Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry
Chapters
Summary January 29th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.
Transcript
Tüm monte immünohistokimya etiketli antikorlar kullanarak doğrudan bir doku veya organizmada proteinlerin mekansal ve zamansal gözlem sağlayan nispeten hızlı ve basit bir tekniktir. Bu tekniğin yararı, ilk bölüme gerek kalmadan bozulmamış bir doku veya organizmanın boyanmasına izin verir ve konfokal mikroskopi protein ekspresyonu deseninin üç boyutlu bir temsilini oluşturmak için kullanılabilir. İmmünohistokimya yaygın olarak hastalığın altında yatan etiyoloji ve moleküler mekanizmaları anlamak için biyomedikal araştırmalarda kullanılır.
Patolojik örneklerdeki tümörleri tanımlamak için değerli bir tanı aracıdır. Başlamak için, sistem suyu ile dolu ve yerinde bir örgü veya oluklu astar ile yumurtlama tankları hazırlamak. Yetişkin zebra balığı karışık seks çiftleri bir gecede tanklarda gruplar halinde yerleştirin.
14 saat/10 saatlik açık/koyu bir döngü kullanın ve ışıklar 9 a.m'de yanmakta. Ertesi sabah, ışıklar açıkken, dışkıkaldırmak için yumurtlama tankı suyunu tatlı sistem suyuyla değiştirin. Yumurtalar yumurtladıktan sonra, yetişkinleri ev tanklarına geri döndürün.
Bir transfer pipet kullanarak onları çizerek yumurta toplamak. Embriyo medyumuyla yarı yolda doldurulmuş her Petri kabına 50 yumurta aktarın. Ölü veya bölmek için başarısız herhangi bir opak ve bulutlu yumurta çıkarın.
Yumurta yemeğini 28,5 santigrat derecede, döllenmeden 23 saat sonraya kadar kuluçkaya yatırın. Embriyolar döllenme sonrası 24 saatten daha yaşlıysa, bir pipet ile embriyoları melanogenezi önlemek için embriyo ların 200 mikromolar PTU'ya aktarılması. Stereo mikroskop altında, ultra ince uçlu forceps kullanarak yumurtadan çıkmamış embriyolar dechorionate.
Hasarı en aza indirmek için ateşle cilalı Pasteur pipetleri kullanarak, embriyo ortamda çözünmüş %1-2 agarose ile kaplanmış cam veya plastik Petri kaplarına aktarın. Daha sonra embriyoları plastik veya ateşcil li pipet kullanarak 1,5 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın. Bir mikropipet ile embriyo orta çıkarın.
Sadece embriyoları kapsayacak kadar sıvı bırakın. Oda sıcaklığında hafif sallanan ile bir ila iki saat boyunca% 4 PFA içinde embriyolar düzeltin. Daha sonra, embriyoları 1X PBS'de üç kez ve %1 PBTriton'da beş dakika yıkayın.
Hemen embriyoları kullanın veya bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. Uzun süreli depolama için, dehidrat ve eksi 20 santigrat derece% 100 metanol embriyolar saklayın. Embriyolar rehydrate için, son yıkama için metanol ve PBS ve PBTriton azalan miktarlarda oda sıcaklığında beş dakika her seri kuluçka gerçekleştirin.
El yazmasına göre embriyo hazırlığına devam edin. İkincil antikor konak türleri eşleşen bir engelleme çözeltisi seçin, örneğin PBTriton%10 keçi serumu ile veya BSA mililitre başına iki miligram olmadan. Embriyo içeren tüpe 0,5 mililitre bloke çözeltisi ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında 1-3 saat boyunca bir kayanın üzerine yerleştirin.
Daha sonra embriyoyu tıkalı çözeltide seyreltilmiş birincil antikorda kuluçkaya yatırın ve pbtriton bir gecede dört derece santigrat derece sallanırken. Sabahları, embriyoyu PBTriton'da beş kez 10'er dakika boyunca oda sıcaklığında yıkayın. Daha sonra 488 nanometrede birincil antikor ve istenilen dalga boyundaki ana türe dayalı ikincil bir antikor seçin.
Embriyo içeren tüp içine engelleme çözeltisi seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin. Boruyu alüminyum folyo ile kaplayın ve sallarken oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, alüminyum folyo ve sallanan kaplı iken 10 dakika oda sıcaklığında her biri için PBTriton üç kez embriyoları yıkayın.
Bir pipet ile, embriyo orta% 2 agarose bir yatak üzerinde PBS bir% 50 gliserol çözeltisi embriyotransferi. Sarısını çıkarmak için, 200 mikrolitre 1X PBS'yi bir depresyon slaytına veya düz cam bir kaydırağa aktarın. PBS damlacık bir veya daha fazla embriyo taşımak için plastik bir transfer pipet kullanın.
Sarısını parçalamak ve embriyonun ventral yüzeyinden sarısı granüllerini nazikçe kazımak için ultra ince pİşletmeler ve çift sıfır böcek pimleri kullanın. Sarısı granüllerini çıkarın ve gerektiğinde PBS ile yenilenin. Montajdan sonra, mikroskop aşamasına örnek yerleştirin.
Nispeten parlak bir örnek seçerek ilgi çekici bölgeyi bulun. Kamera pozlamasını ayarlayın ve sinyalin doymadan yeterince parlak olması için kazanç elde edin. Deneysel antikor etiketli embriyolar ve kontrol antikor embriyoları arasında karşılaştırma yaparken, aynı pozlama ayarlarını kullanın.
Tüm monte immünohistokimya bu protokol zebrabalığı gelişimi kullanarak mekansal ve zamansal protein ekspresyonu çalışması için değerli bir araçtır. NMDA tipi glutamat reseptörünün GluN1 alt birimi, döllenme sonrası 23 saat boyunca gelişen zebrabalığı kasları boyunca glutamat reseptör alt birimlerinin ekspresyonunu ortaya çıkardı. 72 saatlik post fertilizasyon embriyolarının dondurulmuş bölümleri slaytlara monte edildi ve çoğalan hücrelerin bir belirteci olan fosfo-H3 için immünosüle edildi.
Birkaç hücre fosfo-H3 ifade ve ifade en belirgin ventriküler zonlar oldu. Fare IgG kontrol antikor ve primer antikorlar hariç non-spesifik ekspresyon düşük düzeyde ortaya. Tespiti sağlamak ve spesifik olmayan boyamayı en aza indirmek için ana antikorlara ev sahipliği yapacak türlere dayalı uygun engelleme solüsyonları ve ikincil antikorlar seçmek önemlidir.
İmmünohistokimya, gözlenen sinyalin aslında ilgi çekici protein olduğundan emin olmak için doğrulanmalıdır. Takip deneyleri genellikle genetiği değiştirilmiş organizmaların kullanılmasını içerir. İmmünohistokimya araştırmacılara proteinleri yerinde gözlemleme yeteneği vererek, özellikle embriyo gelişimi sırasında hem temel hem de uygulamalı biyolojideki çok sayıda sistemi anlamamızı büyük ölçüde hızlandırmaktadır.
Metanol ve formaldehit toksiktir ve dikkatli kullanılmalıdır. Atıkların kurumsal prosedürlere göre toplanması ve bertaraf edilmesi gerekmektedir.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
