التشريح وتلطيخ الدهون القطرة من البويضات في يرقات دروفيا

يمكن استخدام هذه الطريقة من تشريح oenocyte وتلطيخ قطرات الدهون لتحقيق ظهور قطرات الدهون في يرقات الدوزوفيا oenocyte في ظل الظروف العادية والمجهدة. توفر هذه الطريقة أداة مفيدة لدراسة استقلاب الدهون ليس فقط في الحشرات ولكن أيضًا في الثدييات مع بعض التعديلات الطفيفة فقط. للحث على وضع البيض، ضع 150 ذباب أنثى عذراء و75 ذكراً من الأنماط الجينية المطلوبة في زجاجة زرع البيض ووضع الزجاجة تحت صندوق مقاوم للضوء في حاضنة 25 درجة مئوية مع رطوبة 60٪.

بعد ساعة واحدة، نقل الذباب إلى زجاجة جديدة والسماح للذباب وضع البيض في زجاجة جديدة لمدة ساعة واحدة قبل إزالة الكبار. ثم، السماح للبيض أن تتطور إلى اليرقات النجمية الثالثة لمدة 84 ساعة في 25 درجة سيلسيوس مع دورة 12 ساعة ضوء الظلام. قبل البدء في علاج المجاعة ، ضع قطعة بحجم مناسب من ورق التصفية في طبق بيتري ستة سنتيمتر وأضف ملليلترًا واحدًا من PBS على الورق لإنشاء غرفة تجويع.

لجعل غرفة معالجة التحكم، ضع خمسة ملليلترات من طعام دقيق الذرة القياسي بلومينغتون في طبق بيتري ستة سنتيمترات. عندما تكون الغرف جاهزة ، استخدم فرشاة طلاء صغيرة لجمع يرقات النجوم من نفس الحجم التقريبي من زجاجة وضع البيض. و 20 يرقة بشكل عشوائي في كل تجويع وغرفة التحكم.

ثم ضع الغرف في الحاضنة لمدة 12 أو 24 أو 36 ساعة من التطوير و / أو المجاعة. في نهاية فترة العلاج ، استخدم ملقط لنقل اليرقات بلطف من كل غرفة إلى لوحة تشريح تحتوي على PBS بارد جليدي ووضع اللوحة تحت مجهر ستيريو. توجيه أول جانب البطن اليرقة حتى واستخدام ملقط لعقد بلطف اليرقة في مكان.

ضع دبوسًا واحدًا من خلال البلعوم ودبوسًا آخر من خلال الـpiracle لتأمين اليرقة إلى الطبق. استخدام مقص الربيع Vannas لجعل شق طولي من خلال البشرة من الجزء الأمامي إلى الطرف الخلفي من الحيوان. استخدام ملقط لإزالة الأنسجة الداخلية للبشرة، مع الحرص على تجنب تلف oenocytes على السطح الداخلي للبشرة.

ثم استخدام ملقط لاسترداد دبابيس تشريح ونقل البشرة إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني على الجليد. لطخة قطرات الدهون، احتضان البشرة تشريح في العازلة التثبيت لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على دوار، تليها resuspension سريع في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. ثم غسل العينات مع ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل غسل لإزالة أي تثبيت المتبقية.

بعد الغسيل الأخير، قم باحتضان عينات البشرة بمسبار دهني مناسب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على دوار. أثناء الحضانة، قم بلف الأنابيب العينة في احباط لحماية الأنسجة من الضوء وغسل العينات ثلاث مرات في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لكل غسل. لتصوير oenocytes، نقل كل عينة البشرة إلى ستة ميكرولترات من المتوسطة تصاعد على شريحة المجهر نظيفة، وضبط اتجاه الأنسجة، بحيث السطح الداخلي الذي يحتوي على oenocytes لمس الجزء السفلي من الشريحة.

ضع غطاءً برفق على البشرة وختم الحواف بتلميع الأظافر الواضح. عندما جفف البولندية، صورة العينات على المجهر confocal، وضع التكبير 63 X مع الإثارة المناسبة وأطوال موجية الانبعاثات. هناك عدد قليل من قطرات الدهون التي يمكن اكتشافها داخل oenocytes من يرقات التغذية العادية في مراحل النمو المختلفة.

كما لوحظ في هذه الصور التمثيلية ومع ذلك، فإن قطرات الدهون زيادة في عدد داخل oenocytes استجابة ل12، 24، و 36 ساعة من المجاعة فترات. توفر هذه الطريقة بروتوكولاً سهلاً ومجدياً للباحثين في مجالات البحث ذات الصلة للتحقيق فيما إذا كانت التلاعبات الجينية أو البيئية تسبب تغييرات في قطرات الدهون في الخلايا.