Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Långväga Channelrhodopsin-assisterad Krets Kartläggning av sämre colliculus nervceller med blå och röd-skiftade Channelrhodopsins
Chapters
Summary February 7th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Channelrhodopsin-assisterad krets kartläggning (CRACM) är en precisionsteknik för funktionell kartläggning av långväga neuronala prognoser mellan anatomiskt och / eller genetiskt identifierade grupper av nervceller. Här beskriver vi hur man använder CRACM för att kartlägga auditiva hjärnstammen anslutningar, inklusive användning av en rödskiftad opsin, ChrimsonR.
Transcript
Channelrhodopsin-assisterad kretsmappning är en precisionsteknik för funktionell kartläggning av långväga neurala projektioner. Här visar vi hur man använder detta tillvägagångssätt för att undersöka kretsar i hörselhjärnstammen. I hjärnan skivor, axoner från flera källor är ofta blandas, vilket gör det svårt att isolera enskilda ingångar med hjälp av elektrisk stimulering.
Genom att använda CRACM kan denna begränsning övervinnas. Att hitta lambda och konsekvent definiera stereotaxic koordinatsystem är utmanande som är att hålla varaktigheten av förfarandet kort. Med alla steg noggrant kartlagt kommer att öka din framgång.
Börja med att spraya kirurgi området med 70%etanol för att sanera och placera sterila handduk draperier för att täcka operationsområdet. Avlägsna bursängkläder för att begränsa risken för kvävning från återhämtningsburen. Därefter sätter en värmedyna under buren och ge en mat och vattenkälla.
Därefter överför djuret till en stereotaxisk ram och fortsätt anestesi. Sätt i en rektal temperaturproben och slå på den homeostatiska temperaturregulatorn. Applicera sedan oftalmisk salva för att förhindra att ögonen torkar ut.
Administrera förebyggande smärtstillande medel. Slutligen raka hårbotten med elektriska clippers. Desinficera hårbotten med tre växlande svabbprover av povidon jod och 70%etanol.
Börja operationen genom att göra ett snitt i hårbotten längs mittlinjen, börjar mellan öronen och fortsätter rostral till ögonen, utsätta lambda och bregma suturer. Tryck huden åt sidan och ta bort benhinna från det exponerade benet om det behövs. Markera därefter lambda suturen med en kirurgisk markör, placera spetsen på nano-injektorn så att den bara rör lambda och noll mikromanipulatorkoordinaterna.
Använd nano-injektorspetsen och mikromanipulatorn för att mäta skillnaden i höjd mellan lambda- och bregmasuturerna. Justera palett bar höjd för att få lambda och bregma till inom plus eller minus 100 mikrometer höjdskillnad. Kartlägg injektionsstället med hjälp av nano-injektorspetsen och mikromanipulatorkoordinatsystemet och markera platsen med en kirurgisk markör.
Använd sedan en mikromotorborr med en 0,5 millimeters borrburr för att utföra en craniotomy över injektionsstället. För att säkerställa bred transfektion av nervceller i målkärnan, använd en nano-injektor för att göra injektioner på olika djup i vävnaden och när det gäller större hjärnregioner, som de sämre colliculus, göra injektioner under loppet av två eller flera penetrationer på olika X och Y koordinater. För att injicera de sämre colliculus, deponera 20 nanoliter av virus i intervallen 250 mikrometer längs Z-axeln mellan 2, 250 mikrometer och 1, 750 mikrometer djup.
För injektioner i dorsala cochlear kärnan, deponera 20 nanoliter av virus på ett djup av 4, 750 mikrometer och 4, 550 mikrometer respektive. Efter injicering vid varje Z-koordinat, vänta två till tre minuter innan du flyttar injektorn till nästa Z-koordinat för att ge viruset tid att sprida sig bort från injektionsstället, vilket minskar sannolikheten för att virus kommer att sugas upp i injektionskanalen när nano-spridaren flyttas. Sedan, efter den sista injektionen, vänta tre till fem minuter innan du drar tillbaka nano-injektor från hjärnan.
När nano-injektorn avlägsnas från hjärnan mellan inträngningar och mellan djur, mata ut en liten volym av virus från spetsen för att kontrollera att spetsen inte har igensatt. Efter injektioner, använd steril PBS för att blöta de skurna kanterna i hårbotten och sedan försiktigt flytta huden tillbaka mot mittlinjen. Stäng såret med enkla avbrutna suturer med hjälp av 6-0 suturer i nylon.
Applicera sedan 0,5 till en milliliter av 2%lidokain gelé till såret. Ta bort öronstängerna och temperatursonden, sväng av isofluran, och ta bort djuret från palettstången och överför det till återhämtningsburen. Slutligen övervaka återställning noga.
När djuret är helt vaken, flytta runt, och visar inga tecken på smärta eller ångest, överföra den tillbaka till sin bur och returnera buren till vivarium. Använd standard patch clamp metoder för att göra inspelningar. Börja med att placera skivan i en inspelningskammare under ett fast steg upprätt mikroskop och kontinuerligt ymnig med konstgjord cerebrospinalvätska på två milliliter per minut.
Därefter patch nervceller under visuell kontroll med hjälp av en lämplig patch clamp förstärkare. Slutligen, under grossistinspelningar, aktivera Chronos genom att leverera korta pulser på 470 nanometer ljus eller ChrimsonR av korta pulser på 580 nanometer ljus genom kommersiellt tillgängliga lysdioder. Resultaten anges att ChrimsonR injektion ledde till starka uttryck i DCN med tdTomato fluorescens synlig i celler och fibrer.
I den kontralaterala ICC, fibrer starkt märkta med tdTomato var tydligt synliga efter tre veckor, visar långväga människohandel förmåga ChrimsonR-tdTomato konstruera när injiceras i auditiva hjärnstammen kärnor. Optisk aktivering av ChrimsonR elicted EPSPs i IC VIP nervceller, vilket indikerar att ChrimsonR är ett användbart verktyg för långväga CRACM experiment när de experimentella parametrarna kräver användning av rött ljus i stället för blått ljus. Vi fann dock att ChrimsonR var lätt aktiveras med blått ljus, visar samma tröskel för blått ljus aktivering som Chronos.
För detta protokoll är det viktigast att se till att de stereotaxiska koordinaterna är korrekta och att bekräfta att viruset uttrycktes endast i din riktade hjärnregion. Genom att utbyta Chronos ChrimsonR virokonstruct med ett annat virus, till exempel, en cell specifika Flex virus, kan du svara på flera anatomiska eller fysiologiska frågor utan att ändra kirurgi protokollet.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
