Name: 在生物标志物分析临床试验场单次抽血时，准备外周血单核细胞颗粒和血浆 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学习在临床试验现场制备高质量外周血单核细胞和血浆样本的标准化方法。该方案通过离心分离技术减少分析前变异，适用于肿瘤学生物标志物研究及药物动力学分析。

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我们谨向阿斯利康肿瘤学研究与早期开发部门转化医学团队的所有成员致以诚挚感谢，感谢他们对本实验方案提供的反馈意见，特别感谢Hedley Carr、Tammie Yeh和Nathan Standifer分别在循环肿瘤DNA分析用血浆制备、外周血单个核细胞分离以及外周血单个核细胞冻存与免疫表型分析方面提供的建议。

获取患者的知情同意，并完全遵守各司法管辖区相关的国家伦理要求（例如，《人体组织法案》（HTA—英国，2004年）和《健康保险可携性和责任法案》（HIPAA—美国，1996年））是强制性的。在开始任何涉及人源材料的研究工作之前，必须确保已获得充分记录的伦理审批。本方案优化过程中所使用的血液来自志愿者推进医学小组（VAMP）（伦理编号16/EE/0459，研究编号CRF494，子研究编号001），该小组由英国剑桥国立健康研究院（NIHR）临床研究机构运行，并在与英国国立健康研究院（NIHR）剑桥生物医学研究中心签订的人体生物样本供应协议下提供。英国阿斯利康生物样本库（AstraZeneca Biobank）已获得人体组织管理局（Human Tissue Authority）的许可（许可证号：12109），并经国家研究伦理服务委员会（NREC）批准作为研究用组织库（RTB）（伦理审查委员会编号：17/NW/0207）。
1. 一般制备指导
注意：本方案中所有涉及未固定的血液、血浆和外周血单个核细胞（PBMCs）等人体样本的操作，均须假设这些样本可能携带潜在的传染性病原体，因此必须在适当的生物安全防护条件下进行。对于经检测已知病原体呈阴性的患者样本，也不应假定其无传染性，仍须采取相应的安全防护措施。由这些样本产生的废弃物应遵循相同的生物安全防护要求，并根据当地规定进行处理和处置。
<ol>
	<li>选择使用柠檬酸钠或肝素钠作为抗凝剂的两种单个核细胞制备管之一。对于许多后续应用，这两种抗凝剂可互换使用，但在试验中选定一种之前，应分别进行测试。</li>
	<li>将一个8 mL的单个核细胞制备管标记为用于采集患者编码ID的血样。将试管置于室温（18–25 °C）保存。</li>
	<li>将1× PBS储存在室温（18–25 °C）。每次制备使用30 mL。</li>
	<li>确保用于分离血浆样本的试管以及用于PBMC样本的冻存管均按照实验室手册相应部分的规定，用唯一的标识符准确标记。</li>
	<li>若PBMC将用于监测磷酸化蛋白，需配制添加磷酸酶抑制剂的PBS：将5 mL PBS与50 µL磷酸酶抑制剂混合物2和50 µL磷酸酶抑制剂混合物3混合。现配现用，并置于冰上保存至使用前。</li>
	<li>若PBMC需进行冷冻保存，按每份样本配制1 mL冻存液，由90% FBS + 10% DMSO混合而成。</li>
</ol>
2. PBMC 的采集（图1A）
<ol>
	<li>采用制造商提供的标准技术，将8 mL血液注入单个核细胞制备管中。轻轻颠倒混匀8至10次，使抗凝添加剂与血液充分混合。切勿振荡，以免引起溶血。记录采血时间。</li>
	<li>采集后，将试管直立放置于室温下，直至离心。样本应尽快处理，最好在采血后1 h内开始，最迟不得超过4 h。记录开始处理血液的时间。</li>
	<li>离心前，轻轻倒置试管8到10次，重新混匀血液样本。</li>
	<li>将试管/血液样本管置于水平转子（摆出式转头）中，以1,500 – 1,800离心 x g 30分钟，室温（18-25 °C）。确保所有离心管均正确平衡。</li>
</ol>
<img alt="血浆分离示意图及用于PBMC分离和冻存的离心机设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：实验流程总览及离心机的代表性图像。（A）PBMCs和血浆制备流程的示意图。*如果时间受限，步骤2.4可缩短至20分钟，步骤3.3至3.6可省略。** 如需，可取部分样本进行细胞计数。*** 若进行ctDNA分析/代谢组学，需额外增加两次离心步骤。（B）用于步骤2.4的水平转头离心机设置图像。（C）转子图像，包含两个装有适配器的吊桶，用于离心单个核细胞制备管。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
注意：x g（也称为相对离心力，RCF）与 RPM（每分钟转数）是不同的单位。务必将离心机设置为 x g（RCF）。请使用在线计算器（参见材料表）进行换算。如果仅有固定角转子可用，则在此步骤中以 1,500 – 1,800 x g 离心 10 分钟。
<ol start="5">
	<li>离心后，检查屏障下方是否存在深红色层（主要含有红细胞），以及屏障上方的两层。最上层为血浆（呈淡黄色），其下方的白色层为含有外周血单个核细胞（PBMCs）的血沉棕黄层（buffy coat）。将离心管置于深色或黑色背景前观察时，这些层次可清晰区分。</li>
</ol>
<img alt="血液分离过程；试管中PBMC的分离；实验室中的实验设置" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于分离PBMC的试管。（A）离心前的试管图像（步骤 2.4），左侧为空试管，右侧含有血液。（B）离心后PBMC层成功分离（步骤 2.5）。（C）离心后收集PBMC层并保留少量血浆以确保完全收集所有PBMC的图像（步骤 2.7）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
注意：如果这些层不可见，可能表明离心机设置有误。请确保使用了正确的离心机转子适配器，并正确设置了“x g” 的离心力。重复步骤 2.4。
<ol start="6">
	<li>离心后立即使用血清移液管将约一半的血浆（大约 4–5 mL）转移至已标记的带盖 15 mL 圆锥形离心管中，注意不要扰动 PBMC 层。将此血浆管暂时置于湿冰上保存，留待后续步骤 4 使用。暂存备用。</li>
	<li>使用巴斯德移液管插入 PBMC 细胞层中，完整收集整个 PBMC 层，并转移至另一个带盖的 15 mL 圆锥形离心管中。必要时可连同少量血浆一并吸取，以确保完全获取 PBMC 层。通常体积为 1–2 mL。随后立即进行下文的步骤 3。</li>
</ol>
3. PBMC 洗涤步骤
注意：洗涤步骤的目的是稀释并去除PBMC沉淀中残留的血小板和血浆。所有离心步骤均应在室温（18–25 °C）下进行。
<ol>
	<li>加入室温 PBS 至 PBMC 管中，使总体积达到 15 mL。盖上管盖，轻轻倒置管子 5 次以混匀细胞。</li>
	<li>以 300 x g 离心 15 分钟。注意，此步离心力度远比初次离心温和。</li>
	<li>将管子置于深色/黑色背景前观察沉淀。通过真空抽吸或移液器去除上清液（图 3A）。弃去上清液，仅留约 500 μL 液体覆盖在呈乳白色 PBMC 沉淀上方。</li>
</ol>
<img alt="离心过程及沉淀形成；图像显示试管中可见的沉淀结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：PBMC 沉淀物。（A）第一次洗涤步骤（3.3）中获得的沉淀物。（B）第二次洗涤（步骤 3.7）中分离的沉淀物。（C）第二次洗涤（步骤 3.6）中分离的沉淀物，该样本因采血后超过 4 小时才处理血液，出现高水平溶血。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>用残留的上清液轻轻吹打沉淀，使细胞重新悬浮。</li>
	<li>加入适量的 1× PBS，使总体积达到 10 mL。盖紧管盖，轻轻倒置混匀 5 次。若研究方案中需要进行细胞计数，则进入步骤 3.5.1；若无需计数，则直接进入步骤 3.6。
	<ol>
		<li>取 40 μL 重悬的细胞悬液，与 40 μL 台盼蓝混合，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数活细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤 3.5 得到的细胞悬液在 300 x g 条件下离心 10 分钟。尽可能多地吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>使用细尖巴斯德移液管或微量移液器小心吸除并弃去细胞沉淀上方残留的上清液，避免扰动细胞沉淀。此步骤完成后，沉淀上方应仅残留极少量或无液体。若本方案的终点为 PBMC 沉淀，则进入步骤 3.8；若终点为冻存的 PBMC，则进入步骤 3.10。</li>
	<li>向沉淀中加入 50 µL 新鲜 PBS（或根据实验终点需要，使用步骤 1.5 中配制的含补充成分的 PBS），用微量移液器轻轻吹打数次，使所有细胞均匀重悬。将全部细胞悬液转移至已标记的 1.5 mL 冻存管中，并立即置于湿冰上，直至进行样品冷冻。</li>
	<li>通过将标记好的样品置于液氮中或直接放入干冰中进行冷冻。也可使用细胞冻存盒在 -80 °C 冰箱中冷冻细胞。若采用此方法，需先将冻存盒在 -80 °C 预冷至完全降温后再放入细胞管。记录细胞沉淀冷冻的时间。细胞冻结后，储存于 -80 °C，运输时应保持在干冰中冷冻状态。</li>
	<li>可选：如需冻存 PBMC，将细胞沉淀重悬于 1 mL 冻存液（步骤 1.6）中，转移至已标记的冻存管。后续操作同步骤 3.9 所述，但此情况下仅允许使用细胞冻存盒进行样品冷冻。样品在冻存盒中至少放置 24 小时后，再转移至液氮中用于运输和长期储存。</li>
</ol>
4. 血浆制备步骤（图1A）
<ol>
	<li>在 -80 °C 保存 PBMC 沉淀后，现在准备在步骤 2.6 中暂时置于湿冰上储存的血浆分装样品。如果样品用于 ctDNA 分析，则执行以下离心步骤以澄清血浆；否则直接进入步骤 4.2。
	<ol>
		<li>将血浆在 4 – 8 °C 条件下，以 1,600 – 2,000 x g 离心 10 分钟（使用固定角转子），或在水平转子中离心 15 分钟。</li>
		<li>小心吸取上清液血浆，注意不要扰动任何沉淀物，并转移至新的 15 mL 离心管中。弃去含有沉淀物的离心管。</li>
		<li>将血浆再次在 4 – 8 °C 条件下，以 1,600 – 2,000 x g 离心 10 分钟（使用固定角转子），或在水平转子中离心 15 分钟。</li>
		<li>小心将血浆上清液转移至新的 15 mL 离心管中，确保不扰动任何沉淀物。弃去含有沉淀物的离心管。 
		注意：若无冷藏离心机，每次离心之间可将样品置于冰上 5 分钟，或在低温房间内进行离心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将血浆以每份 1 mL 分装至 5 个新的 2 mL 微量离心管中。若血浆量不足以填满 5 个 1 mL 分装管，且预计最后一管血浆量少于 1 mL，则使用少于 5 个离心管。若血浆总量超过 5 mL，则弃去多余部分。记录每管中血浆的总体积。</li>
	<li>立即将分装好的血浆直立放置，并于 -80 °C 冷冻保存。</li>
</ol>
5. 样品运输
<ol>
	<li>将PBMC沉淀和血浆样本用干冰运输。</li>
	<li>确保样本在运输前和运输过程中未发生解冻。包装时需加入足量干冰，以保证样本在整个运输过程中保持冻结状态，并需考虑运输途中可能出现的延误情况。</li>
</ol>
6. 全血照射及DNA损伤应答生物标志物的蛋白质印迹分析（图4A）
注意：这是一种离体处理方法，在临床实践中大多数情况下并不需要，但这些实验是寻找合适临床生物标志物的有价值的探索性策略。血液样本应在采集后尽快进行处理，以确保获得最佳结果。
<ol>
	<li>预热X射线柜。将三个15 mL离心管分别标记为0、0.2和7 Gy。</li>
	<li>取来自同一供体的三个含有新鲜抽取血液的单个核细胞制备管，轻轻倒置混匀8至10次后，将血液转移至上述三个15 mL离心管中。</li>
	<li>将标记为0.2 Gy的离心管放入X射线柜中，关闭柜门，选择相应层架和剂量，对管内样本施加0.2 Gy的辐射剂量；随后调整柜内设定剂量，对7 Gy标记的离心管施加7 Gy的辐射剂量。</li>
	<li>将三个离心管在37 °C条件下孵育1小时。</li>
	<li>将血液重新转移回单个核细胞制备管中，并按照临床操作流程从步骤2.4至步骤3.8进行外周血单个核细胞（PBMC）的制备。</li>
	<li>向每个细胞沉淀中加入与沉淀体积相等的裂解缓冲液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）（本例中为70 μL RIPA缓冲液），用移液器吹打混匀，在冰上孵育10分钟。若有超声破碎仪，可对样品进行超声处理（3个循环，工作30秒/间歇30秒，4 °C）；若无此设备，可用注射器反复抽吸以剪切核酸，降低样品黏度。</li>
	<li>在4 °C条件下，以≥ 15,000 x g离心10分钟。将各上清液转移至新的1.5 mL离心管中，目视评估溶血程度（肉眼观察），并采用任意合适方法测定蛋白浓度。</li>
	<li>取40 μg总裂解液与含有SDS和还原剂的上样缓冲液混合，于金属浴中95–100 °C加热5分钟。</li>
	<li>在4–12% bis-tris蛋白凝胶的每个泳道中上样20 μg样品，每样本设两个复孔，进行SDS-PAGE电泳。</li>
	<li>电泳分离后，使用商用转膜系统将蛋白转移至硝酸纤维素膜（20 V，10分钟），随后用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭非特异性结合位点。</li>
	<li>根据目标蛋白的分子量裁剪膜，加入一抗溶液，在4 °C孵育过夜（抗体种类及稀释比例见材料表）。</li>
	<li>弃去一抗溶液，用TBST室温洗涤膜3次，每次5分钟。加入HRP标记的二抗，室温孵育45分钟。</li>
	<li>用TBST洗涤3次，每次5分钟。</li>
	<li>加入ECL化学发光试剂，检测并分析HRP信号对应的图像结果。</li>
</ol>

<ol><li>Hoelder, S., Clarke, P. A., Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+small+molecule+cancer+drugs%3A+successes%2C+challenges.+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Discovery of small molecule cancer drugs: successes, challenges. and opportunities.</a> Molecular Oncology. 6, 155-176 (2012).</li>
<li>Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deubiquitylating+enzymes+and+drug+discovery%3A+emerging+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 57-77 (2018).</li>
<li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+repair+in+cancer%3A+beyond+PARP+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA repair in cancer: beyond PARP inhibitors.</a> Cancer Discovery. 1, 20-37 (2017).</li>
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所有作者均曾是或目前是阿斯利康的员工和利益相关者。VM 是Acerta Pharma的员工，持有阿斯利康和吉利德科学公司的股票。

高质量的外周血单个核细胞和血浆制备物可在临床试验现场稳定且可重复地制备，对于明确临床试验中外周血预测性和药效动力学转化生物标志物终点具有重要价值。本文提供了一项简明清晰的实验方案，旨在解决既往在临床试验环境中易因操作不当而出现问题的关键步骤。然而，该方案还可根据特定需求进一步优化，例如针对时间限制等条件&#160;临床试验地点或下游分析类型（参见 补充文件).
为实现这一目标，我们展示了如何使用单个核细胞制备管从全血中分离外周血单个核细胞（PBMC）和血浆，以获得适用于多种下游分析的冻存PBMC沉淀和冻存血浆。我们特别强调了在步骤2.5中涉及离心及PBMC层识别，以及在步骤3.3和3.6中PBMC沉淀处理的关键操作环节。历史上，临床机构常出现的错误包括：将离心机设置为错误的单位（混淆相对离心力RCF或×g值与转速RPM值）、延迟血液样本处理、温度控制不当，以及在冻存细胞沉淀上方残留大量PBS液体。在大多数离心机转子中，若将×g值误输入为RPM设置，会导致显著的离心不足，从而造成PBMC层界限不清甚至缺失，并可能在洗涤步骤中因细胞沉淀效率低下而意外丢弃PBMC。然而，即使使用正确的离心参数和转子适配器，若患者出现白细胞减少症（leukopenia），也可能无法观察到PBMC层。该情况可能影响接受化疗或放疗的肿瘤学试验受试者，应予以考虑。本方案中另一个明确指出的关键点是：血液采集后必须在1–2小时内完成样本处理，以降低溶血对实验流程的不利影响。此外，尽量在采血后1小时内完成处理，可减少体外变异，这对药代动力学读数以及受血液保存或活性信号通路影响的生物标志物具有重要影响，如图4所示案例。若延迟样本处理，还可能对细胞活力产生不利影响，特别是当细胞需进行冷冻保存时34。另一个影响PBMC得率和红细胞污染程度的因素是储存与离心温度，应保持在室温（18–25 °C）。较低温度会增加密度梯度介质的密度，导致更多红细胞和粒细胞污染，因为这些细胞聚集效果较差。相反，较高温度会导致PBMC被困在聚集的红细胞之间，从而降低制备得率15,27,28。最后，至关重要的是，在冻存管中细胞沉淀所携带的液体体积不得超过50–100 µL，否则将对后续PBMC制备物中获得的蛋白裂解液浓度产生负面影响。过量液体将过度稀释样本，导致蛋白浓度极低的裂解液，不适合用于生物标志物分析。此外，任何翻译后修饰的保存效果也将受损，且裂解效率会显著降低。
选择单个核细胞制备管，因其在单次采血中可最简便地同时分离外周血单个核细胞（PBMC）和血浆，且据我们经验，具有优异的可重复性。该血液处理过程无需高度熟练的操作人员，且单管操作避免了血液稀释及转移至其他管的步骤，从而降低了生物危害风险；由于离心过程中可开启刹车，缩短了操作时间；所有试剂均已预置于管内，减少了实验变异。据我们经验，相较于仅使用密度梯度分离介质的传统方法，尽管此类试管成本较高，但其优势更为显著。27,28 (&#163; 60个单位需410，而66份50 mL淋巴细胞分离液制备需 &#163; 215）。它们提供两种抗凝剂类型：肝素和柠檬酸盐，这两种抗凝剂在维持分离所得PBMC功能活性方面具有可比性。35因此，选择一种抗凝剂而非另一种应基于肝素或柠檬酸盐对下游生物标志物研究可能产生的影响。已有研究表明，与肝素或柠檬酸盐相比，EDTA管可提供最高的外周血单个核细胞分离得率13仅使用一个试管操作的便捷性可以弥补这一考虑。如果需要分析细胞因子，则抗凝剂可能会影响血浆中检测到的细胞因子水平，因此在为临床试验选择抗凝剂之前，应先对两种抗凝剂进行测试。36若血浆将用于代谢组学研究，建议使用肝素作为抗凝剂37因此，对最终用户或临床试验转化科学家而言，唯一需要根据成本评估来决定的问题是，柠檬酸盐或肝素哪种更适用于其研究目的。
尽管与细胞分离管的局限性（成本较高且可用的抗凝剂种类有限）相比，其优势众多，但在临床试验中（尤其是肿瘤学领域）利用外周血单个核细胞（PBMC）或血浆获取药效学生物标志物的主要局限性可能与分离方法无关。除血液系统肿瘤可直接从外周血中取样外，其他癌症适应症中的血浆和PBMC均为替代性组织，未必能真实反映原发肿瘤的情况。外周组织可能与原发肿瘤在基因组和表观基因组上并不一致，因此，依赖特定肿瘤突变的外周生物标志物分析主要局限于血浆中的循环肿瘤DNA（ctDNA）分析或通过进一步分选PBMC层获得循环肿瘤细胞（CTC）。此外，驱动或促进肿瘤增殖的信号通路在外周血中可能并不同样活跃。这一挑战可通过应用靶向血液的生物标志物发现策略8来识别替代性生物标志物，或结合离体处理与血浆38及PBMC制备26的方法加以克服。
在当前方案中，冷冻的PBMC沉淀可在临床场所外轻松处理，以获得可用于Western印迹或ELISA技术检测的蛋白质裂解物。替代方案&#160;已提出利用PBMCs以实现免疫组化（IHC）方法的技术补充文件此外，我们还详细说明了PBMCs的冷冻保存可能性（参见 补充文件用于免疫细胞监测，这在肿瘤学中是一项重要应用，因为免疫检查点抑制剂和抗体药物偶联物（ADCs）正越来越多地在临床试验中进行测试。对免疫功能（如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，ADCC）的评估16 以及免疫表型分析是可与从单个核细胞制备管中分离的冻存PBMCs兼容的应用15关于冷冻保存存在一个注意事项，即冷冻可能引起某些表面和内部标志物的下调，并可能损害某些细胞功能；然而，由于在处理来自多个临床中心的样本并转运至外部实验室时存在时间限制，PBMC的冷冻保存是实施这些检测的唯一可行方法。14,15，而这些不利影响可通过良好的解冻方法和静置期显著克服39.
总之，本方案可在任何配备常规设备和材料的临床机构中可靠地制备PBMC和血浆样本，从而在全球多中心临床试验中稳健地实现外周血的转化研究终点。
最后，我们通过展示关键DNA损伤应答（DDR）因子的剂量依赖性翻译后修饰，证明了PBMC裂解物的分析可在机制层面上揭示对DNA损伤剂的应答，从而有助于指导临床开发。展望未来，采用比Western印迹更定量（例如质谱法40）且所需样本量更少的技术（如毛细管Western印迹和ELISA），将有助于推动这些临床前结果向对PBMC患者样本进行更可靠、系统的评估迈进。

药物研发旨在提供针对未满足医学需求的新型治疗方法，以及更精准、个性化的医疗手段。目前有多种药物作用机制正处于积极研究之中，包括酶抑制（如激酶1、蛋白酶2或多聚（ADP-核糖）聚合酶&#160;(PARP)抑制剂3）、蛋白质降解剂4、治疗性抗体5以及抗体偶联药物（ADCs）6等。在肿瘤学领域，为获得更优治疗方案的一个实例是使用激酶抑制剂，以期阻断促使癌细胞持续增殖的信号级联反应1,7。检测这些激酶特异性底物磷酸化水平，是量化此类抑制剂作用机制的最佳药效动力学生物标志物8。其他药物可能调节特定蛋白质的表达水平，此时，在整个治疗过程中纵向定量其靶蛋白浓度变化的能力至关重要。因此，无论药物或疾病的具体特征如何，评估生物标志物以建立药物暴露与靶点调节之间的药代动力学（PK）/药效动力学（PD）关系，是早期临床开发中的最佳实践，有助于确定安全且耐受的药理活性剂量和给药方案9。
在肿瘤学的临床开发中，尽管通过活检进行生物标志物分析可能是验证药物作用机制的最佳途径，但试验中可获得的活检样本数量通常非常有限10,11. 或者，外周血样本对临床试验具有重要价值，因其采集过程创伤小、快速且易于获取，便于进行纵向分析，成本低于活检，并可提供&#160;大量信息可用于实时监测治疗效果。在外周血中评估药效学生物标志物的另一优势在于，可利用同一生物样本同时定量药代动力学（PK），从而精确建立PK/PD定量关系，并进行后续的PK/PD建模12,13外周血单个核细胞（PBMCs）可从全血中分离，用于研究蛋白质标志物，这些标志物的表达水平或翻译后修饰可能发生改变。此外，PBMCs还可用于免疫表型分析。14,15，免疫功能检测，例如评估抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）16 通过RNA提取进行表观遗传学分析。同样，全血中的血浆可用于定量细胞因子，以表征患者的免疫学反应，开展代谢研究，以及分离和测序循环肿瘤DNA（ctDNA），从而监测疾病在治疗药物选择压力下的克隆演化过程，常为治疗耐药提供机制性依据17,18,19 促进后续几代治疗药物的开发20最后，从外周血中分离循环肿瘤细胞（CTCs）可用于通过纵向计数、DNA/RNA测序以及蛋白质生物标志物分析来评估疾病进展。21尽管这种分离方法与本文所述方案相容22，许多癌症类型及疾病早期阶段中循环肿瘤细胞（CTCs）的丰度较低，这使得使用专用采血管更为合适&#160;最大限度减少CTC降解23.
近年来，液体活检的应用提高了临床试验中获得的信息质量，许多研究已将外周血单个核细胞（PBMC）的采集纳入其中，用于监测靶点结合情况及作用机制验证，这些监测可直接在某些血液系统恶性肿瘤的肿瘤细胞中进行，或在PBMC本身上作为肿瘤细胞的药效学（PD）替代指标24,25,26。高质量样本的制备有助于确定针对特定病理状况最安全且最有效的治疗方案；但根据我们的经验，来自不同临床机构的PBMC制备样品质量存在较大差异，导致部分样品&#160;无法满足后续分析的要求，进而影响了从这些研究中可获取的药效学数据量。
本文详细描述了一种易于遵循的实验方案，用于在临床环境中通过单次采血高效地同时分离外周血单个核细胞（PBMCs）和血浆样本。该方案基于单个核细胞分离管制造商提供的操作说明，并结合了实际应用中的经验改进，针对临床机构报告的执行难点进行了优化，例如离心问题、处理延迟以及向冻存管转移样本等操作。此外，也有其他商业化的替代方法可用于单个核细胞的分离，这些方法依赖于使用多糖溶液进行密度梯度离心，可选择性地加入或不加入将溶液与血液分隔的屏障27。如果相关临床机构已熟练掌握此类替代方法，则可合理采用这些方法替代本方案。在此类情况下，需考虑两个因素：部分替代方法需要将全血从采集管转移至另一分离管，这一额外的人源性原始生物材料转移步骤可能带来轻微增加的安全风险；而无屏障分离的方法则依赖关键操作步骤，例如将血液样本小心地铺置于密度梯度介质之上，这需要较高的技术水平，而此类技术能力在医院实验室环境中并不总是具备。尽管如此，总体而言，这些技术在细胞活力和回收率方面具有可比性15,28。因此，方法的选择在一定程度上取决于既往的技术经验。但在我们的实践中，单个核细胞分离管在广泛的临床背景下均能成功应用，故为我们的推荐方案。
本方案的一个终点是制备用于进一步处理成裂解物的外周血单个核细胞（PBMC）沉淀，但PBMC收集物也可用于其他最终应用，例如核酸的提取，或制备适用于免疫组织化学（IHC）方法的PBMC涂片或PBMC包埋块。重要的是，由于从患者采集的每份生物样本至少在某种程度上属于侵入性操作，本方案通过同时分离血浆以用于细胞因子分析、代谢组学研究或循环肿瘤DNA（ctDNA）测序，最大限度地提高了每份样本的可用材料利用率。
在外周生物标志物分析中，外周血单个核细胞（PBMC）裂解物在肿瘤学临床试验中有多种应用。其中一个例子是评估化疗、放疗或使用DNA损伤应答（DDR）相关酶抑制剂（如磷脂酰肌醇-3激酶相关激酶（PIKKs）7和PARPs3,13）治疗过程中的DNA损伤应答。这些治疗方法旨在增加增殖细胞中的DNA损伤，从而对DDR机制和细胞周期检查点功能受损的细胞（如癌细胞）产生高毒性。本文展示了一个示例，即对接受X射线照射后的外周血中DDR生物标志物进行&#160;研究。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 冻存管</td><td>Nalgene, ThermoFisher</td><td>5000-1020</td><td>用于储存 PBMC 沉淀及重悬后的 PBMC</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>VWR</td><td>525-0990</td><td>此为示例，可使用您偏好的供应商</td></tr><tr><td>15 mL 无菌聚丙烯锥形离心管</td><td>Nunc, ThermoFisher</td><td>339651</td><td>可使用其他品牌</td></tr><tr><td>2 mL 带螺帽的无菌管，帽盖固定</td><td>ThermoFisher</td><td>3463</td><td>用于血浆分装</td></tr><tr><td>20X TBS 缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28358</td><td>终浓度为 25 mM Tris、0.15 M NaCl；pH 7.5。此为示例，可自行配制母液或使用其他供应商产品</td></tr><tr><td>20X TBS Tween 20 缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28360</td><td>或向 TBS 中添加 0.05% Tween 20 以配制 TBST 缓冲液</td></tr><tr><td>自动细胞计数仪或血细胞计数板</td><td>ThermoScientific</td><td>AMQAX1000</td><td>我们使用 Countess 设备及载片，但也可采用其他方法</td></tr><tr><td>可调节移液器，可准确量取 50 &amp;micro;L 体积</td><td></td><td></td><td>用于处理小体积液体（如 Western blot、将 PBMC 沉淀转移至 1.5 mL 管）</td></tr><tr><td>BD Vacutainer CPT 单个核细胞分离管（含柠檬酸钠或肝素钠），8 mL</td><td>BD</td><td>362761, 362753</td><td>存在 4 mL 规格管，但若条件允许，建议使用 8 mL 管，以便单次采血获得更多的 PBMC</td></tr><tr><td>细胞冻存盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>此为示例，可使用您偏好的供应商</td></tr><tr><td>离心机转速单位转换器</td><td>LabTools</td><td></td><td>http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, MERK</td><td>D2438</td><td>可使用您偏好的供应商。用于 PBMC 冻存</td></tr><tr><td>ECL 辣根过氧化物酶底物</td><td>ThermoFisher</td><td>34075</td><td>根据 Western blot 检测目标生物标志物所需的灵敏度，选择您偏好的试剂。也可使用其他系统，如 IRDye 标记的二抗配合成像系统</td></tr><tr><td>Faxitron MultiFocus X 射线柜</td><td>Faxitron Bioptics</td><td></td><td>用于血液辐照。其他型号或制造商亦可使用</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），热灭活</td><td>ThermoScientific</td><td>102706</td><td>可使用您偏好的供应商。用于 PBMC 冻存</td></tr><tr><td>细尖头、无菌 1.5 mL 巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>414004-018</td><td>可选</td></tr><tr><td>固定角转子离心机</td><td></td><td></td><td>可选，用于 ctDNA/代谢组学血浆样本制备</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>SYNGENE</td><td></td><td>用于成像 HRP 显色后的膜</td></tr><tr><td>加热块</td><td></td><td></td><td>用于 Western blot 前裂解液的变性，任何配备合适管适配器的厂家设备均可</td></tr><tr><td>水平转子（摆动头）离心机</td><td>Thermoscientific</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>此为示例</td></tr><tr><td>液氮/干冰</td><td></td><td></td><td>用于样本的速冻</td></tr><tr><td>Marvel 脱脂奶粉</td><td>Premier Foods</td><td></td><td>此为示例，可使用您偏好的供应商</td></tr><tr><td>适用于 1–200 &amp;micro;L 量程的移液器吸头</td><td></td><td></td><td>用于处理小体积液体（如 Western blot、将 PBMC 沉淀转移至 1.5 mL 管）</td></tr><tr><td>NuPAGE 4–12% Bis-Tris 蛋白凝胶，1 mm 厚，10 孔</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td>此为示例，可自行灌胶或使用您偏好的供应商</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 样品缓冲液（4X）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0007</td><td>用于成像 HRP 显色后的膜</td></tr><tr><td>NuPAGE 样品还原剂（10X）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0009</td><td>此为示例</td></tr><tr><td>PBS，不含钙、不含镁</td><td>Gibco, ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td>通常包含在临床试剂盒中</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物 2</td><td>Sigma-Aldrich, MERK</td><td>P5726-1ML</td><td>步骤 3.7 可选</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物 3</td><td>Sigma-Aldrich, MERK</td><td>P0044-1ML</td><td>步骤 3.7 可选</td></tr><tr><td>兔抗 GAPDH 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>CST 2128</td><td>在 5% 脱脂奶粉 TBST 中按 1:1000 稀释</td></tr><tr><td>兔抗 &amp;gamma;H2AX 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>CST 2577, lot 11</td><td>在 5% 脱脂奶粉 TBST 中按 1:2000 稀释</td></tr><tr><td>兔抗 pS1981 ATM 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab81292</td><td>在 5% 脱脂奶粉 TBST 中按 1:2000 稀释</td></tr><tr><td>兔抗 pS635 RAD50 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>CST 14223</td><td>在 5% 脱脂奶粉 TBST 中按 1:1000 稀释</td></tr><tr><td>兔抗总 ATM 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab32420</td><td>在 5% 脱脂奶粉 TBST 中按 1:1000 稀释</td></tr><tr><td>兔抗总 RAD50 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>CST 3427, lot 2</td><td>在 5% 脱脂奶粉 TBST 中按 1:1000 稀释</td></tr><tr><td>RIPA 缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich, MERK</td><td>R0278-50ML</td><td>用于细胞裂解。此为示例，可使用您偏好的供应商</td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Diagenode</td><td>B01060010</td><td>使用条件为 4 °C 下循环 3 次，每次 30 秒开启、30 秒关闭。若使用其他仪器，请根据设备性能调整循环次数和强度</td></tr><tr><td>无菌 1.7 mL 巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>414004-030</td><td>此为示例，可使用您偏好的供应商</td></tr><tr><td>无菌移液管（5 mL 和 10 mL 容量）</td><td>Costar</td><td>4101, 4051</td><td>此为示例，可使用您偏好的供应商</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>ThermoScientific</td><td>T10282</td><td>用于上述自动细胞计数仪</td></tr><tr><td>湿冰</td><td></td><td></td><td>用于保持血浆样本和裂解液低温</td></tr></tbody></table>

临床试验现场单次采血制备外周血单个核细胞团块及血浆用于生物标志物分析

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

外周血中生物标志物的分析在临床试验中正变得越来越重要，可用于验证治疗作用机制、评估治疗效果，并协助确定药物的剂量和给药方案。通过单次采血，可分离并处理外周血单个核细胞（PBMC），用于分析和定量蛋白质标志物；同时，血浆样本可用于循环肿瘤DNA、细胞因子及血浆代谢组学的分析。治疗过程中的纵向样本可提供特定蛋白质标志物动态变化、患者突变状态及免疫微环境演变的信息。只有在外周血样本于临床现场得到高效处理，并且从床旁到实验室的整个过程中样本均被妥善保存的情况下，上述目标才可实现。本文介绍了一种优化的通用型实验方案，可在多中心临床试验的各临床现场实施，用于获取PBMC沉淀和血浆样本，使医院实验室的临床专业人员无论其技术水平高低，均能成功提供高质量的样本。此外，还提供了针对特定下游分析方法优化的替代性方案变体。我们应用该方案研究X射线照射血液中针对DNA损伤应答（DDR）的蛋白质生物标志物，以证明该方法在已采用DDR药物和/或放射治疗的肿瘤学临床场景，以及需要进行机制性假设验证的临床前阶段中的适用性。

为了提高我们在临床试验中PBMC制备的质量，我们制定了一项操作步骤简洁明确的方案，可供医院实验室专业人员遵循，无论其分子生物学背景或实验技能水平如何。我们对生产商提供的方案进行了改进，针对在多个多中心临床试验参与机构中发现或报告存在问题的步骤进行了优化。然而，该方案仍可根据特定需求进一步优化，例如临床现场的时间限制或下游分析的类型（参见补充文件）。我们证实，可通过检测辐射诱导DNA损伤后特定生物标志物的变化，来分析PBMC中的DNA损伤反应（DDR）。
我们从临床机构收到的最常见问题与离心步骤有关，这些步骤直接影响能否成功分离外周血单个核细胞（PBMC）并获得最终的PBMC沉淀。使用适当类型的水平转子离心机（图1B,C）是本实验方案成功的关键。然而，当临床机构仅配备固定角转子离心机时，我们建议在与水平转子相同的相对离心力（RCF）条件下执行步骤2.4，但离心时间缩短至10分钟。这可确保PBMC层与血浆有效分离（见图2B,C）。在将血液叠加于密度梯度分离介质时，离心过程需关闭刹车；而在使用单个核细胞分离管时，由于管内含有凝胶屏障，可防止较重的血液组分与PBMC层混合，因此离心时可开启刹车27,28。
通过8 mL试管中的血液离心，可获得至少4 mL高质量、未稀释的血浆，该血浆可进一步澄清后用于ctDNA测序或代谢组学研究等特殊分析29,30（可选步骤4.1.1–4.1.4）。分离得到的PBMC数量、沉淀物大小以及溶血或红细胞污染情况，也是临床机构和样本分析经验中关注的问题。从8 mL血液中获得的细胞数量因患者及疾病状态而异，但通常沉淀物体积较小，呈透明或白色（图3A,B）。由于这些特性，在洗涤步骤（2.5和3.3）中应将沉淀置于深色背景下观察，以避免意外吸除。有时沉淀可能因红细胞污染而呈现红色（图3C），这会对制备质量产生不利影响。为避免丢失如图3所示的小沉淀物，可通过步骤3.7将PBMC沉淀重悬于50 µL PBS中，从而便于将其转移至冻存管。
使用这些试管和健康个体血液时的典型得率范围为 7 至 21 x 106 8 mL 培养基中的细胞，细胞回收率为 70% 至 80%，这符合我们的经验，也与先前的研究结果一致27,28这取决于具体的细胞计数以及操作者，且与其他使用密度梯度法（包括使用带有分离屏障的试管系统）获得的细胞数量和细胞回收率具有可比性。15,27,28. 根据不同疾病状态，采用本方法分离的PBMC数量可能存在差异，一个典型的例子是慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者PBMC标志物的分析。按照本方案操作时，从一支8 mL单个核细胞分离管中获得的细胞数量变化范围为1.62 × 104 至 1.99 × 109 在研究 NCT03328273 中获得的来自 7 名患者的 45 份样本中31 (表1）。与此相关的一个参数是通过该方法获得的PBMC裂解液的蛋白浓度，其取决于分离的细胞数量以及蛋白提取效率。第6节中裂解的细胞沉淀采用RIPA裂解缓冲液并结合超声处理（步骤6.6）制备。通常将细胞沉淀以等体积的裂解缓冲液重悬后，蛋白浓度范围为3至10 mg/mL；在此特定示例中，0、0.2和7 Gy组的裂解液浓度分别为6.8、8.3和8.6 mg/mL。然而，当接收来自临床样本且样本未经过优化制备时，蛋白浓度存在较大变异性，这可能与患者的疾病状态以及红细胞污染导致的血红蛋白存在有关。例如，体积非常小的细胞沉淀需使用大于沉淀体积的裂解缓冲液进行重悬，以便进行蛋白浓度测定及后续生物标志物分析，但这会导致样本稀释程度更高。在此情况下，若样本蛋白浓度低于1 mg/mL，则可能因稀释倍数过高而对Western blot等检测造成困难。相比之下，在前述慢性淋巴细胞白血病（CLL）样本中，用于重悬细胞沉淀的裂解缓冲液体积在50至 500 μL，蛋白质浓度范围为1.62至19.77 mg/mL（表1).
当样本出现红细胞污染或溶血（图3C）时，由于红细胞中的血红蛋白被纳入，PBMC裂解液的蛋白浓度会被高估。因此，应按照方案第6.7步所述，对这类样本进行肉眼观察和标注。在进行生物标志物分析时，只要实验中包含上样对照，过量上样可在一定程度上补偿血红蛋白的干扰。也可采用其他更为定量的方法来评估溶血程度，例如在414 nm处测定吸光度32。
采用本临床方案获取的外周血单个核细胞（PBMCs）对DNA损伤应答（DDR）进行了分析。为模拟放射治疗或化疗等可导致DNA损伤的临床治疗情境，对来自健康志愿者的全血进行了体外X射线辐照（图4A）。电离辐射（IR）如X射线可诱导多种类型的DNA损伤，包括DNA双链断裂（DSBs）。这些损伤的DNA感应会激活PIKK激酶家族成员，如共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）、ATM及Rad3相关蛋白（ATR）以及DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK），从而启动同源重组（HR）或非同源末端连接（NHEJ）等DNA修复机制。当DSBs存在时，ATM通过MRN复合物（MRE11-RAD50-NBS1）被募集至损伤位点，进而发生自身磷酸化，如在Ser1981位点的磷酸化，从而激活ATM。活化的ATM继而磷酸化MRN复合物组分及其他蛋白，例如组蛋白变体H2AX在Ser139位点（pSer139-H2AX亦称为γH2AX），从而引起从DSB位点延伸的染色质结构改变，促进其他DDR因子的募集33。尽管PBMCs增殖率较低，但其对电离辐射具有响应性；质谱方法已实现了对ATM介导的RAD50蛋白Ser635位点磷酸化上调的定量检测。在ATM抑制剂存在下，RAD50 pS635的磷酸化水平降低，且通过免疫组织化学已进一步验证RAD50 pS635可作为肿瘤中临床ATM抑制剂治疗的药效学生物标志物8。为评估PBMCs对辐射的应答，采集健康志愿者血液并施加不同剂量的电离辐射，随后在37 °C孵育1小时后采集样本（图4A）。为此，血液被转移至塑料管中，以避免因高温导致PBMC分离得率降低（步骤6.2）。我们不仅检测了已有报道的RAD50 pS635，还分析了ATM pS1981和γH2AX，以评估ATM的激活情况。在三种情况下，均观察到随着IR剂量增加，这些翻译后修饰水平上升（图4B）。值得注意的是，在0.2 Gy的低剂量下，ATM和RAD50的磷酸化已较为显著，提示这些翻译后修饰有望作为涉及DNA双链断裂生成的治疗方案的药效学生物标志物，具有良好的动态范围，不仅适用于肿瘤组织，也适用于外周血。这使得可通过在治疗过程中纵向采集样本，实现对药效学反应的动态监测。从采血到样本处理的时间至关重要，必须确保信号级联仍处于活跃状态，因为处理延迟将影响此类级联反应的动力学，可能导致作为磷酸化标志物的磷酸化事件被遗漏。
<img alt="血液照射过程示意图及显示蛋白质定量结果（ATM、RAD50）的Western印迹图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：根据当前临床方案对离体照射后的血液分离出的外周血单个核细胞（PBMCs）显示了可反映治疗所致DNA损伤程度的生物标志物。（A）全血照射后PBMCs制备及DNA损伤应答（DDR）分析流程的示意图。*若需进行循环游离DNA（ctDNA）分析或代谢组学研究，需额外增加两步离心。（B）Western印迹结果显示PBMCs中DNA损伤应答相关磷酸化生物标志物的表达呈剂量依赖性上调。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>样本</td>
			<td>每 8 mL 血液中的 PBMC 数量</td>
			<td>添加的 RIPA 裂解缓冲液体积 (μL)</td>
			<td>最终浓度 (mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A.1</td>
			<td>39100000</td>
			<td>70</td>
			<td>12.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A.2</td>
			<td>97400000</td>
			<td>100</td>
			<td>4.54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A.3</td>
			<td>233000000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A.4</td>
			<td>316000000</td>
			<td>150</td>
			<td>16.87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A.5</td>
			<td>387000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A.6</td>
			<td>459000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.71</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A.7</td>
			<td>414000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A.8</td>
			<td>253000000</td>
			<td>150</td>
			<td>14.56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A.9</td>
			<td>509000000</td>
			<td>300</td>
			<td>10.67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.1</td>
			<td>15200000</td>
			<td>70</td>
			<td>2.96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.2</td>
			<td>10500000</td>
			<td>50</td>
			<td>4.59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.3</td>
			<td>13200000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.4</td>
			<td>34800000</td>
			<td>100</td>
			<td>10.41</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.5</td>
			<td>1620000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.6</td>
			<td>70200000</td>
			<td>100</td>
			<td>9.26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.7</td>
			<td>65400000</td>
			<td>100</td>
			<td>12.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B.8</td>
			<td>91100000</td>
			<td>150</td>
			<td>11.82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.1</td>
			<td>6330000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.2</td>
			<td>4400000</td>
			<td>150</td>
			<td>19.77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.3</td>
			<td>68000000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.4</td>
			<td>35100000</td>
			<td>50</td>
			<td>9.30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.5</td>
			<td>35400000</td>
			<td>70</td>
			<td>10.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C.6</td>
			<td>99200000</td>
			<td>100</td>
			<td>16.19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.1</td>
			<td>402000000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.2</td>
			<td>826000000</td>
			<td>300</td>
			<td>16.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.3</td>
			<td>1990000000</td>
			<td>300</td>
			<td>14.87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.4</td>
			<td>1000000000</td>
			<td>300</td>
			<td>18.34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.5</td>
			<td>1160000000</td>
			<td>400</td>
			<td>16.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D.6</td>
			<td>806000000</td>
			<td>400</td>
			<td>19.40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.1</td>
			<td>302000000</td>
			<td>300</td>
			<td>13.86</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.2</td>
			<td>990000000</td>
			<td>500</td>
			<td>19.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.3</td>
			<td>1200000000</td>
			<td>400</td>
			<td>17.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F.1</td>
			<td>4010000</td>
			<td>50</td>
			<td>1.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F.2</td>
			<td>5170000</td>
			<td>50</td>
			<td>2.84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F.3</td>
			<td>2810000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.69</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F.4</td>
			<td>3700000</td>
			<td>75</td>
			<td>3.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F.5</td>
			<td>3460000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F.6</td>
			<td>7060000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G.1</td>
			<td>60700000</td>
			<td>70</td>
			<td>6.57</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G.2</td>
			<td>82100000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.78</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G.3</td>
			<td>30500000</td>
			<td>70</td>
			<td>8.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G.4</td>
			<td>134000000</td>
			<td>100</td>
			<td>15.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G.5</td>
			<td>91900000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G.6</td>
			<td>372000000</td>
			<td>150</td>
			<td>15.88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G.7</td>
			<td>574000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">对应于 7 名患者的纵向 PBMC 样本</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：慢性淋巴细胞白血病患者（CLL）外周血单个核细胞（PBMC）沉淀物的细胞数量和蛋白质浓度。 本表中的数据来自7名参与研究NCT03328273的CLL患者，共45份PBMC样本，样本采集于单个核细胞制备管中。这些数据是使用上述引用研究31中的样本生成的原始数据。
补充文件：替代实验方案选项。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60776/SupplementaryFile_July2020.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案详细介绍了在临床试验现场可实际应用的高质量外周血单个核细胞（PBMC）和血浆生物样本的制备方法，可用于转化生物标志物分析。

外周血中生物标志物的分析在临床试验中正变得日益重要，可用于提供作用机制的证据，以评估……

PBMC 和血浆样本易于获取，并且在早期临床开发中具有很高的信息价值。本稳健的方案可最大限度地减少在临床现场引入的分析前变异。该方案快速简便，仅需基本的实验室设备和较少的操作人员技术即可完成血液向 PBMC 和血浆的处理。该方法适用于医院繁忙的实验日程。通过本方案获得的血液成分可用于后续分析，以阐明药物的药代动力学与药效动力学关系、药物给药方案以及靶点结合的证据，同时有助于揭示药物的作用机制，支持实时分析与回顾性分析。我们已将该方案应用于肿瘤学研究，特别是用于分析DNA损伤应答机制。然而，通过本方案收集的材料可能与多种疾病领域和多种治疗方式相关。每份样本收到八毫升供体血液后，记录采血时间，并在将抗凝处理的血液样本转移至标有辐射处理的各试管之前，轻轻倒置试管8到10次。对于临床样本，倒置后应立即离心试管。将0.2戈瑞的试管放入预热的X射线辐照柜中，关闭柜门，对试管施加0.2戈瑞的辐射剂量。将低剂量辐照的试管替换为7戈瑞的试管，并调整剂量，对高剂量辐照样本施加7戈瑞的辐射剂量。两个样本完成辐照后，将全部三支试管在37摄氏度下孵育1小时。将样本转移至细胞制备管中，然后通过高速离心分离细胞，确保将离心机单位设置为 ×g 或等效的相对离心力（RCF）。离心结束后，将离心管置于深色背景前观察，以识别血浆层、红细胞层和白膜层。使用血清学移液管，将约一半的血浆转移至已标记的15毫升锥形离心管中，注意不要扰动白膜层，并将血浆管置于湿冰上保存。然后，使用巴氏吸管将含有 PBMC 的絮状层完全转移至新的 15 毫升离心管中，并加入室温 PBS 至每份样品终体积为 15 毫升。轻轻颠倒混匀 5 次，通过离心以较低速度收集细胞，注意确认离心机的单位设置。离心后，吸除上清液，仅保留最后 500 微升，避免扰动细胞沉淀。向每管中加入新鲜 PBS，使最终体积达到 10 毫升，并通过轻轻倒置试管重悬细胞。取 40 微升细胞悬液用于计数。计数后，再次离心收集细胞，并尽可能吸除上清液，注意不要扰动沉淀。为后续处理而保存PBMC时，需将沉淀物用新鲜PBS重悬，每份样本加入50 µL，轻轻吹打混匀，然后将全部细胞悬液转移至预先标记好的1.5 mL冻存管中，置于湿冰上。随后采用首选方法迅速冷冻细胞，并将冻存管放入-80 °C的冻存盒中。记录细胞冷冻的时间。或者，将沉淀物重悬于每份样品一毫升的冷冻混合液中，并将细胞悬液转移至预先标记的冻存管中。随后将冻存管放入预冷的冻存盒中，于负80摄氏度保存。为冷冻血浆，将血浆以每份不超过一毫升的等分试样分别加入最多五个2毫升微量离心管中，注意避免扰动残留的沉淀物，并记录每管中血浆的总体积。然后，立即将血浆分装样品在-80摄氏度冰箱中以直立方向速冻。用于样品的Western blot分析时，根据细胞沉淀体积，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的适量裂解缓冲液，通过轻柔吹打重悬各管中的沉淀，并将细胞样品在冰上孵育10分钟。孵育结束后，将样品转移至1.5毫升离心管中，在4摄氏度条件下进行超声处理，程序为3个循环，每个循环开启30秒、关闭30秒。通过离心收集样品，并将上清液转移至新的1.5毫升离心管中。然后，将每份样品各40微克与上样缓冲液混合，煮沸样品5分钟。每条泳道上样20微克，每个样品重复上样，在4–12% Bis-Tris蛋白凝胶中进行SDS-PAGE电泳。从八毫升血液中获得的细胞数量因患者和疾病情况而异。通常，细胞沉淀体积较小，呈透明白色。有时沉淀物可能含有少量红细胞污染，这会对制备质量产生不利影响。采用本方案从慢性淋巴细胞白血病患者样本中获得的典型产量为每8毫升单个核细胞制备物中含有1.62 × 10⁴至1.99 × 10⁹个细胞，最终蛋白浓度范围为1.62至19.77毫克/毫升。在对三名患者样本的代表性分析中，观察到随着电离辐射剂量的增加，翻译后修饰水平上升。有趣的是，在0.2戈瑞的低剂量辐射下，共济失调毛细血管扩张突变蛋白（ataxia-telangiectasia mutated）和RAD50的磷酸化水平已显著升高，这表明这些翻译后修饰在肿瘤及外周血样本中具有良好的动态范围，有望作为涉及DNA双链断裂的治疗方案的药效动力学生物标志物进行有效检测。为获得最佳的样本制备效果，应在室温下于采集后一小时内处理血液，正确离心样本，并将试管置于深色背景前观察，以便能够分辨出白膜层。

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