan potentiellt förvirrande variabel av cell-till-cell kontakt. Denna plattform är också mottaglig för en mängd olika molekylärbiologiska tekniker för nedströms analys.

Efter skörd peritoneal makrofager, platta dem direkt i de övre kamrarna i en 0,4 mikrometer polyestermembran infoga kokultur sex-väl platta. Därefter tillsats kompletteras DMEM till brunnen så att den övre kammaren innehåller en milliliter och den nedre kammaren innehåller 1,5 milliliter. Inkubera i tre dagar vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid.

Först, kultur kommersiellt tillgängliga tumörceller i deras respektive medium, efter ATCC rekommenderade vävnadskultur metoder. Därefter tvätta de vidhäftande tumörcellerna en gång med PBS. Tillsätt 0,05%trypsin i EDTA och inkubera i 37 grader Celsius tills cellerna lossnar.

Sedan åter upphäva cellerna i media som innehåller FBS. Använd en hemocytometer eller cellräknare för att kvantifiera det totala antalet celler och centrifug vid 220 gånger G under fem minuter till pellet. Under centrifugeringen aspirera mediet från de övre och nedre kamrarna i makrofag som innehåller permeabla membranstödplattor och ersätter med färskt medium.

För de nedre kamrarna där tumörceller kommer att pläterad, fyll med en milliliter medium i stället för 1,5 milliliter att lämna tillräcklig volym för cell tillägg. När centrifugeringen är klar aspirera du mediet från de pelleterade tumörcellerna och åter suspendera cellerna i kompletterad DMEM vid en koncentration av 300, 000 celler per milliliter. Lägg till 0,5 milliliter av denna cellupphängning till den nedre kammaren av de önskade brunnarna.

För att inducera makrofag proinflammatoriska genuttryck, behandla singly eller co-odlade makrofager genom att lägga till interferon gamma vid en koncentration av 100 nanogram per milliliter och LPS vid en koncentration av 50 nanogram per milliliter. Variera behandlingstiderna i kulturen efter behov. Makrofagaktivering sker inom två timmar, och vissa tumörmedierade dämpning sker med åtta timmar.

Samkultur i 24 timmar ger robust och konsekvent tumör-härledda förtryck. Som en negativ kontroll, kultur makrofager singly och lämna obehandlade. Som en positiv kontroll, behandla singly-odlade makrofager med interferon gamma och LPS vid samma koncentrationer som används för proverna.

Efter att önskad inkubationstid har förflutit, isolera cellen lysate eller tillstånd odlingsmedium som önskas beroende på testbehov. För att isolera cellen lysate för kvantitativ polymeras kedjereaktion analys, aspirera mediet från båda kamrarna i brunnen och tvätta en gång med två milliliter PBS. Applicera RNA-lysbuffert på den översta kammaren som innehåller makrofagerna.

Efter detta skrapar försiktigt membranet för att frigöra cellen lysate och överföra den till en insamlingsrör för vidare bearbetning enligt RNA isolering kit tillverkarens protokoll. Den samkultur metod som beskrivs här innebär kultur av makrofager och tumörceller utan fysisk kontakt. Peritoneal makrofager odlade i avsaknad av tumörceller används som negativa och positiva kontroller.

Peritoneal makrofager co-odlade i närvaro av B16F10 tumörceller men utan att aktivera stimuli inte öka uttryck för pro-inflammatoriska associerade gener. Detta innebär att tumör-utsöndlade ligander är antingen inte tillräckliga för att inducera pro-inflammatoriska genuttryck av sig själva, eller om det finns immun aktivering av tumör sekret, paracrine ligander är tillräckliga för att undertrycka den till dess infödda nivåer. Denna samkultur metod illustrerar att när makrofager polariserade av interferon gamma och LPS är odlade i närvaro av tumörceller, var undertryckande av inflammation-associerade genuttryck minskas med så mycket som 60%En jämförbar nivå av makrofag pro-inflammatoriska gensupprning observeras när murin makrofag cell linje J774 ersätts för peritoneal makrofager.

Tidigare arbete har identifierat protein S som en tumör-utsöndring faktor som kan hämma makrofag aktivering, så den genomsläppliga membran stöd samkultur modell används tillsammans med en lysA att analysera koncentrationen av protein S i konditionerade medier efter 24 timmar. Hos konditionerade medier från interferon gamma och LPS-behandlade B16F10 melanomceller uttrycks protein S i en koncentration på cirka 475 nanogram per milliliter. Peritoneala makrofager som behandlats i samma tillstånd uttryckte protein S vid ungefär 61 nanogram per milliliter.

Intressant, när co-odlade, koncentrationen av protein S i interferon gamma och LPS-behandlade väl var cirka 86 nanogram per milliliter. Detta tyder på att antingen makrofager intag av tumör-utsöndring protein S eller att mängden protein S utsöndras av B16F10 celler är väsentligt minskat när i närvaro av makrofager. Dessa resultat belysa djupgående förändringar av makrofag aktivering och paracrin signalering när makrofager är co-odlade med tumör celler.

Transwells co-culture-metod kan svara på en mängd olika frågor som rör paracrinsignalering. Western blot analys skulle kunna genomföras för att avgöra hur tumör-utsöndring proteiner ändra olika signalering vägar i makrofager.

X

Simple Hit Counter