Name: Collection de régions de cerveau de rongeur congelés pour des analyses en aval (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Apprenez la dissection congelée de régions cérébrales chez la souris CD-1 pour obtenir des protéines et ARN de haute qualité. Cette méthode préserve l'intégrité moléculaire pour les analyses en aval en neurosciences.

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Ce travail a été soutenu par les NIH, DA043982 et DA046196.

Les animaux utilisés dans cette étude ont été traités d’une manière éthique et humaine, comme l’ont indiqué le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de l’Indiana et les lignes directrices des National Institutes of Health (NIH).
REMARQUE : Tous les outils et surfaces doivent être lavés avec un solvant approprié pour enlever les nucléases18 avant de commencer tout travail.
1. Stockage des cerveaux
<ol><li>Retirez rapidement le cerveau des souris à papier sauvage CD1 adultes euthanasiés pesant environ 30 g à l’aide d’une approche conventionnelle13 et gèlez le flash pendant 60 secondes dans l’azote liquide ou l’isopentane pré-réfrigéré avec de la glace sèche.</li>
	<li>Conserver les cerveaux congelés à -80 oC dans du papier d’aluminium ou des tubes coniques jusqu’à leur utilisation.</li>
</ol>2. Préparation de la matrice du cerveau
<ol><li>Vingt-quatre heures avant de disséquer les tissus, placez une matrice propre du cerveau (voir tableau des matériaux)sur une pile d’emballages de congélation décongelés. Sandwich les côtés de la matrice entre deux emballages de congélation en veillant à laisser environ 0,5 cm entre le bas des fentes de rasoir et le dessus des paquets de gel (figure 1A). Déposer le papier d’aluminium sur les extrémités pour faciliter le refroidissement. REMARQUE : Lors de l’achat d’une matrice de cerveau, achetez-en une qui est assez grande pour envelopper le volume entier du cerveau pour être disséqué.</li>
	<li>Placer la boîte contenant la matrice du cerveau et les emballages de congélation dans un congélateur de -20 oC avec le dessus entrouverte pendant la nuit.</li>
</ol>3. Mise en place d’une plaque de verre congelée
REMARQUE : Le but de cette configuration est de préparer une surface gelée sur laquelle disséquer les sections cérébrales.
<ol><li>Placer la glace dans une boîte isolée jusqu’à environ 5 cm du haut. Placez ensuite une couche de glace sèche de 2,5 cm sur le dessus de la glace et recouvrez de bâches en plastique noir pour aider à visualiser l’échantillon(figure 1B, figure 1C).</li>
	<li>Placer une plaque de verre (devrait juste tenir dans l’ouverture de la boîte) sur le dessus du plastique et placer la glace sèche sur le dessus de la plaque dans les coins éloignés(figure 1C).</li>
	<li>Prenez la matrice du cerveau congelée du congélateur et insérez le cerveau pour être coupé cortex-côté vers le haut. Laissez-le équilibrer à la température dans la boîte pendant 10 min. Gardez le couvercle sur la boîte pendant ce temps.</li>
	<li>Ajuster la position du cerveau dans la matrice avec des forceps froids de sorte que le sinus sagittal et le sinus transversal s’alignent avec les rainures perpendiculaires du bloc (figure 1D). Cela permettra d’assurer des sections symétriques pour une dissection plus facile. Touchez les pointes des forceps pour sécher brièvement la glace pour refroidir avant d’ajuster le cerveau.</li>
	<li>Une fois que le cerveau est en position, placez une lame de rasoir réfrigérée près de son centre et appuyez sur la lame d’environ 1 mm dans le tissu. Ajouter les lames réfrigérées aux extrémités rostrales et caudales pour aider à maintenir le cerveau en place (figure 2A et figure 2B).</li>
	<li>À partir de l’extrémité rostrale, ajouter les lames une à la fois, les placer dans les fentes et les presser doucement vers le bas dans le tissu d’environ 1 mm (figure 2B). Continuer à ajouter des lames à intervalles de 1 mm en travaillant vers l’extrémité caudale.</li>
	<li>Assurez-vous que le cerveau ne se déplace pas pendant cette période. Alignez les lames horizontalement et verticalement(figure 2B). Afin de couper des sections en largeurs de 0,5 mm, des lames microtomes de profil bas (voir tableau des matériaux) peuvent être utilisées. Placez-les entre les plus grandes lames de rasoir(figure 2C).</li>
	<li>Une fois que les lames sont en place, appuyez sur le groupe avec les doigts, la paume ou une autre surface plane(figure 2C, figure 2D). Rock le groupe de lames lentement d’un côté à l’autre pour les déplacer à travers le tissu. REMARQUE : Cela peut prendre un certain temps (1 à 2 min) et nécessite de la patience. Il devrait y avoir une résistance aux lames qui se déplacent à travers le tissu. L’entrée facile signifie que le cerveau décongeler et le bloc doit être refroidi avec de la glace sèche.</li>
	<li>Lorsque toutes les lames ont atteint le fond des fentes, saisissez chaque côté du groupe de lames et ne marchez pas sur la matrice en se balançant d’avant en arrière. REMARQUE : Faites preuve de prudence pour éviter de se couper sur les bords tranchants des lames.</li>
	<li>Une fois que le groupe est libre, placez la pile, côté rostral vers le haut, sur la plaque de verre(figure 2E). Placer la glace sèche à côté et/ou sur le dessus de la pile pour congeler davantage les échantillons pour faciliter la séparation.</li>
	<li>Placez la pile avec des bords pointus vers le bas sur la plaque de verre et séparer les lames en déplaçant la pile entre les pouces et les doigts. Les lames doivent se séparer les unes des autres avec des sections attachées.</li>
	<li>Alignez les sections sur la plaque de verre du rostral au caudal(figure 2F).</li>
	<li>Séparer le tissu des lames en fléchissant les lames entre les doigts, ou en se séparant d’un deuxième rasoir froid(figures 2G,2H,2I).</li>
</ol>4. Sections de dissection
<ol><li>Ouvrez l’Atlas du cerveau Allen Mouse ou une autre référence et trouvez les repères nécessaires pour identifier les régions d’intérêt. Parmi les points de repère évidents, mentionnons la commissaire antérieure, le corpus callosum, les ventricules latéraux et l’hippocampe(figure 3).</li>
	<li>Retourner la section à couper avec des forceps réfrigérés et assurez-vous que la région sur le point d’être recueillie est cohérente tout au long de la section. Pendant la récolte, consultez souvent l’atlas de référence pour vous assurer que le bon retour sur investissement est obtenu. REMARQUE : Une loupe ou un microscope disséquant est souvent utile dans ce processus. Un bon éclairage est également essentiel. Des lampes LED à faible puissance ou une lampe fraîche (voir tableau des matériaux)peuvent être utilisées à cette fin.</li>
	<li>Avec un scalpel propre ou un poinçon, couper dans la section(figure 4). Préchill chaque outil avant de couper en le touchant brièvement à la glace sèche. Poussez la lame doucement mais fermement dans le tissu, en la berçant d’avant en arrière pour faire la coupe. Ne poussez pas trop fort ou le tissu se fracturera. REMARQUE : Les outils se réchaufferont avec le temps. Les lames légèrement réchauffées peuvent être utiles pour faire des coupes propres et peuvent limiter la fracturation, mais attention à éviter le dégel des tissus. Refroidir périodiquement les outils sur la glace sèche.</li>
	<li>Une fois qu’un retour sur investissement est récolté, placez-le dans des tubes étiquetés et précillés de 1,5 mL. Conserver les tissus récoltés à -80 oC jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires.</li>
	<li>Traiter les tissus congelés recueillis de cette manière en ajoutant le tampon RIPA froid (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS et cocktail inhibiteur des protéines (voir tableau des matériaux))pour l’extraction des protéines, ou un solvant contenant du guanidinium (voir tableau des matériaux) pour l’extraction de l’ARN à l’échantillon congelé et immédiatement homogénéiser à l’aide d’un dounce en verre ou d’homogéniste mécanique (voir tableau des matériaux). De cette façon, des inhibiteurs de la protéase et de la nucléase sont en place à mesure que l’échantillon se réchauffe pour protéger les protéines et les acides nucléiques contre la dégradation.</li>
</ol>

<ol><li>Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas">https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas</a> (2008).</li>
<li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li>
<li>Scanziani, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930(2009).</li>
<li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Clusters%2C+Hubs%2C+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312(2016).</li>
<li>Mitulović, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+techniques+for+proteomics+analysis%E2%80%94a+short+overview+of+latest+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li>
<li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314(2011).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269(2007).</li>
<li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAring%2C+L+%22Laser+Capture+Microdissection.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology</a>. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457(2018).</li>
<li>Björk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain%3A+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li>
<li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li>
<li>Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpijker%2C+S+%22Neuroproteomics%2C+Neuromethods%22">Neuroproteomics, Neuromethods</a>. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalkovits%2C+M+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 103, Academic Press. 368-376 (1983).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+2+edn%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+4+edn%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn</a>. , Academic Press. (1998).</li>
<li>RNaseZap. Ambion. , Available from: 
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<li>Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf</a> (2016).</li>
<li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li>
<li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li>
<li>Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+%5Bcorrected%5D+interval%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507(2013).</li>
<li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signs+of+biological+activities+of+28%2C000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050(2019).</li>
<li>Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf">http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf</a> (2011).</li>
<li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ces travaux décrivent une technique pour isoler de petites régions spécifiques du cerveau tout en limitant la dégradation de l’acide nucléique et des protéines. Les dommages aux tissus cérébraux se produisent rapidement une fois qu’un organisme meurt. Ceci est dû en partie à une accumulation rapide de glutamate extracellulaire et l’excitotoxicité résultante qui se produit21. L’ARN Messenger est particulièrement vulnérable à la dégradation22,23</...

Ce travail illustre la dissection des régions du cerveau congelées pour l’extraction de l’acide ou des protéines nucléiques de haute qualité à l’aide d’une référence, comme l’Allen Mouse Brain Atlas1, comme guide. Dans cette technique, les cerveaux sont surgelés et stockés à -80 oC pour la section et la dissection ultérieures tout en étant maintenus dans un état gelé. Ce processus permet au chercheur de récolter un grand nombre de cerveaux en une seule séance et de les disséquer plus tard pour une collecte précise de multiples régions du cerveau.
La collecte précise des régions d’intérêt du cerveau (ROIs) est souvent nécessaire lorsqu’il répond à des questions liées à l’expression des gènes et des protéines. Tandis que la pharmacologie, l’électrophysiologie et l’optogénétique peuvent être employées sur le type sauvage ou les rongeurs génétiquement modifiés pour aider à élucider les changements moléculaires qui sous-tendent les comportements observés2,,3,4,la mesure des changements induits dans les transcriptomes et les protéomes est souvent employée pour soutenir ces résultats., Des techniques telles que la réaction quantitative en chaîne de polymérase inverse (RT-qPCR), le ballonnement occidental, le RNAseq5, le MAPSeq6 et le HPLC7 sont robustes et relativement faibles en coût, ce qui permet à de nombreux laboratoires d’étudier les changements moléculaires induits dans les petites régions du cerveau2,,4,5,6.
Il existe plusieurs façons d’extraire et de purifier l’acide nuléique ou des protéines des régions du cerveau8,9,10,11,12. De nombreux laboratoires récoltent les régions du cerveau en refroidissant et en coupant les cerveaux sur la glace au moment de la récolte9,13. Bien que cette approche puisse entraîner de l’acide nucléique de haute qualité et des protéines, elle est quelque peu limitée dans le temps, car la dégradation dans le microenvironnement du tissu peut avoir lieu à ces températures. Cela peut être particulièrement vrai lorsque vous tentez de disséquer un grand nombre d’animaux ou d’IRM en une seule séance. Garder les échantillons congelés aide à maintenir les molécules cibles labiles tout en donnant au chercheur le temps de comparer soigneusement les repères des deux côtés de chaque section dans l’effort de recueillir des échantillons relativement purs. La capture au laser est une autre façon de recueillir des tissus pour l’analyse de l’ARN ou des protéines dans les zones cérébrales10. Cette procédure est supérieure à la dissection mécanique dans ce ROIs de forme très petite et irrégulièrement peut être identifiée et isolée. Cependant, la capture au laser est limitée par l’utilisation d’équipements et de réactifs coûteux, prend beaucoup de temps et peut également être plus sensible à la dégradation de l’échantillon.
La dissection de micropunch sur les tissus congelés n’est pas nouvelle. Les premiers papiers de Miklos Palkovits et d’autres décrivent les techniques de base en détail14,15. Cette présentation suit en grande partie le travail initial, avec quelques améliorations pour faciliter l’efficacité et réduire les dépenses de l’équipement nécessaire. Par exemple, les sections cérébrales sont faites dans un bloc cérébral gelé plutôt que sur un cryostat. Cela produit des sections plus épaisses qui réduisent le nombre de sections nécessaires pour recueillir des échantillons de retour sur investissement. Cette méthode disséque également des échantillons sur une plaque de verre congelée qui repose sur de la glace sèche dans une boîte isolée. Cela produit une étape de sous-gel au banc sur lequel travailler. Les sections disséquées de cette façon sont facilement manipulatibles, ce qui permet au chercheur de comparer les deux côtés de chaque section avec une référence afin de limiter la contamination des régions en dehors du retour sur investissement souhaité.
Les avantages de ce protocole sont que 1) le cerveau est maintenu dans un état gelé tout au long du processus, qui aide à préserver les protéines et l’acide nucléique et donne au chercheur le temps de récolter soigneusement les IA, et 2) les réactifs requis sont peu coûteux et se trouvent dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire. Dans ce processus, les cerveaux entiers sont sectionnés à 0,5-1,0 mm dans une matrice de cerveau et placés sur une plaque de verre congelée qui est continuellement refroidie avec de la glace sèche. Les repères trouvés dans l’Atlas du cerveau Allen1 ou d’autres atlas cérébraux16,17 sont utilisés pour identifier les régions d’intérêt, qui sont ensuite disséquées à l’aide d’un poinçon froid ou d’un scalpel. Parce que le tissu n’est jamais décongelé, les régions récoltées de cette manière fournissent l’ARN et les protéines de haute qualité pour les analyses en aval.

<table><tbody><tr><td>Matrice cérébrale coronale de souris 0,5 mm</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 505C</td><td>Bloc de coupe</td></tr><tr><td>Matrice cérébrale coronale de rat 0,5 mm Braintree</td><td>Scientific</td><td>BS-SS 705C</td><td>Bloc de coupe</td></tr><tr><td>1,0 mm Poinçon de biopsie avec piston</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL</td><td>Dot Scientific</td><td>229443</td><td>Pour le stockage des retours sur investissement congelés</td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie de 1,5 mm avec piston</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>69031-02</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie de 2,0 mm avec piston</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>69031-03</td><td></td></tr><tr><td>Gel NuPage 4-12</td> % <td>Gel Invitrogen</td><td>NPO323BOX</td><td>de gradient de protéines</td></tr> Système de <tr><td>bioanalyseur</td> Système <td>d’analyse d’ARN</td><td>Agilent</td><td>2100</td></tr><tr><td>Broyeur de tissus Millipore</td><td> Sigma</td><td> D8938</td><td>Homogénéisateur de papier en verre</td></tr><tr><td>Glace carbonique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite</td><td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td><td>Modèle 180</td><td>Cool lamp</td></tr><tr><td>Plaques de verre</td><td>LabRepCo</td><td>11074010</td><td></td></tr><tr><td>HALT</td><td>ThermoFisher</td><td>78440</td><td>cocktail inhibiteur de protéase</td></tr><tr><td>Lames à profil bas</td><td>Sakura Finetek USA Inc.</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-actine de souris</td><td>Études de développement Hybridoma Bank</td><td>JLA20</td><td>Anticorps</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>Utilisé dans l’analyse initiale de la pureté de l’ARN</td></tr><tr><td>N° 15 Lame chirurgicale</td><td>Surgical Design Inc</td><td>17467673</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Tampon de blocage</td><td>LiCor Biosciences</td><td>927-40000</td><td>Réactif</td></tr> <tr>de blocage Western<td>Omni Tissue Master 125</td><td>VWR</td><td>10046-866</td><td>Homogénéisateur de tissus</td></tr><tr><td>lapin anti-KCC2 anticorps</td> Technologie <td>de signalisation cellulaire</td><td>94725S</td><td></td></tr> Anticorps <tr><td>RNA Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>73034</td><td>Utilisé pour extraire l’ARN de petits échantillons de tissus</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel</td><td>Excelta Corp.</td><td></td><td></td>16050103</tr><tr><td>Lames de rasoir standard</td><td>American Line</td><td>66-0362</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Réactif</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Utilisé pour extraire l’ARN des tissus</td></tr></tbody></table>

collection de régions de cerveau de rongeur congelés pour des analyses en aval

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Au fur et à mesure que notre compréhension de la neurobiologie a progressé, des analyses moléculaires sont souvent effectuées sur de petites zones cérébrales telles que le cortex préfrontal médial (MPFC) ou le noyau accumbens. Le défi dans ce travail est de disséquer la zone correcte tout en préservant le microenvironnement à examiner. Dans cet article, nous décrivons une méthode simple et peu coûteuse utilisant des ressources facilement disponibles dans la plupart des laboratoires. Cette méthode préserve l’acide nucléique et les protéines en gardant le tissu congelé tout au long du processus. Les cerveaux sont coupés en sections de 0,5 à 1,0 mm à l’aide d’une matrice cérébrale et disposés sur une plaque de verre congelée. Les repères de chaque section sont comparés à une référence, comme l’Atlas du cerveau Allen Mouse, et les régions sont disséquées à l’aide d’un scalpel froid ou d’un poinçon de biopsie. Le tissu est ensuite stocké à -80 oC jusqu’à l’utilisation. Grâce à ce processus rat et souris mPFC, noyau accumbens, hippocampe dorsale et ventral et d’autres régions ont été analysés avec succès à l’aide de qRT-PCR et d’essais occidentaux. Cette méthode est limitée aux régions du cerveau qui peuvent être identifiées par des repères clairs.

Afin de valider cette méthode, le cortex préfrontal médial a été recueilli à partir de souris mâles CD1 adultes et l’ARN et la protéine ont été extraits et caractérisés. L’ARN a été analysé par électrophoresis capillaire. L’ARN dégradé affiche une perte dans l’intensité des bandes ribosomal 28S et 18S et montre également des produits de dégradation comme un frottis entre 25 et 200 nucléotides(figure 5A, échantillon 1). L’ARN de haute qualité montre des bandes ribosomal distinctes avec peu ou...

Cette procédure décrit la collecte de régions cérébrales congelées discrètes pour obtenir des protéines et de l’ARN de haute qualité à l’aide d’outils peu coûteux et couramment disponibles.

Collection de régions de cerveau de rongeur congelés pour des analyses en aval

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Cette procédure décrit la collection de régions discrètes du cerveau congelé pour obtenir des protéines et de l’ARN de haute qualité à l’aide d’outils peu coûteux et couramment disponibles. Étant donné que les régions du cerveau sont empêchées de récolter par dissection, les molécules cibles sont préservées et le chercheur a le temps de disséquer et de stocker soigneusement les régions d’intérêt. Il peut d’abord être difficile d’identifier les régions d’intérêt.L’utilisation de repères cérébraux communs au fur et à mesure qu’ils émergent et reculent à travers les sections par rapport aux régions désirées permettra d’identifier clairement. Après avoir enlevé le cerveau des souris adultes euthanasiées de type CD-1, congelez le tissu pendant 60 secondes dans de l’azote liquide ou de l’isopentane. Pré-réfrigérer avec de la glace sèche et la conserver à moins 80 degrés Celsius.24 heures avant de disséquer le tissu, placez une matrice cérébrale propre sur une pile de paquets de congélateur décongelés. Et sandwich les côtés de la matrice entre deux paquets de congélateur en s’assurant de laisser environ un demi-centimètre entre le fond des fentes de rasoir et le haut des paquets. Installe

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Micro-dissection du cerveau de rat dans différentes régions est extrêmement important pour l'étude de différentes maladies neurodégénératives. Cette vidéo montre des micro-dissection des quatre régions du cerveau majeurs comprennent bulbe olfactif, le cortex frontal, le striatum et l'hippocampe dans les tissus de cerveau de rat frais. Conseils utiles pour un retrait rapide des régions respectives afin d'éviter la dégradation de l'ARN et des protéines du tissu sont donnés.

Micro-dissection du cerveau de rat pour l&#39;ARN ou de l&#39;extraction de protéines à partir région spécifique du cerveau

Le profilage de l'expression de l'ARN de régions cérébrales murines discrètes nécessite une stratégie de collecte de tissus précise et reproductible. Un protocole utilisant à la fois la section coronale du cerveau et la microdissection assistée par un carottier tissulaire est décrit ici. Le rendement et la qualité de l'ARN total obtenu à partir des échantillons résultants confirment l'utilité de la méthode décrite.

Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l&#39;ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d&#39;expression génique

Nous décrivons un modèle de rat de trouble de stress post-traumatique (SSPT) qui révèle les altérations persistantes dans la fonction neuroendocrine et le retard à long terme, l'intervention crainte exagérée, caractéristiques des patients SSPT. Le modèle animal et les méthodes décrites ici sont utiles pour corréler des biomarqueurs dans les noyaux du cerveau, qui sont mécaniste, mais ne peut pas être mesurée chez les patients avec des biomarqueurs en globules blancs périphériques, ce qui peut.

Biomarqueurs dans un modèle animal pour Révéler Corrélats neuronaux, hématologiques et du comportement de stress post-traumatique

Cette vidéo présente un protocole détaillé, étape par étape, pour la préparation de coupes de tissus cérébraux de souris congelés pour des analyses en aval.

Traitement du cerveau d’une souris pour l’analyse en aval

Les auteurs décrivent l’utilisation de laser microdissection de saisie pour prélever des échantillons de populations cellulaires distincts de différentes régions du cerveau pour l’analyse des gènes et des micro-ARN. Cette technique permet l’étude des effets différentiels de traumatisme crânien dans des régions spécifiques du cerveau de rat.

Stéréotaxique Atlas guidée Laser Microdissection de saisie des régions cérébrales touchées par lésion traumatique

Nous présentons ici un protocole visant à geler et l’article de tissus cérébraux de plusieurs animaux comme une alternative de gagner du temps aux cerveaux unique de transformation. Cela réduit la variabilité coloration en immunohistochimie et réduit d’imagerie et de temps cryosectioning.

Cryosectioning simultanée de plusieurs cerveaux de rongeurs

Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

Différentes régions cérébelleuses ont été impliquées pour jouer un rôle dans des résultats comportementaux distincts, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents restent inconnus. Ce travail décrit une méthode pour disséquer de manière reproductible et rapide le cortex cérébelleux des hémisphères, les régions antérieures et postérieures du vermis et les noyaux cérébelleux profonds afin de sonder les différences moléculaires en isolant l’ARN et en testant les différences dans l’expression des...

Dissection régionale cérébelleuse pour l’analyse moléculaire

Nous présentons un protocole pratique, étape par étape, rapide pour l’ablation du cerveau de souris et la dissection de régions discrètes à partir de tissus cérébraux frais. L’obtention de régions cérébrales pour l’analyse moléculaire est devenue une routine dans de nombreux laboratoires de neurosciences. Ces régions du cerveau sont immédiatement congelées pour obtenir des données transcriptomiques de haute qualité pour l’analyse au niveau du système.

Microdissection du cerveau de souris en régions fonctionnellement et anatomiquement différentes

Ici nous présentons une méthode automatisée pour la détermination semi-quantitative du nombre dopaminergique de neurone dans le substantia nigra compacta de substantia de rat.

Détermination semi-quantitative de la densité des neurones dopaminergiques dans la Substantia Nigra des modèles de rongeurs à l’aide de l’analyse automatisée d’images

Apprenez la dissection congelée de régions cérébrales chez la souris CD-1 pour obtenir des protéines et ARN de haute qualité. Cette méthode préserve l'intégrité moléculaire pour les analyses en aval en neurosciences.

Collection de régions de cerveau de rongeur congelés pour des analyses en aval

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