Name: Inducción de eritosis en glóbulos rojos utilizando un ionoforo de calcio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a inducir eritosis en eritrocitos humanos utilizando ionomicina como ionóforo de calcio. Este protocolo confiable y reproducible permite evaluar la localización de fosfatidilserina en la membrana celular mediante citometría de flujo.

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Este trabajo fue apoyado por la concesión NIH R15ES030140 y la concesión NSF CBET1903568. También se reconoce el apoyo financiero del Russ College of Engineering and Technology y del Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular de la Universidad de Ohio.

Todas las muestras de sangre humana utilizadas en el protocolo descrito a continuación se compraron como muestras no identificadas. Ningún sujeto humano estuvo directamente involucrado o reclutado para este estudio. Las directrices de la Declaración de Helsinki deben utilizarse cuando la investigación involucre a sujetos humanos.
1. Aislamiento de eritrocitos de sangre entera
<ol><li>Añadir 500 l de sangre entera en citrato ácido dextrosa (ACD) (almacenado a 4 oC) a un tubo de microcentrífuga. NOTA: Se compró sangre entera en aCD. Según la empresa, 1,5 ml de ACD se añade a 7 ml de sangre entera (8,5 ml de volumen total).</li>
	<li>Centrifugar toda la sangre a 700 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y eliminar el plasma transparente y la capa fina y ligera con una pipeta para dejar la capa roja de eritrocitos.</li>
	<li>Preparar 1 L de solución de Ringer que contenga 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mM HEPES, 5 mM de glucosa y 1 mM de CaCl2. Ajuste el pH a 7,4 añadiendo 2 gotas de 1,0 M De NaOH. Para preparar la solución de Ringer sin glucosa, siga el mismo protocolo, pero no incluya glucosa en la solución.</li>
	<li>Lavar los eritrocitos 2x en solución Ringer suspendiendo el pellet celular en 1,5 ml de solución de Ringer, centrifugando a 700 x g durante 5 min en RT, y retirando el sobrenadante.</li>
	<li>Hacer un hematocrito al 0,4% resuponiendo 40 l del pellet de eritrocitos en 9.960 ml de solución de timbre libre de glucosa para alcanzar un volumen final de 10 ml. NOTA: Hematocrito es un término utilizado para referirse a la fracción de volumen de eritrocitos en suspensión. Un hematocrito del 0,4% es una suspensión que contiene 0,4% de eritrocitos.</li>
	<li>Incubar la suspensión celular a 37oC durante 7 días.</li>
</ol>2. Tratamiento de eritrocitos con ionomicina y medición de la hemólisis
<ol><li>Disolver 1 mg de sal de calcio de ionomicina en 630 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) para alcanzar una concentración final de 2 mM. Aliquot y almacenar a -20oC.</li>
	<li>Tomar 1 mL del hematocrito al 0,4% del paso 1,5 y añadir 0,5 ml de ionomicina de 2 mM para alcanzar una concentración final de 1 M. Incubar durante 2 h a 37oC.<ol>
<li>Utilice 1 ml del hematocrito sin tratamiento con ionomicina como control negativo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar los hematocritos tratados con ionomicina y no tratados a 700 x g durante 5 min en RT, y retire sus sobrenadores para dejar los gránulos celulares en la parte inferior de los tubos.</li>
	<li>Lave las células 3 veces con la solución Ringer suspendiendo los pellets celulares en 1,5 ml de solución Ringer, centrifugando a 700 x g durante 5 min a RT y descartando los sobrenatodores.</li>
	<li>Para medir la hemólisis, añadir 1 ml del hematocrito no tratado 0,4% del paso 1,5 a un tubo de microcentrífuga e incubar durante 2 h a 37 oC como control negativo para la hemólisis (0%).</li>
	<li>Añadir 1 ml del hematocrito no tratado 0,4% del paso 1,5 a un tubo de microcentrífuga y centrífuga a 700 x g durante 5 min a RT. Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de agua destilada al pellet celular e incubar durante 2 h a 37 oC como control positivo para la hemólisis (100%).</li>
	<li>Añadir 1 ml del hematocrito de la ionomicina tratada con 0,4% del paso 2.2 a un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Centrifugar las células no tratadas, las células tratadas y las células en agua destilada a 700 x g durante 5 min a RT.</li>
	<li>Tome 200 s de los supernatantes y agréguelos a una placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Mida la absorbancia a 541 nm utilizando un lector de microplacas.</li>
	<li>Calcular la hemólisis usando la Ecuación 132: %Hemolisis (AT - A0)/(A100 - A0)*100 donde A0 es la absorbancia de eritrocitos en la solución de Ringer, A100 es la absorción de eritrocitos en el agua, y UnaT es la absorción de eritrocitos tratados por ionomicina.</li>
</ol>3. Ensayo vinculante Anexo-V
<ol><li>Diluir 2 ml del búfer de unión V de 5x annexin en 8 ml de solución salina con fosfato (PBS) para obtener 1 búfer de unión.</li>
	<li>Resuspenda los gránulos celulares tratados con ionomicina y no tratados del paso 2.4 en 1 ml de búfer de unión 1x.</li>
	<li>Tomar 235 l de las suspensiones celulares en el tampón de unión y añadir 15 l de conjugado Annexin V-Alexa Flour 488.</li>
	<li>Incubar las células a RT durante 20 minutos en un lugar oscuro. Centrífuga a 700 x g durante 5 min en RT y retire el sobrenadante.</li>
	<li>Lavar las células 2x con 1x tampón de unión, suspendiendo el pellet celular en 1,5 ml del tampón de unión, centrifugando a 700 x g durante 5 min en RT y retirando el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda los gránulos celulares en 250 ml de búfer de unión de 1x para mediciones de citometría de flujo.</li>
</ol>4. Citometría de flujo
<ol><li>Transfiera 200 ml de los eritrocitos teñidos annexin-V a tubos de poliestireno de fondo redondo de 1 ml compatibles con la citometría de flujo.</li>
	<li>Inicie sesión en el software de citometría de flujo y haga clic en el nuevo botón de experimento. Haga clic en el nuevo botón de tubo. Seleccione la hoja global y elija el análisis de aplicación para medir la intensidad de la fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm.</li>
	<li>Establezca el número de células en 20.000 que se recogerán para el análisis de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS).</li>
	<li>Seleccione el tubo deseado y haga clic en el botón de carga. Haga clic en el botón de registro para mediciones de dispersión hacia delante y dispersión lateral. Repita el proceso para todas las muestras.</li>
	<li>Haga clic derecho en el botón de la muestra y haga clic en aplicar el análisis por lotes para generar el archivo de resultados.</li>
	<li>Haga clic derecho en el botón de la muestra y haga clic en generar archivos FSC.</li>
	<li>Agregue los datos de citometría de flujo (archivos FSC) al lugar de trabajo del software de citometría de flujo.</li>
	<li>Analice los datos de control seleccionando la población celular de interés y agregando estadísticas para el valor de eritosis.<ol>
<li>Haga doble clic en el control y seleccione el histograma frente a la intensidad de la fluorescencia.</li>
		<li>Haga clic en el botón de puerta para dibujar una puerta en el histograma que indica el porcentaje de eritosis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplique las mismas estadísticas para todos los demás tubos experimentales para obtener los valores de eritosis. Haga clic con el botón derecho en el control y seleccione copiar análisis para agrupar.</li>
	<li>Después de hacer correctamente todas las muestras, transfiera los datos analizados arrastrándolos y soltándolos en el editor de diseño.<ol>
<li>Superponer los datos analizados con control en el editor de diseño.</li>
		<li>Establezca los histogramas e intensidades deseados cambiando los ejes x e y de los gráficos superpuestos.</li>
		<li>Exporte archivos de imagen haciendo clic en el botón de exportación y guarde los gráficos en la ubicación deseada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Microscopía confocal
<ol><li>Transfiera 5 l de células teñidas anexión en V en una diapositiva del microscopio y cúbrala con un resbalón de la cubierta. Mantener en un lugar oscuro para evitar el fotoblanqueo.</li>
	<li>Utilice el láser de argón del microscopio de fluorescencia confocal para observar las células excitadas a 488 nm con las ampliaciones deseadas. NOTA: No es necesariamente necesario un microscopio confocal y cualquier microscopio con capacidades de fluorescencia se puede utilizar para obtener imágenes de fluorescencia que demuestren la unión anexión-V.</li>
	<li>Obtener imágenes de fluorescencia del control (células no tratadas) y células tratadas. NOTA: Se espera que las células no tratadas muestren señales de fluorescencia muy débiles, mientras que se espera que las células tratadas muestren fluorescencia verde brillante en sus membranas.</li>
</ol>

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<li>Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-Dependent+Phospholipid+Scrambling+by+TMEM16F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F.</a> Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).</li>
<li>Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Volasertib%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).</li>
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<li>Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+of+Programmed+Erythrocyte+Death+by+Alantolactone%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone.</a> Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).</li>
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<li>Andree, H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Vascular+Anticoagulant+%CE%B1+%28VAC%CE%B1%29+to+Planar+Phospholipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).</li>
<li>Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+Affinity+and+Cooperativity+of+Annexin+V-Membrane+Binding+under+Conditions+of+Low+Membrane+Occupancy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy.</a> Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).</li>
<li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eryptosis+as+an+Underlying+Mechanism+in+Systemic+Lupus+Erythematosus-Related+Anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).</li>
<li>Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+Platelet+Proteomics+in+Hematological+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El objetivo de este procedimiento es proporcionar valores óptimos para la concentración de ionóforo, el tiempo de tratamiento y la concentración de glucosa extracelular, que son factores importantes para garantizar la inducción exitosa de la eritosis. Un paso crítico en el protocolo es el agotamiento de la glucosa extracelular, que, a pesar de su importancia, no ha sido suficientemente enfatizado en la literatura. El contenido de azúcar en la solución normal de Ringer (5 mM) tiene un efecto inhibitorio sobre la eritosis....

La muerte celular programada en eritrocitos, también conocida como eritosis, es común en muchas condiciones clínicas y trastornos hematológicos. La eritosis se asocia con la contracción celular y la pérdida de asimetría fosfolípido en la membrana plasmática celular1,2. La pérdida de asimetría resulta en la translocación de fosfatidilserina (PS), un lípido normalmente localizado en el prospecto interno3,4, al prospecto externo celular, que indica a los macrófagos a la fagocitosa y eliminar eritrocitos defectuosos5,6,7,8. Al final de la vida útil normal de los eritrocitos, la eliminación de células eriptóticas por macrófagos asegura el equilibrio de los eritrocitos en circulación. Sin embargo, en condiciones enfermas, como la enfermedad de las células falciformes y la talasemia9,10,11, eritosis mejorada puede resultar en anemia grave2. Debido a su importancia en las enfermedades hematológicas, existe un interés significativo en examinar los factores que inducen o inhiben la eritosis y los mecanismos moleculares subyacentes a este proceso.
La membrana plasmática de eritrocitos sanos es asimétrica, con diferentes fosfolípidos localizando en los foliolos externos e internos. La asimetría de la membrana se regula principalmente por la acción de las enzimas de membrana. El translocase de aminofosfolípidos facilita el transporte de aminofosfolípidos, PS y fosfatidiletanolamina (PE), dirigiendo estos lípidos al prospecto interno celular. Por otro lado, floppase transporta la colina que contiene fosfolípidos, fosfatidilcolina (PC) y esfingomielina (SM), desde el interior hasta el foliolo exterior de la membrana celular12. Sin embargo, a diferencia de las células sanas, la membrana de los eritrocitos erifóticos está revuelta. Esto se debe a la acción de una tercera enzima, la escramblasa, que interrumpe la asimetría fosfolípido facilitando el transporte bidireccional de los aminofosfolípidos13,14,15,16. Scramblase se activa por niveles intracelulares elevados de Ca2+. Por lo tanto, los ionoforos de calcio, que facilitan el transporte de Ca2+ a través de la membrana celular12,son inductores eficientes de la eriptosis.
La ionomicina, un ionóforo de calcio, ha sido ampliamente utilizada para inducir la eritosis en eritrocitos12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. La ionomicina tiene grupos hidrófilos e hidrófobos, que son necesarios para unir y capturar el ion Ca2+, y transportarlo al espacio citosólico27,28,29. Esto conduce a la activación de la scramblasa y la translocación de PS al prospecto exterior, que se puede detectar fácilmente utilizando annexin-V, una proteína celular con una alta afinidad a PS12. Aunque la activación de la eritosis por ionomicina se divulga comúnmente, hay una considerable discrepancia de método en la literatura (Tabla 1). La población de eritrocitos sometidos a eriptosis depende de diferentes factores como la concentración de ionóforos, el tiempo de tratamiento con ionóforo y el contenido de azúcar del entorno extracelular (el agotamiento de la glucosa activa los canales catiónicos y facilita la entrada de Ca2+ en el espacio citosólico)30,31. Sin embargo, hay poca consistencia en estos factores en la literatura, lo que dificulta la realización de eritosis reproduciblemente in vitro.
En este protocolo, presentamos un procedimiento paso a paso para inducir la eritosis en eritrocitos humanos. Se examinan los factores que afectan a la eriptosis exitosa, como la concentración de Ca2+, la concentración de ionoforres, el tiempo de tratamiento y la preincubación en el tampón agotado de glucosa y se notifican valores óptimos. Este procedimiento demuestra que la preincubación de eritrocitos en un tampón libre de glucosa aumenta significativamente el porcentaje de eritosis en comparación con el tampón que contiene glucosa. Este protocolo se puede utilizar en el laboratorio para producir eritrocitos eriptóticos para diversas aplicaciones.

<table><tbody><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-331</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V Alexa Fluor 488 - kit de apoptosis</td><td>Fisher Scientific</td><td>A10788</td><td>Tienda en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>643177</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Millipore Sigma</td><td>M7157</td><td>Modelo Eppendorf 5415C</td></tr><tr><td>Microscopía de fluorescencia confocal</td><td>Zeiss, LSM Tek Thornwood</td><td></td><td>Modelo LSM 510, Láser de argón excitado a 488 nm para la toma de imágenes</td></tr><tr><td>Cubierta gafas círculos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de citometría de flujo desechable de fondo redondo</td><td>VWR</td><td>VWRU47729-566</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>VWR Life Science</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa monohidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001745</td><td></td></tr><tr><td>Tampón HEPES (1 m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-751-7290</td><td>Tienda en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Ionomicina sal de calcio</td><td>EMD Milipore Corp.</td><td>407952-1MG</td><td>Disolver en DMSO para alcanzar 2 mM. Almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio liso</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Lector de microplacas HFM</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sangre entera en ACD</td><td>Zen-Bio</td><td></td><td>Store a 4 &deg; C y cálido a 37 &deg; C antes de usar</td></tr></tbody></table>

inducción de eritosis en glóbulos rojos utilizando un ionoforo de calcio

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

La eriftosis, muerte celular programada por eritrocitos, ocurre en una serie de enfermedades hematológicas y durante la lesión de eritrocitos. Un sello distintivo de las células eriptóticas es la pérdida de asimetría compositiva de la membrana celular, lo que conduce a la translocación de fosfatidilserina al prospecto externo de la membrana. Este proceso se desencadena por el aumento de la concentración intracelular de Ca2+,que activa la escramblasa, una enzima que facilita el movimiento bidireccional de los fosfolípidos entre los foliolos de membrana. Dada la importancia de la eritosis en diversas condiciones enfermas, ha habido esfuerzos para inducir la eritosis in vitro. Tales esfuerzos han confiado generalmente en el ionóforo de calcio, ionomicina, para mejorar la concentración intracelular de Ca2+ e inducir la eritosis. Sin embargo, muchas discrepancias se han divulgado en la literatura con respecto al procedimiento para inducir la eritosis usando ionomicina. Aquí, reportamos un protocolo paso a paso para la eritosis inducida por ionomicina en eritrocitos humanos. Nos centramos en pasos importantes en el procedimiento, incluyendo la concentración de ionóforo, el tiempo de incubación y el agotamiento de la glucosa, y proporcionamos un resultado representativo. Este protocolo se puede utilizar para inducir reproduciblemente eritosis en el laboratorio.

Optimización de la concentración de ionomicina
Mientras que la ionomicina es necesaria para inducir la eritosis, el aumento de las concentraciones de ionomicina puede conducir a la hemólisis (es decir, lisis de eritrocitos y liberación de hemoglobina), que debe evitarse. El tratamiento de los eritrocitos con 1 M de ionomicina en solución de timbre durante 2 h es suficiente para inducir la eritosis, como lo demue...

Se proporciona un protocolo para la inducción de la eritosis, muerte celular programada en eritrocitos, utilizando el ionóforo de calcio, ionomicina. La eriptosis exitosa se evalúa mediante el seguimiento de la fosfatidilserina de localización en el prospecto externo de la membrana. Se han examinado los factores que afectan al éxito del protocolo y se han proporcionado condiciones óptimas.

Inducción de eritosis en glóbulos rojos utilizando un ionoforo de calcio

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Ha habido muchos esfuerzos para inducir la eriptosis usando ionomicina. Sin embargo, el procedimiento exacto para este proceso no se describe claramente en la literatura. Proporcionamos un procedimiento paso a paso para inducir la eriptosis usando ionomicina.La principal ventaja de este procedimiento es inducir la eriptosis en eritrocitos humanos de una manera confiable y reproducible. Para comenzar, agregue 500 microlitros de sangre entera fría en citrato ácido dextrosa a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar toda la sangre a 700 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente y retire el plasma transparente y la capa fina con una pipeta para salir de la capa roja de eritrocitos.Preparar un litro de solución Ringer que contenga 125 mililitros de cloruro de sodio, cloruro de potasio de cinco milimolares, un sulfato de magnesio milimolar, 32 HEPES milimétricas, glucosa de cinco mililitrolares y un cloruro de calcio milimiolar. Ajuste el pH a 7.4 añadiendo dos gotas de microlitro de un hidróxido de sodio molar. Para preparar la solución Ringer libre de glucosa, siga el mismo protocolo, pero no incluya glucosa en la solución.Lavar los eritrocitos dos veces en solución Ringer su

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

El retículo endoplasmático juega un papel clave en la biogénesis de proteínas y en la homeostasis del calcio. Hemos establecido un sistema experimental que nos permite abordar el papel de los canales de Ca2 + de fugas y para caracterizar sus mecanismos de regulación putativo. Este sistema consiste en el silenciamiento de genes mediada por siRNA y de células vivas imágenes de Ca2 +.

Imágenes en vivo del calcio celular combinado con el silenciamiento de genes mediada por siRNA Identifica Ca 2 + Canales de fugas en la membrana del ER y sus mecanismos de regulación

Este video describe un ensayo in vitro para determinar la hemólisis o lisis inducida por ionóforos de calcio de glóbulos rojos en una muestra humana. El ensayo mide el porcentaje de hemólisis cuantificando la hemoglobina liberada de los eritrocitos rotos.

Ensayo de hemólisis: un método in vitro para medir la lisis inducida por ionóforos de calcio en eritrocitos humanos

En este video, demostramos el ensayo de unión a la anexina V para medir el grado de eriptosis, muerte celular programada con eritrocitos, utilizando la tinción fluorescente de anexina V. Los eritrocitos apoptóticos muestran una translocación de fosfatidilserina desde la valva interna a la externa de la membrana celular, lo que hace que la anexina V marcada con fluoróforos se una a la fosfatidilserina translocada, emitiendo así una señal fluorescente.

Ensayo de unión a anexina V: una técnica basada en fluorescencia para identificar eritrocitos apoptóticos mediante el marcaje con fosfatidilserina

Este video describe un ensayo basado en imágenes de microscopía confocal para medir la absorción de calcio mitocondrial en células cultivadas. El ensayo utiliza el colorante fluorescente sensible al calcio Rhod-2/AM para medir el calcio mitocondrial en células cultivadas permeabilizadas.

Ensayo de afluencia de calcio para medir la absorción de calcio mitocondrial en células cultivadas

Este video muestra una técnica para detectar la respuesta local y global de iones de calcio tras la infección por Shigella de células epiteliales humanas. La Shigella invade las células huésped y libera efectores de invasión, lo que afecta los niveles de calcio intracelular. La amplitud y frecuencia del calcio citosólico local y global se estudian utilizando un indicador fluorescente.

Una técnica de imagen para estudiar la respuesta del calcio en células infectadas por bacterias

Este video analiza la afluencia de calcio inducida por el receptor de células T en las células T. Los anticuerpos anti-CD3 activan las vías de señalización de las células T, lo que conduce a un aumento de los iones de calcio intracelulares que se unen con el tinte Indo-1. En la citometría de flujo, un cambio de espectro del estado libre de calcio al estado unido al calcio se correlaciona con la afluencia de calcio inducida por el receptor de células T.

Evaluación de la afluencia de calcio inducida por el receptor de células T mediante un tinte indicador de calcio

Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED) es compatible con el análisis de la dinámica del almacén de calcio intracelular por imágenes de fluorescencia. El método basa en la orientación de un carboxilesterasa recombinante para el retículo endoplásmico (ER), donde mejora el desenmascaramiento local del sintético de baja afinidad...

Direct Imaging de calcio ER con Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED)

Actualmente, la mayoría de los indicadores de calcio disponibles se utilizan para cuantificar los transitorios de calcio citoplasmático como medidas indirectas del calcio liberado del retículo sarcoplásmico en células de músculo liso cultivadas. Este protocolo describe el uso de un indicador específico basado en FRET que permite la medición directa de las señales de calcio dentro de la luz del retículo sarcoplásmico.

De imagen confocal de medición de las fluctuaciones de calcio en el retículo sarcoplásmico de células musculares lisas cultivadas Uso de FRET a base de

Aquí se describen los métodos utilizados para estudiar el efecto funcional de las mutaciones RYR1 expresadas endógenamente en los linfocitos B humanos inmortalizados por el virus de Epstein Barr y las células satélite derivadas de biopsia muscular diferenciadas en miotubos.

Caracterización funcional de variantes de RYR1 humanas expresadas endógenamente

El presente protocolo describe el control totalmente óptico y la observación de la actividad celular desencadenada en cardiomiocitos derivados de iPSC (iPSC-CM) para la detección de fármacos de alto rendimiento y pruebas de toxicidad. Se muestra la cuantificación multiparamétrica de patrones fenotípicos en el tiempo y el espacio. Se demuestran los efectos a largo plazo de los medicamentos durante horas, o mediciones secuenciales durante días.

Control óptico de alto rendimiento y registro de la señal de calcio en cardiomiocitos derivados de iPSC para pruebas de toxicidad y detección fenotípica de fármacos

Este artículo presenta un método para el monitoreo cuantitativo en tiempo real de las concentraciones de iones de calcio (Ca2+) en células utilizando imágenes de Ca2+ de una sola célula con el colorante Fura-2 / AM. Esta técnica permite una carga eficiente de colorante y un cálculo preciso de los niveles de Ca2+ a través de las relaciones de intensidad de fluorescencia, lo que la convierte en un enfoque simple y rápido para aplicaciones de investigación.

Imágenes de calcio unicelular para estudiar la activación de los canales iónicos de calcio

Aprende a inducir eritosis en eritrocitos humanos utilizando ionomicina como ionóforo de calcio. Este protocolo confiable y reproducible permite evaluar la localización de fosfatidilserina en la membrana celular mediante citometría de flujo.

Inducción de eritosis en glóbulos rojos utilizando un ionoforo de calcio

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