Name: Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda a cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama en pulmones mediante ensayos de vena de cola e imágenes en tiempo real in vivo sin necesidad de tinciones histológicas.

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Agradecemos a Emily Norton por ayudar con las infecciones virales y la lectura crítica del manuscrito. También damos las gracias a Ryan Kanai por ayudar con la adquisición de imágenes de los pulmones y Kate E. Tubbesing por la ayuda con el análisis de imágenes de las metástasis verdes en los pulmones. Agradecemos al personal de la instalación de investigación animal por su apoyo y por la ayuda en la preparación de este video. Este trabajo fue apoyado por una beca Susan G. Komen Career Catalyst que otorgó a J.M.L. (#CCR17477184).

Los autores no tienen nada que revelar.

Pasos críticos del método Es fundamental optimizar el número de células inyectadas (paso 3) para una línea celular dada y la tensión del ratón, ya que esto puede influir en gran medida en el número de metástasis que se forman y la longitud del experimento. Si se inyectan demasiadas células o las metástasis crecen durante demasiado tiempo, las metástasis pueden ser difíciles de contar haciendo que los efectos de la manipulación genética sean difíciles de evaluar. Sin embargo, si se inyectan muy pocas c...

El cáncer sigue siendo la segunda causa de muerte en todo el mundo1 y la metástasis es responsable de la mayoría de estas muertes2,3. Sin embargo, una comprensión limitada de los mecanismos moleculares que rigen la colonización metastásica y el crecimiento posterior ha obstaculizado el desarrollo de tratamientos eficaces para la enfermedad metastásica. La identificación de nuevas dianas terapéuticas requiere un ensayo para probar cómo la expresión o función perturbada de un gen candidato influye en la formación y el crecimiento de la metástasis. Mientras que los modelos de ratón autóctonos tienen sus ventajas, consumen mucho tiempo y son costosos de generar, lo que los hace más adecuados para la validación de destino en lugar de la detección de objetivos. Los sistemas modelo de trasplante en los que el gen candidato se perturba en las células cancerosas in vitro y luego se evalúan in vivo los efectos sobre el potencial metastásico, son menos costosos y de mayor rendimiento que los modelos autóctonos. Además, los vectores virales para la administración estable de ARNi, CRISPR/CAS9 y transgenes están ampliamente disponibles, por lo que es relativamente fácil perturbar prácticamente cualquier gen o genes de interés en las líneas celulares de una célula cancerosa. Este enfoque también se puede utilizar para analizar el papel de los genes candidatos en la colonización metastásica y el crecimiento en las líneas celulares de cáncer humano trasplantando las células en ratones inmunocomprometidos o humanizados.
Los dos tipos de ensayos utilizados para probar la formación de metástasis por células cancerosas trasplantadas in vivo son ensayos de metástasis espontáneas y ensayos experimentales de metástasis. En los ensayos espontáneos de metástasis4,5, las células cancerosas se inyectan en ratones, se les permite formar un tumor primario, y luego se analiza la formación espontánea de metástasis y el crecimiento posterior. La fuerza de este modelo es que las células deben completar todos los pasos del proceso metastásico para formar tumores metastásicos. Sin embargo, muchas líneas celulares cancerosas no hacen metástasis eficientemente en modelos de metástasis espontánea, y cualquier manipulación de las células que afecta el crecimiento del tumor primario puede confundir los resultados del ensayo de metástasis. Los ensayos experimentales de metástasis, en los que las células cancerosas se inyectan directamente en la circulación, se utilizan para evitar estos escollos. Los ensayos de metástasis experimentales comunes incluyen la inyección de vena de cola6,7,8 (y se demuestra aquí), inyección intracardiaca9,y la inyección de vena porta10.
El propósito del protocolo presentado aquí es proporcionar un ensayo experimental de metástasis in vivo que permita a un investigador monitorear la formación y el crecimiento de metástasis en tiempo real, así como cuantificar el número y el tamaño de la metástasis del punto final en los pulmones del mismo ratón. Para ello, los ensayos tradicionales de metástasis de la cola experimental6,7,8 se combinan con imágenes de animales vivos, utilizando un dispositivo de imagen in vivo9,11,12,13,14. Las células tumorales que expresan establemente tanto la luciferasa como una proteína fluorescente se inyectan en ratones a través de la vena lateral de la cola y luego el dispositivo de imágenes in vivo se utiliza para medir los cambios en la carga metastásica en los pulmones a lo largo del tiempo(Figura 1). Sin embargo, el dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo no puede distinguir ni medir el tamaño de las metástasis individuales. Por lo tanto, al final del experimento, se utiliza un estereomicroscopio fluorescente para contar el número y medir el tamaño de las metástasis fluorescentes en los pulmones sin necesidad de seccionamiento e histología o inmunohistoquímica(Figura 1). Este protocolo se puede utilizar para probar cómo la alteración de la expresión o función de un gen candidato influye en la formación y el crecimiento de la metástasis. También se pueden probar posibles compuestos terapéuticos como moléculas pequeñas o anticuerpos de bloqueo de funciones.
Para demostrar este enfoque, primero realizamos un experimento de prueba de concepto en el que el factor de replicación esencial, la proteína de replicación A3 (RPA3) se derriba en las células de cáncer de mama de ratón metastásico. Mostramos que los ratones inyectados con células de derribo de RPA3 tienen una carga metastásica significativamente menor en cada punto de tiempo en comparación con los ratones inyectados con células de control. El análisis de los pulmones que contienen metástasis muestra que esta carga metastásica reducida es el resultado de una colonización metastásica significativamente reducida y un crecimiento deteriorado de las metástasis que se forman. Para demostrar aún más esta técnica, probamos si el derribo simultáneo de proteína asociada al Sí (YAP) y coactivador transcripcional con un motivo de unión a pdZ (TAZ) afecta la colonización metastásica o el crecimiento posterior. YAP y TAZ son dos coactivadores transcripcionales relacionados que son los efectores descendentes críticos de Hippo Pathway. Nosotros15,16 y otros hemos implicado YAP y TAZ en metástasis (revisado en17,18,19), lo que sugiere que estas proteínas son buenas dianas terapéuticas. Consistentemente, encontramos que los ratones inyectados con células de derribo YAP/TAZ habían reducido significativamente la carga metastásica. El análisis de los pulmones mostró que las células de derribo YAP/TAZ formaban muchas menos metástasis y que las metástasis que se formaban eran más pequeñas. Estos experimentos demuestran cómo los ensayos experimentales de metástasis permiten a un investigador probar rápida y económicamente el papel de un gen candidato en la formación y el crecimiento de metástasis. Además, muestran cómo el uso combinado de imágenes de animales vivos y la cuantificación fluorescente de metástasis en pulmones enteros permite al investigador comprender mejor los pasos durante la colonización metastásica.

<table><tbody><tr><td>10% SDS-PAGE Gel</td><td></td><td></td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>2.5% Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>Tripsina para cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>96 pocillos placa de ensayo blanca de fondo plano</td><td>Corning</td><td>3922</td><td>Para medir la señal de luciferasa y renilla en células cultivadas</td></tr><tr><td>Toallitas</td><td></td><td></td> con alcohol <td>Para esterilizar el lugar de inyección antes de las inyecciones de las venas de cola</td></tr><tr><td>Ratones BALB/C ( hembra, 6 semanas)</td><td>Taconic</td><td>BALB-F</td><td>Para ensayos de colonización y carga metastásica de la vena de cola</td></tr><tr><td>BSA regular</td><td>VWR Ameresco</td><td>97061-416</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Tampón de lisis celular</td><td>Señalización celular</td><td>Para la recogida</td>de <td></td> muestras de proteínas</tr><tr><td>Filtros de jeringa Celltreat, PES 30 mm, 0,45 &mu; m</td><td>Celltreat</td><td>40-229749-CS</td><td>Para el filtrado de sobrenadante viral</td></tr><tr><td>CO2 y cámara</td><td></td><td></td> de eutanasia <td>Para la eutanasia de ratones</td></tr><tr><td>Kit de ensayo reportero de luciferasa dual</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Para medir la señal de luciferasa y renilla en células cultivadas</td></tr><tr><td>Dulbecco& 39; s solución salina tamponada con fosfato</td><td>Himedia</td><td>TS1006</td><td>para PBS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>97061-406</td><td>Se utiliza para diluir tripsina para el cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>FBS 100% de origen estadounidense</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Componente de medios de crecimiento completos</td></tr><tr><td>Fujifilm LAS-3000 generador de imágenes de gel</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Rabibit mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>2118</td><td>para Western blot</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-conejo anti-conejo, conjugado HRP</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Células embrionarias de riñón humano, HEK-293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td>Línea celular utilizada para empaquetar virus</td></tr><tr><td>HyClone DMEM/Alta clucosa</td><td>GE Healthcare ciencias de la vida</td><td>SH30243.01</td><td>Componente de medios de crecimiento completos</td></tr><tr><td>Higromicina B, grado ultra puro</td><td>VWR Ameresco</td><td>97064-810</td><td>Para la selección de antibióticos de células infectadas</td></tr><tr><td>I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA</td><td>Dispositivos</td><td></td> moleculares <td>Para medir la señal de luciferasa y renilla en células cultivadas</td></tr><tr><td>Imagej</td><td></td><td></td><td>Se utiliza para el análisis de imágenes de metástasis pulmonares: umbral establecido en 25 y 100</td></tr><tr><td>Immuno-Blot Membrana de PVDF</td><td>Biorad</td><td>1620177</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td></td><td></td><td>Para la anestesia en ratones</td></tr><tr><td>IVIS Lumina XRMS Sistema de imagen in vivo (dispositivo de imagen en vivo para animales vivos)</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136340</td><td>Para la obtención de imágenes in vivo de carga metastásica</td></tr><tr><td>Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP y filtros de campo claro)</td><td>Microscopio y cámara Leica Microsystems para visualizar, contar y tomar imágenes de metástasis en los pulmones; Aumento de 10X, exposición de 3,5 segundos, ganancia de 1,4</td><td></td> L-Glutamina Gibco 25030-081 Componente de medios de crecimiento completos Lipofectamina 3000 Tecnologías de la vida L3000008 Para la transfección de reporteros YAP/TAZ-TEAD <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image 3.2 (programa de software de imagen)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software para IVIS</td></tr><tr><td>Células de cáncer de mama en ratón, 4T1</td><td>Karmanos Cancer Institute</td><td>Aslakson, CJ et al.,1992</td><td>Línea celular de cáncer mamario metastásico en ratón</td></tr><tr><td>Multi-Gauge versión 3.0</td> Software <td>Fujifilm</td><td></td><td>para cuantificar la intensidad de la banda de Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM (tampón de transfección)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>Para el envasado de virus y transfección</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Componente del medio de crecimiento completo</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Para cuantificar la concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Pierce Inhibidor de la fosfatasa Mini comprimidos</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32957</td><td>Añadido al tampón de lisis celular</td></tr><tr><td>Pierce Inhibidor de la proteasa Mini comprimidos</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32953</td><td>Añadido al tampón de lisis celular</td></tr><tr><td>Polybrene (bromuro de hexadimetrina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-H9268</td><td>Para la infección</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-P7255</td><td>Para la selección de antibióticos de células infectadas</td></tr><tr>Protector <td></td><td></td> de<td>roedores</td><td>Para sujetar ratones durante la inyección de venas de cola</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de ejecución SDS-PAGE<td>Para la Western blot</td></tr><tr><td>TAZ (V3886)</td><td>Señalización celular</td> de anticuerpos <td>4883</td><td>Para</td></tr><tr><td>tampón</td><td></td><td></td> TBST de Western <td>blot Para Western blot</td></tr><tr><td>Contador de células automatizado TC20</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Para el recuento de células</td></tr><tr><td>Vectores Consulte la</td><td></td><td></td><td>Tabla 1 para obtener una lista completa de vectores</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida VWR</td><td>VWR</td><td>89404-464</td><td>Para visualizar la fluorescencia en Células marcadas con ZSGreen</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de transferencia occidental <td>Para western blot</td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferina K+ Salt</td><td>PerkinElmer</td><td>122799</td><td>Sustrato inyectado en ratones para imágenes IVIS bioluminiscentes in vivo</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 Reactivo de transfección de ADN (solución lipídica para la transfección)</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td>Para empaquetar virus</td></tr><tr><td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>14074</td><td>Para Western blot</td></tr></tbody></table>

uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

La metástasis es la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer y hay opciones terapéuticas limitadas para los pacientes con enfermedad metastásica. La identificación y prueba de nuevas dianas terapéuticas que faciliten el desarrollo de mejores tratamientos para la enfermedad metastásica requiere modelos preclínicos in vivo. Aquí se muestra un modelo de ratón singérico para decir la colonización metastásica del cáncer de mama y el crecimiento posterior. Las células cancerosas metastásicas se transduelen de forma estable con vectores virales que codifican la luciferasa de las luciérnagas y las proteínas ZsGreen. Los genes candidatos son manipulados de forma estable en células cancerosas que expresan luciferase/ZsGreen y luego las células se inyectan en ratones a través de la vena lateral de la cola para analizar la colonización y el crecimiento metastásicos. A continuación, se utiliza un dispositivo de imágenes in vivo para medir la bioluminiscencia o fluorescencia de las células tumorales en los animales vivos para cuantificar los cambios en la carga metastásica con el tiempo. La expresión de la proteína fluorescente permite cuantificar el número y el tamaño de las metástasis en los pulmones al final del experimento sin necesidad de seccionar o tinción histológica. Este enfoque ofrece una manera relativamente rápida y fácil de probar el papel de los genes candidatos en la colonización y el crecimiento metastásicos, y proporciona mucha más información que los ensayos tradicionales de metástasis venosa de cola. Con este enfoque, mostramos que la reducción de la reducción de la carga metastásica en los pulmones y el desenlace simultáneo de proteína asociada al Sí (YAP) y del activador transcripcional con un motivo de unión a la PDZ (TAZ) en las células de cáncer de mama reduce la carga metastásica en los pulmones y que esta carga reducida es el resultado de una colonización metastásica significativamente deteriorada y un crecimiento reducido de metástasis.

Para demostrar el enfoque anterior, realizamos un experimento de prueba de concepto en el que un factor de replicación crítico, RPA3 fue derribado en una línea celular de carcinoma mamario de ratón metastásico (4T122). Mientras que el protocolo describe la etiquetado de las células con luciferasa y proteínas fluorescentes antes de la manipulación genética, utilizamos un enfoque modificado porque los vectores RNAi también entregan ZsGreen(Figura 2A). E...

El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Nuestro protocolo se puede utilizar para probar rápida y fácilmente el papel de cualquier gen candidato en la colonización metastásica y el crecimiento. El protocolo también permite el monitoreo en tiempo real de la metástasis, la formación y el crecimiento, así como la cuantificación del número y tamaño de la metástasis en los mismos animales sin necesidad de resección o tinción histológica. Placa cuatro células T1 a 150.000 células por pozo en una placa de 12 pozos en medios de crecimiento completos.Incubar a 37 grados Celsius 5% dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, aspirar los medios de crecimiento de las células. Añadir 500 microlitros de sobrenadante viral luciferasa y 500 microlitros de sobrenadante viral de proteína fluorescente para infectar simultáneamente las células con la luciferasa y los sobrenadantes virales de proteína fluorescente.Luego, agregue un microlitro de ocho miligramos por mililitro de bromuro de hexadimetrina e incubar a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono durante 24 a 48 horas. Trypsinize las cuatro células T1 con 500 microlitros de trippsina. Después de dos a cinco minutos, transfiera todas las células a un plato de seis centímetr

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Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada<em&gt; In-situ</em&gt; La perfusión del tejido pulmonar y X-Gal tinción de<em&gt; LacZ</em&gt;-Etiquetados células tumorales

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