Name: 对大鼠使用扩展的恐惧调节协议进行恐惧孵化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 38 s
Description: 了解扩展恐惧条件反射方案，用于研究大鼠恐惧孵化和情绪记忆巩固机制。该方法通过25次音调-电击配对训练，在短期和长期测试中评估情境与线索诱发的僵直反应。

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本研究的经费由孔拉德·洛伦兹大学基金会提供——资助编号9IN15151。作者谨此感谢孔拉德·洛伦兹大学传播部门在视频录制与编辑过程中提供的帮助，特别是Natalia Rivera和Andrés Serrano（制片人）。同时感谢Nicole Pfaller-Sadovsky和Lucia Medina对稿件提出的修改意见，以及Iberoamericana大学基金会院长Johanna Barrero提供的机构合作支持。作者声明不存在利益冲突。

本方案已获孔拉德·洛伦兹大学基金会机构动物护理与使用委员会（IACUC-KL）批准。遵守国际动物权利联盟（瑞士日内瓦，1989年）发布的动物权利普遍宣言以及国际实验动物科学理事会（ICLAS）发布的动物实验伦理原则。
1. 受试者准备
<ol>
	<li>选取雄性成年Wistar大鼠（n = 12），在训练和测试方案开始前，每笼饲养4只，适应环境3天。整个实验期间，大鼠可自由饮水。控制室温在20 °C至25 °C之间，光照周期为12小时光照-12小时黑暗（光照开启时间为07:00）。 
	注意：不同大鼠品系在恐惧条件化任务中表现出差异性行为。例如，Schaap等（2013）报道指出，与Fawn Hooded和Brown Norway大鼠相比，Wistar和Lewis品系表现出更长时间的僵直行为12。因此，应评估不同品系在疼痛感知和热敏感阈值方面的差异，以调整电击刺激的强度和持续时间。</li>
	<li>通过每日固定时间限制食物供给，将大鼠体重维持在其自由进食体重的85%（正常体重范围为350–400 g）。在光照周期的相同时间每天称重。在扩展恐惧条件化训练开始前，连续3天测定自由进食体重（即100%体重）。 
	注意：本实验所用动物还参与了其他未在此报告的操作性行为测试，因此需要进行食物剥夺。这种操作上的调整可能拓展本实验方案的应用范围，提示可开展操作性行为与恐惧条件化联合测试。然而，仅使用恐惧条件化测试的研究无需实施食物剥夺。</li>
	<li>将动物随机分配至以下任一组别：训练后6周进行情绪行为测试（n = 6）；训练后48小时进行情绪行为测试（n = 6）。</li>
	<li>训练与测试均在明暗周期的光照阶段、相近的时间段内进行。将动物分配至相同的实验装置，并在训练和测试过程中保持相同的个体顺序。 
	注意：可额外设置对照措施，即在训练和测试阶段对动物顺序进行交叉平衡。当涉及多个组别或跨实验应用不同任务时，建议采用此技术，以减少任务顺序对行为结果可能产生的影响。</li>
</ol>
2. 仪器设置与刺激校准
<ol>
	<li>使用10%乙醇清洁实验箱和不锈钢栅格地板的所有内表面。每次测试动物前均需重复此步骤。</li>
	<li>通过USB线缆将设备连接至计算机，并启动冻结检测系统设备：CPU、控制箱、红外光源、厌恶刺激发生器/乱码器以及电击强度校准仪。 
	注意：尽管本实验方案使用的是 commercially available instruments（材料表中列出），但也可使用其他品牌的设备和软件。该装置由一个嵌入塑料包覆木质箱体内的丙烯酸内腔（29.53 cm × 23.5 cm × 20.96 cm，称为实验腔）组成，外层箱门可隔绝声音、噪音和光线（隔音箱门）。摄像头位于外门内侧侧面。内部丙烯酸箱底部设有金属栅格地板（36根直径3 mm、中心间距8 mm的不锈钢棒），可用于传递足底电击。在其中一个内侧壁上，距地面6 cm处安装有一个扬声器，用于播放听觉提示信号。</li>
	<li>将电击强度校准仪的红色和黑色夹子（即正极和负极连接器）连接到栅格地板上的任意两根不同金属棒上。将USB线缆连接至计算机对应的端口。确保红色和黑色夹子所夹的金属棒之间至少间隔一根金属棒。 
	注意：本节描述的是使用材料表中提及的特定品牌设备进行电击强度校准的过程。然而，也可使用其他品牌设备完成校准。建议在栅格地板的三个区域分别进行电击强度校准，以验证其一致性。此外，务必清除栅格地板上的粪便和尿液残留物，以避免电击传递过程中产生干扰。</li>
	<li>启动电击强度校准软件（材料表）。在软件界面中点击量程箭头，选择1.0 mA的电击强度，然后将运行/停止开关切换至“运行”状态。 
	注意：我们建议采用1.0 mA的电击强度，该数值基于本实验室在啮齿类动物模型中的研究结果，以及文献报道中认为0.75 mA至1.5 mA适用于恐惧条件化研究33,34,35。</li>
	<li>打开厌恶刺激发生器或用于传递足底电击的设备，观察软件界面上显示的电击强度。如有需要，使用厌恶刺激发生器上的旋钮将电击强度调节至1.0 mA。 
	注意：厌恶刺激发生器应设置为“OUT”模式，以确保实验的正确测试、校准和运行。</li>
</ol>
3. 冷冻检测系统的校准
<ol>
	<li>关闭实验腔室和隔音箱的门。此时不要引入动物，因为动物将在完成冰冻检测系统校准后才放入腔室内。检查箱内光照强度是否在20至30勒克斯之间。</li>
	<li>启动冷冻检测系统软件并打开 实验设置 对话窗口。输入每个受试者的信息（如受试者编号、日期和分组），并加载名为“Training protocol VFC.pro”的文件（可从以下网址获取） <a href="http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ">http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ</a>). 
	注意：情境测试和线索测试使用不同的程序配置，因此请确保在每次测试中使用正确的文件。目前，正确的文件对应为“Training protocol VFC.pro”。请记住，在测试阶段所使用的文件将与训练阶段的不同。</li>
	<li>选择相应的相机并检查 保存视频 选项（如有需要）。设置 运动阈值 至100，以及 最短冷冻时间 至30帧。 
	注意：该运动阈值基于所用物种的大小（以像素数量为依据）。最小冻结持续时间由制造商推荐。这些数值用于确保准确识别动物在实验箱中的状态。</li>
	<li>确认所选摄像头的实时画面显示在屏幕上，同时显示运动阈值图以及训练过程中呈现的不同刺激（如声音和电击）的时间线。 
	注意：若使用不同品牌的设备，其设置应具备测量动物运动的能力，以获得可反映运动状态的“运动指数”，从而比较动物处于运动或静止状态的时间长短。另一种方法是使用仅需视频源（实验过程中或实验结束后）即可检测动物运动或静止时间的软件，例如免费软件 ImageFZ。13，Matlab中的开源工具箱14，或一种用于动物行为分类的开源工具 JAABA15.</li>
	<li>点击 校准 选项三次，同时确保运动指数保持在100以下（阈值）。然后，将设备设置为 锁定 通过点击屏幕上的相应按钮。 
	注意：本节描述了使用列于清单中的特定品牌设备进行冰点检测系统校准的流程 材料表如前所述，校准过程可以使用不同品牌的设备完成（关于设备和软件的不同选择，参见 Anagnostas et al. 2010）。16.</li>
</ol>
4. 延长的恐惧条件反射训练
<ol>
	<li>将大鼠置于其饲养笼中，笼上覆盖布料，从动物饲养设施运送至实验室的行为训练室。在运送过程中，避免动物暴露于噪音或可能引起应激的环境中。若同时运送多只动物，仅将待测动物带入训练室，其余大鼠应保留在暂存房间，以增强实验控制。在开始训练前，轻柔地抓握动物并进行 2 分钟的处理。 
	注意：在本方案中，动物每天在行为训练前均需接受 2 分钟的手动处理。处理结束后，将动物放入实验腔室。建议对动物进行操作，使其适应研究人员的存在。</li>
	<li>将大鼠放入实验腔室。用手轻握其尾根部，将其放置于腔室中央。关闭实验腔室及隔音箱的门。</li>
	<li>点击 Record 按钮开始实验。让大鼠在腔室内适应 3 分钟。此 3 分钟时段为设备制造商推荐的标准时长，用作基线期及对腔室环境的适应时间。</li>
	<li>在实验第 3 分钟开始，以 60 秒的试次间间隔（ITI）递送二十五次声音-电击配对（试次）。在每个 ITI 的最后 10 秒呈现声音（条件刺激 – CS；90 dB SPL，2000 Hz，50 ms 上升时间），并在每个 ITI 的最后 2 秒施加电击（非条件刺激 – US）。 
	注意：Record 按钮的激活前提是摄像头已正确校准并锁定。</li>
	<li>28 分钟的实验结束后，将大鼠从实验腔室中取出，放回其相应的饲养笼中。用覆盖布料的饲养笼将大鼠从行为训练室运回动物饲养设施。</li>
	<li>重复进行僵直检测系统校准（步骤 3.1–3.5）及恐惧条件反射训练（步骤 4.1 和 4.3），以完成所有受试动物的训练。 
	注意：我们强烈建议为每只动物重新校准检测系统，以确保软件在处理僵直检测信息时保持参数一致。</li>
	<li>静息期：在此期间，将动物单独保留在其饲养笼中休息。在为期 6 周的孵育期内，每周监测动物体重两次。在称重过程中，对每只动物进行 2 分钟的轻柔操作。</li>
</ol>
5. 情境测试——单次10分钟会话
<ol>
	<li>训练阶段结束后，将动物暴露于首次记忆测试，称为情境测试。在此10分钟阶段中，将大鼠置于训练时相同的环境中，但不呈现任何线索或电击。用覆盖的家用笼子（例如，用布覆盖）将大鼠从动物饲养设施转运至行为训练室。需注意，动物已被分为不同组，因此一组在训练阶段后48小时进行测试，另一组则在训练后6周进行测试（见图1）。</li>
</ol>
<img alt="恐惧条件反射实验示意图；两组小鼠的声刺激-电击配对及测试流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60537/60537fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：实验时间线。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60537/60537fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>使用10%乙醇清洁实验箱和不锈钢网格地板的所有内表面。每次测试动物前均需重复此步骤。</li>
	<li>重复冰冻检测系统的校准（步骤3.1至3.5）。打开Experiment setup对话窗口，并加载名为“Context test protocol.pro”的文件，该文件可从<a href="http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ">http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ</a>获取。 
	注意：该文件包含本实验阶段的设置，不包含任何电击或声音刺激。</li>
	<li>将动物放入实验箱中。轻轻抓住其尾根部，将其放置于箱体中央位置。关闭实验箱及隔音箱的门。</li>
	<li>点击Record按钮开始实验。在此单次10分钟的情境测试阶段中，不呈现任何刺激（无电击，无声音）。</li>
	<li>当10分钟测试结束后，将动物从实验箱中移出。将其放回各自的饲养笼中，并将盖好盖的家养笼具从行为训练室运送至动物饲养设施。重复步骤5.2-5.5，以完成所有动物的测试。</li>
</ol>
6. 线索测试——单次13分钟会话
<ol>
	<li>在情境测试后的第二天，让动物接受第二次记忆测试，称为 线索测试在此阶段，大鼠将处于与训练不同的环境中，持续13分钟；呈现提示性刺激（声音），但不给予电击。将大鼠连同其饲养笼（加盖覆盖物）从动物饲养设施转运至行为训练室。一组大鼠在恐惧条件反射训练后72小时进行测试，另一组在训练后6周又1天进行测试。图1). 
	注意：可采用不同的运输系统（从动物饲养室到实验房间）以更明确地区分情境测试与线索测试。由于动物在训练阶段和情境测试阶段均以其居住笼具进行运输，因此在线索测试阶段的运输过程中，可使用不同的运输笼具、垫料和/或笼盖。</li>
	<li>用10%乙醇清洁实验箱体内所有内表面及不锈钢网格地板。每次测试动物前均需重复此步骤。</li>
	<li>为改变视觉环境，将塑料围壁插入实验腔室中。</li>
	<li>为改变嗅觉环境，将1%乙酸涂抹于棉签上，并将其置于网格地板下方的金属托盘中17,18,19.</li>
	<li>重复冷冻检测系统的校准（步骤 3.1–3.5）。加载名为“Cue test protocol.pro”的文件，该文件可从 <a href="http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ">http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ</a>. 
	注意：该文件包含本实验阶段的设置，即呈现训练阶段相同的音调（条件刺激，CS），但不伴随电击（非条件刺激，US）。</li>
	<li>将动物引入实验舱。轻轻抓住其尾根部，将其放置于实验舱中央。关闭实验舱及隔音箱的门。</li>
	<li>通过点击开始会话 记录 按钮。在单次持续13分钟的线索测试阶段，条件刺激（声音）共呈现10次，首次呈现始于该阶段的第3分钟。 
	注意：前 3 分钟对应本阶段的基线期，随后进行 10 次线索测试试验（每次持续 10 秒），试验间间隔（ITI）为 50 秒，期间不给予电击。声音刺激的呈现通过预先加载的文件自动完成。</li>
	<li>实验结束后，当13分钟的实验周期完成时，将动物从实验箱中取出。将动物放回各自笼中，并加盖运送至动物饲养设施。重复步骤6.2至6.5，以测试所有受试动物。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>使用僵直检测系统软件从视频流中获取一般活动指数（即运动指数）。该软件会自动将运动指数转换为每次实验阶段的僵直时间百分比和僵直发作次数。将僵直阈值设定为系统的默认最小僵直持续时间设置（1 秒 = 30 帧）。</li>
	<li>使用额外的自定义程序（文件可从 <a href="http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ">http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ</a> 获取）来获得以下数据：
	<ol>
		<li>使用该程序确定训练阶段前 3 分钟期间（即基线僵直，因为在该 3 分钟期间之前或期间未呈现任何电击或提示音）以及线索测试阶段前 3 分钟期间的僵直百分比。</li>
		<li>使用该程序确定训练阶段中每个 3 分钟时间段（共八个 3 分钟区间）的僵直百分比。</li>
		<li>使用该程序确定在训练阶段和线索测试阶段中，提示呈现期间（即提示音期间的僵直）和无提示期间（即试次间间隔；ITIs）的僵直百分比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为获取这些数据，请打开僵直检测系统软件。
	<ol>
		<li>选择 文件 | 报告 | 批量组件摘要。</li>
		<li>选择扩展名为 .CMP 的文件，该文件可从 http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ 获取。</li>
		<li>命名输出文件，并将运动阈值更改为 100。然后点击 确定。</li>
		<li>选择待分析的文件（扩展名为 .RAW）。这些文件在每次实验结束后由僵直检测系统软件自动生成，对应于各次实验的原始数据。初始时，这些文件保存在计算机桌面上，但也可存储于自定义文件夹（例如“文档-恐惧条件反射”）中，以便后续识别和打开用于分析。</li>
		<li>打开输出文件（扩展名为 .CSV），可在电子表格软件中进行编辑以进一步分析。该文件包含实验阶段期间僵直行为的结果。 
		注：为获得总僵直百分比，需将受试动物静止不动的时间除以整个实验阶段的总时间。僵直发作次数可通过统计整个实验阶段中僵直事件的次数来计算。在这两种情况下，均需基于最小僵直持续时间设定运动阈值。这是定义是否记录一次僵直事件的时间标准。自动记录系统可使用每秒若干帧（fps）作为最小僵直持续时间的度量单位。例如，在采样速率为 30 fps 时，若设定最小僵直持续时间为 15 帧，则系统将记录持续至少 0.5 秒的静止不动为一次僵直事件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将每次实验（训练阶段及两种测试阶段：情境测试和线索测试）的总僵直持续时间（以秒为单位）除以总僵直发作次数，计算每次实验中每个僵直发作的平均持续时间。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本延长恐惧条件化方案是一种有效且可靠的方法，可用于评估短期（48小时）和长期（6周）的情绪记忆。因此，该方案可用于研究大鼠的过度训练和恐惧孵育现象。该方案具有多项优势，具体如下：首先，它提供两种类型的记忆测试，即情境测试和线索测试，能够识别两种延迟时间（48小时和6周）在情境与线索操控下的差异性效应；其次，该任务仅需一次28分钟的训练，即可产生持续数周的长期效应。这一优势尤为显著，因为某些延长恐惧条件化的版本需要在10次训练中至少给予100次电击11；第三，该方案提供多种测量指标，且均可自动计算。此外，已有越来越多的药理学、生理学和解剖学证据支持该范式在评估情绪记忆现象方面的有效性15,16。
与其他训练时间较短（即试验次数较少）的恐惧条件化范式相比，导致过度训练效应的延长性实验方案受到的关注较少。然而，延长性恐惧条件化任务对于理解恐惧孵育（fear incubation）背后的行為和神经生物学过程至关重要，包括其与其...

记忆是一种包含多个阶段的心理过程：信息获取、巩固（使获取的信息保持稳定）以及提取（巩固过程的证据）1。在巩固阶段，会形成新的突触连接并对已有的连接进行修饰。这表明需要一段时间，以完成负责这些变化的分子和生理事件1,2。这些生理或分子变化会因所提取的事件是否带有情绪色彩而有所不同（即情绪记忆）。例如，研究表明，侧核和基底外侧杏仁核复合体在情绪记忆中具有特别重要的作用3,4,5。
情绪记忆现象的研究主要采用恐惧条件化范式5,6。恐惧条件化是一种学习形式，个体通过该过程学会将厌恶性事件与原本中性的刺激关联起来7。恐惧条件化范式可在杏仁核中引发分子、细胞及结构层面的变化。此外，在情绪记忆的巩固和提取过程中，恐惧条件化还会改变海马体的连接性。
研究恐惧记忆最常用的方法之一是在大鼠中进行经典（巴甫洛夫式）条件反射实验。该方法通常以足底电击（非条件刺激，US）作为厌恶刺激，在一次或多次训练阶段中施加一次或多次。接受该程序处理的大鼠所表现出的条件反应（CR）为僵直反应（即“除用于呼吸的肌肉外，动物骨骼肌产生普遍性强直反应所导致的全身性静止不动”7）。这种反应可通过两种类型的测试进行评估：情境测试和线索测试。在情境测试中，受试动物在训练阶段接受一定次数的足底电击，随后被移出实验装置一段时间。在测试阶段，动物被重新放回先前接受训练的相同环境中，在不施加足底电击的情况下记录其僵直行为的各项指标（例如僵直持续时间、僵直时间百分比或僵直发作频率），并与训练阶段建立的基线水平进行比较。对于第二种测试——线索测试，在训练阶段将一个刺激（通常为声音）与足底电击配对呈现（即条件刺激，CS）。训练结束后，动物被移出训练环境一段时间，随后被置于一个经过改造的新环境中（例如具有不同墙形和气味的另一实验装置）。然后将条件刺激重复呈现若干次，记录动物对线索的僵直反应，并与训练阶段获得的基线水平进行比较。该实验范式最常见的形式是在单次训练阶段内进行1至3次声音-电击配对，随后在数小时或数天后进行情境测试和线索测试。
其他较少实施的恐惧条件化程序涉及大量电击-线索配对（即试验次数），通常被称为过度训练程序8。人们对这些任务日益增长的兴趣源于其持久且增强的记忆效应，即恐惧孵育现象（指在不进一步暴露于厌恶事件或条件刺激的情况下，条件性恐惧反应随时间推移而增强）9,10,11。此类过度训练程序的一个示例包括一个训练阶段，共进行100次声音-电击配对，分布在10个会话中，随后分别在48小时和30天后进行情境和线索测试11,12。为避免将训练扩展至多日，Maren（1998）报道，通过单次会话中进行25次配对即可建立并优化过度训练效果8。孵育效应表现为：训练后31天测试的大鼠其条件性恐惧水平显著高于训练后48小时测试的大鼠。扩展的恐惧条件化任务对于理解恐惧孵育背后的行为学和神经生物学机制至关重要，包括其与其他心理现象的关系（例如延迟发作的创伤后应激障碍）11,12,13。
本文描述了一种可诱导大鼠过度训练和恐惧孵育的扩展型恐惧条件化方案。与需要数天训练的其他范式不同11，本方案聚焦于单次训练阶段8。我们采用&#160;25 次音调-电击配对，以在训练6周后进行的环境和线索测试中产生更强的条件性僵直反应，相较于训练48小时后的测试结果更为显著。

<table><tbody><tr><td>乙酸（ethanoic acid）</td><td></td><td></td><td>https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid</td></tr><tr><td>厌恶刺激电流套餐</td><td>MED Associates Inc</td><td>ENV-420</td><td>https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/</td></tr><tr><td>情境测试方案。</td><td></td><td></td><td>http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ</td></tr><tr><td>线索测试方案.pro</td><td></td><td></td><td>http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ</td></tr><tr><td>弧形壁插件</td><td>MED Associates 公司</td><td>VFC-008-CWI</td><td>https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/</td></tr><tr><td>数据处理.zip</td><td></td><td></td><td>http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ</td></tr><tr><td>近红外/白光控制箱</td><td>MED Associates Inc</td><td>NIR-100</td><td></td></tr><tr><td>小鼠快速更换底盘/托盘单元</td><td>MED Associates Inc</td><td>ENV-005FPU-M</td><td>https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/</td></tr><tr><td>小型台式机柜及电源</td><td>MED Associates Inc</td><td>SG-6080D</td><td>https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/</td></tr><tr><td>独立式厌恶刺激发生器/随机化器（115 V / 60 Hz）</td><td>MED Associates 公司</td><td>ENV-414S</td><td>https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/</td></tr><tr><td>标准恐惧条件反射实验箱</td><td>MED Associates 公司</td><td>VFC-008</td><td>https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/</td></tr><tr><td>训练方案 VFC.pro</td><td></td><td></td><td>http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ</td></tr><tr><td>大鼠恐惧条件反射视频套装</td><td>MED Associates Inc</td><td>MED-VFC-SCT-R</td><td>https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/</td></tr></tbody></table>

使用延长恐惧条件化方案的大鼠恐惧孵育

Fear Incubation Using an Extended Fear-Conditioning Protocol for Rats

情绪记忆的研究主要采用恐惧条件化范式。恐惧条件化是一种学习形式，个体通过该过程学会厌恶事件与原本中性刺激之间的关联。研究情绪记忆最常用的方法是在大鼠中进行恐惧条件化实验。在这些任务中，非条件刺激（US）为足底电击，可在单次或多次训练会话中呈现一次或多次，而条件反应（CR）则是僵直行为（freezing）。其中一种被称为线索化恐惧条件化的实验版本，在训练阶段将声音（条件刺激，CS）与足底电击（US）配对呈现。在第一次测试中，动物被置于与训练时相同的环境中，检测其在无电击且无声音情况下的僵直反应（即情境测试）。在第二次测试中，通过改变环境（例如调整实验箱的气味和墙壁）并在无电击的情况下播放声音，来测量动物的僵直反应（即线索测试）。大多数线索化恐惧条件化实验仅包含少量的声音-电击配对（例如，单次会话中的1-3次试验）。近年来，研究者对较少见的、包含大量配对次数（即过度训练）的实验版本日益关注，这类训练与一种称为恐惧孵化的持久效应相关（即在不再接触厌恶事件或条件刺激的情况下，恐惧反应随时间增强）。扩展型恐惧条件化任务对于理解恐惧孵化的行为学和神经生物学机制至关重要，包括其与其他心理现象（如创伤后应激障碍）的关系。本文介绍一种可在大鼠中引发过度训练和恐惧孵化的扩展型恐惧条件化方案。该方案包括一次包含25次声音-电击配对（即过度训练）的训练会话，并在训练后48小时（短期）和6周（长期）分别进行情境测试和线索测试，比较条件化僵直反应的变化。

使用配对t检验对所有受试动物（n = 12）在训练过程不同阶段的僵直时间百分比变化进行了分析（表1）。在训练阶段的前3分钟内（实验方案的第一天），动物处于活跃状态并探索实验箱，此期间未给予任何声音或电刺激（即基线期-BL）。如图2A所示，在随后的25次声-电刺激配对期间，僵直时间百分比（M = 48.88；SE = 4.37）显著高于基线期（M = 14.65；SE = 4.05），该结果被视为恐惧习得的指标。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody fo:keep-with-next.within-page="always">
		<tr>
			<td>统计检验</td>
			<td><stron...

我们描述了一种扩展的恐惧条件化方案，可在大鼠中诱导过度训练和恐惧孵育。该方案包括一次包含25次声刺激-电击配对（即过度训练）的训练阶段，并在训练后48小时（短期）和6周（长期）分别比较在环境和线索测试中的条件性僵直反应。

情绪记忆的研究主要采用恐惧条件化范式。恐惧条件化是一种学习形式，个体通过它学会……

记忆是一种心理过程，包括信息获取、巩固和提取等多个阶段。在巩固阶段，会形成新的突触连接并对已有的连接进行修饰。这一巩固过程依赖于刺激的强度，当刺激具有情绪相关性时，记忆痕迹更为强烈。大多数关于情绪记忆的研究主要集中在杏仁核及其与其他脑结构的关系上，这些现象主要通过恐惧条件化范式进行研究。恐惧条件化是一种学习形式，能够建立厌恶事件与原本中性刺激之间的关联。在哺乳动物中，最广泛使用的方法之一是经典条件反射，也称为巴甫洛夫条件反射，包括啮齿类动物和人类。以啮齿类动物为例，条件刺激（CS）通常是一幅图像，该图像在一次或多次实验过程中呈现一次或多次。恐惧条件化实验方案通常包含一到两次声音刺激与电击的配对。然而，其他较少使用的厌恶刺激则涉及长时间的非致伤性电击。这种训练方式被称为厌恶训练，可产生一种持久的记忆效应，称为恐惧孵育。恐惧孵育是指条件性反应的强度随着时间推移而增强，这种现象可能在进一步暴露于其他类似事件或条件性刺激后加剧。近年来对恐惧孵育在行为学和神经生物学层面的研究进展，揭示了其与其他啮齿类动物行为及心理现象的关联，包括某些精神障碍的延迟反应。本文描述了一种在人类中扩展的恐惧条件化范式，我们在20次实验后，分别于48小时及六周时检测了情境性记忆和线索相关记忆。这使我们能够测试情绪记忆随时间的强度变化。选取12只成年雄性Wistar大鼠，每4只一组饲养在笼中，实验期间自由饮水。将大鼠维持在其自由进食体重的85%，每天在相同时间给予限量食物。将受试者随机分配至以下组别：训练后六周进行情绪测试。训练后48小时进行情绪测试。使用10%乙醇溶液清洁实验箱体和网格地板的所有内表面。将电击强度校准仪上的红色和黑色夹子连接到栅格地板的两根金属棒上。将USB线缆连接到计算机的相应端口。启动电击强度校准仪软件。通过点击按钮选择应用中一个毫安强度的电流。然后将运行/停止开关切换至运行状态。操作厌恶刺激器，并观察应用面板上显示的电击强度。如有需要，使用厌恶刺激仪上的旋钮将强度调整至一毫安。关闭实验舱并关闭叙述盒的声音。启动僵直检测系统软件，并打开实验对话窗口。输入每个受试者的详细信息并加载训练方案文件。选择相应的摄像头，并勾选侧面视频选项。将运动阈值设置为100，最小冻结帧数比设置为13帧。确认所选摄像头的实时画面显示在屏幕上，同时显示运动阈值图以及训练过程中呈现的不同刺激的时间线。在检查运动指数保持在100以下的同时，连续单击三次“校准”选项，然后通过单击屏幕上相应的按钮选择要锁定的设备。将实验对象放入实验箱中。点击记录按钮开始实验，共进行25次声音-电击配对或试验，每次试验间间隔60秒，从实验开始时计时。在每次试次间隔的最后10秒呈现声音刺激，在每次试次间隔的最后2秒给予电击。28分钟实验结束后，将大鼠从实验箱中移出。将动物放回各自的家庭饲养笼中。将大鼠放于其所在的家笼柜中，从行为训练室转运至动物饲养设施。根据所分配的组别，大鼠分别保持48小时或六周不接受任何处理。在此期间，动物在其饲养笼中休息，并单独饲养。在六周的孵育期内，每周两次监测动物的体重。称重时，轻轻操作每只动物，持续两分钟。可在计时后48小时对六只动物进行测试。这六只动物必须在六周后再次进行测试。重复进行冰冻检测系统的校准。加载文件名和上下文测试协议。通过点击记录按钮开始会话。在此单次10分钟的上下文测试会话期间，不呈现任何刺激。在情境测试后的第二天，根据分组对每只动物重复以下步骤。为改变视觉环境，将一个塑料围壁插入实验箱中。为改变嗅觉环境，将1%的乙酸涂抹于固定在棉签上的棉球上。将其放置在金属托盘中，位于网格地板下方。使用不同的文件重复冷冻检测系统的校准。加载名为“Cue test protocol”的文件，通过点击记录按钮开始实验。在此次持续15分钟的线索测试阶段中，条件刺激音调从第3分钟开始呈现，共呈现10次。即共进行10次线索测试试验，各试验之间以相同的间隔时间分隔，且不伴随电击。使用额外的自定义编程程序，获取训练阶段和线索测试阶段中对音调产生僵直反应的百分比。每个训练阶段八个三分钟时间段内动物的僵直百分比。C 训练阶段前三分中的僵直百分比。由于在该三分钟期间未呈现任何电击或提示信号，因此可将此最后一项测量视为基线僵直水平。要获取此数据，请打开冷冻检测系统软件并按照以下步骤操作：选择“文件”、“报告”、“工作台组件摘要”，然后选择开放科学框架免费存储库中可用的 cmd 文件，输入名称后打开文件。将运动阈值更改为100，然后单击“确定”。选择要分析的文件。打开的文件可以在Microsoft Excel中打开，以进行进一步分析。最后，通过将每次实验的总僵直持续时间除以僵直发作的总次数，计算每次僵直发作的平均持续时间。在三分钟基线期期间，动物处于活跃状态并探索实验箱。与后续阶段相比，基线期的僵直时间显著更短，这表明已形成恐惧习得。将试验阶段按每三分钟划分为若干区间后发现，在前三个电击试验期间，僵直时间所占百分比已达到平台期。这一发现与既往研究结果及其他训练的指示一致。在训练期间，所有动物的僵直百分比显著高于基线期。训练六周后接受测试的动物在情境测试中的僵直百分比显著高于训练后48小时接受测试的动物。在训练和记忆测试之间未观察到僵直时间的差异。通过其他指标进一步分析了不同组受试者在情境测试中的僵直反应。训练后六周接受测试的受试者活动水平显著低于条件化训练后48小时接受测试的动物。训练后不久接受测试的动物的僵直时间显著短于训练后六周接受测试的动物。这些结果表明存在恐惧孵育效应。对每次僵直反应的厌恶程度进行分析后发现，在条件刺激后48小时接受测试的动物比训练后48小时接受测试的动物表现出更长的僵直持续时间。在训练阶段基线期和线索测试中的所有动物的僵直百分比显著低于线索测试的测试期。仅在六周后进行线索测试的动物，其基线期僵直程度与线索测试的测试期相比存在显著差异。线索训练期间的平均僵直程度显著低于六周后线索测试期间的平均僵直程度。在提示测试中，试验间歇期的平均僵直程度显著低于48小时后训练阶段试验间歇期的平均僵直程度。本文描述了一种扩展的恐惧条件化方案，可在恐惧孵育大鼠中产生过度训练效果。该方法是一种有效且可靠的方法，可用于评估短期（48小时）和长期（六周）的情绪记忆。有大量的药理学、生理学和解剖学证据支持其在评估情绪记忆现象方面的有效性。该方案具有多种优势，其中包括：首先，前两种记忆测试类型，即情境记忆和线索记忆测试。该测试能够识别出针对情境和线索的测试所产生的不同效应。其次，仅需一次28分钟的训练即可产生持续数周以上的长期效应。考虑到某些典型恐惧条件化实验需要在10次训练中至少施加100次电击，这一优势尤为显著。恐惧反应提供了多种可自动计算的测量指标。与其他具有短暂训练阶段的恐惧条件化范式相比，产生厌恶训练效应的延长方案受到的关注较少。与此类厌恶训练相关的一个重要现象是恐惧孵育，该现象直到最近才在行为学和神经生物学层面开始被理解。并且似乎与其他现象相关，包括创伤后应激障碍的延迟发作。关于这些方案的最佳实施与研究，最终建议包括：正确清洁实验箱，特别是抓握地板；在开启电击刺激前进行校准，以及对电击强度和僵直检测系统的校准。该方案可用于测试所有品系的大鼠或其他啮齿类动物。在这些情况下，调整运动阈值和电击强度非常重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

对大鼠使用扩展的恐惧调节协议进行恐惧孵化

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小鼠痕迹性恐惧条件反射实验

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一种研究僵直与逃跑行为的新型巴甫洛夫恐惧条件反射范式

为了研究在恐惧情境下的逃跑行为，我们引入了一种改良的恐惧条件化方案。该方案可确保小鼠在恐惧条件化过程中呈现提示信号时持续表现出逃跑行为。...

改良恐惧条件化以诱导小鼠飞行行为

观察性恐惧范式通过检测啮齿类动物的替代性僵直行为来评估情感共情。该实验流程包括使观察者啮齿类动物接触接受厌恶足底电击的同种示范者，以诱发共情相关的僵直反应。通过采用观察性恐惧检测方法，研究人员能够探究情感共情背后的神经机制。...

小鼠中作为情感共情模型的观察性恐惧

本文介绍了一种利用视频分析系统评估小鼠恐惧学习与记忆的场景性和提示性恐惧条件反射实验方案。...

使用视频分析系统对小鼠进行情境与线索性恐惧条件反射测试

在威胁概率任务中，通过检测眼轮匝肌的肌电图，测量在低（不确定）和高（确定）概率电击威胁条件下惊吓反射的增强情况。该方法可为精神病理学、物质使用/滥用以及广泛的情感科学领域的研究提供对不同负面情绪状态（恐惧/焦虑）的客观测量。...

利用威胁概率任务评估不确定与确定威胁下的焦虑与恐惧

为小鼠提供环境富集需要复杂的挑战性设置，以及全面的饲养管理和操作技术，以确保小鼠产生稳定的代谢和抗肿瘤效应。本方案提供了详细的操作步骤，用于在小鼠中重现上述效应。...

一种小鼠丰富环境饲养方案

了解扩展恐惧条件反射方案，用于研究大鼠恐惧孵化和情绪记忆巩固机制。该方法通过25次音调-电击配对训练，在短期和长期测试中评估情境与线索诱发的僵直反应。

使用延长恐惧条件化方案的大鼠恐惧孵育

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