Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Generation oligodendrocyter och Oligodendrocyte-Konditionerat medium för samkulturexperiment
Chapters
Summary February 9th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Häri visar vi en effektiv metod för rening av oligodendrocyter och produktion av oligodendrocyte-konditionerat medium som kan användas för samkulturexperiment.
Transcript
Vi beskriver en effektiv metod för oligodendroglial härstamning celler rening och kultur. Detta gör det möjligt att ta itu med de molekylära mekanismer som styr oligodendrocytes differentiering och deras interaktioner med nervceller under myelination processen. Denna skakningsteknik är inte dyr och är optimal för att erhålla hög mängd oligodendrocyter.
Sådana kulturer tillåter produktion av oligodendrocyte-conditioned medium och co-kulturer av oligodendrocytes med nervceller. Multipel skleros är en sjukdom som orsakas av focal de-myelination i centrala nervsystemet, sekundärt till oligodendrocytes förlust. Oligodendrocytes kultur ger ett verktyg för bättre förståelse hur man kan främja re-myelination.
Endast oligodendroglial cell kultur kunde ge insikter i inneboende mekanismer som reglerar utvecklingen och biologi oligodendrocytes. Co-kulturer med nervceller gör det möjligt att få insikt i deras effekter på neuronal fysiologi. Till att börja, använd böjda typpor för att bibehålla djurets huvud i ögonhöjd.
Använd små kirurgiska saxar för att göra ett litet snitt vid basen av skallen och skär skallen efter hjärnans mittlinjen. Använd tensor för att försiktigt skala bort de två delarna av skallen från mittlinjen. Använd en liten kirurgisk sked för att ta bort hjärnan från huvudet hålighet.
Lägg hjärnan i en 60-millimeters petriskål som innehåller iskall PBS glukos på is. Visning under en stereo mikroskop, använd fina tärna för att ta bort lillhjärnan, hjärnstammen, och luktlökarna från hjärnhalvorna. Använd fina typpor för att separera de två hjärnhalvorna.
Använd fina tyfnor för att skala av hjärnhinnorna. Lägg hjärnkortikarna i en 60-millimeters petriskål på is. I en laminär flödeshuva, använd en skarp skalpell för att finhacka de cerebrala corticesna.
Överför den malda vävnaden till ett 50-milliliterrör som innehåller enzymspjältionsmedium. Inkubera i 30 minuter i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5%koldioxid. Därefter använder du en pipett för att försiktigt ta bort enzyms digestionsmediet samtidigt som du ser till att den kortikala vävnaden förblir i botten av röret.
Använd en P1000 mikropipette för att lägga till en milliliter DMEM 10%fetala kalv serum och försiktigt triturate vävnaden. Använd ett 70-mikronfilter och kolven i en en milliliterspruta för att filtrera kortikala vävnaden i ett 50-milliliterrör. Skölj restvävnaden på den inre rörväggen på 50-milliliterröret flera gånger med DMEM 10%fetalt kalvserum.
Fyll 50-milliliter röret med DMEM 10%fetala kalv serum. Centrifug vid 423 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatanten och resuspend cell pelleten med två milliliter DMEM 10%fetala kalv serum.
Försiktigt triturate cell pelleten med P1000 mikropipette och sedan, med P200 mikropipette. Späd cellen suspension med lämplig volym av DMEM 10%fetala kalv serum. Platta fem milliliter av cellupphängningen på en T-150 kolv vid en densitet av en gång 10 till de femte cellerna per kvadratcentimeter.
Tillsätt 20 milliliter varmt DMEM 10%fetala kalv serum till varje T-150 kolv. Inkubera i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5%koldioxid. Efter att ha skakat provet över natten vid 250 rpm och 37 grader Celsius, skörda supernatanten i kolven som huvudsakligen innehåller oligodendrocyte härstamningsceller, men också, vissa mikroglialceller, och platta den på icke-belagda petriskålar på 100 millimeter.
Inkubera Petri-disken i 15 minuter i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Detta möjliggör avlägsnande av mikrogliala celler genom differentiell snabb vidhäftning på skålen ytan. Under tiden fyller du varje T-150 kolv med 25 milliliter varmt, nyberedda odlingsmedium och inkuberar i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5 %koldioxid tills den andra skakningen.
Därefter överför du supernatanten från petri-disken till nya icke-belagda 100-millimeters petriskålar för att möjliggöra vidhäftning av kvarvarande mikroglialceller. Inkubera Petri-diskarna i 15 minuter i en befuktad inkubator vid 37 Celsius under 5 %koldioxid. Ta bort supernatanten från varannan petriskål, som innehåller icke-vidder oligodendrocyte härstamning celler, och överföra den till en 50-milliliter rör.
Kasta Petri-disken med mikroglia. Centrifugera rören i fem minuter vid 423 gånger g. Tag försiktigt bort supernatanten och resuspend cellpelleten med en milliliter av Bottenstein-Sato medium.
Poola alla pellets i ett gemensamt 50-milliliterrör och justera volymen till 20 eller 30 milliliter beroende på celltäthet med Bottenstein-Sato-medium. Platta två eller tre förlackerade 100-millimeters Petriskålar med 10 milliliter av cellupphängningen. Inkubera i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5%koldioxid.
Två timmar senare, rensa skräp från Petri rätter genom att uppdatera alla Bottenstein-Sato medium. Inkubera i två dagar i mediet i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5%koldioxid. Efter två dagar, undersöka kulturen under ett mikroskop.
I en laminär flödeshuva, under sterila förhållanden, förnya odlingsmediet med 10 milliliter varmt MPB-27 lågt medium. Inkubera i två dagar i en befuktad inkubator vid 37 grader Celsius under 5%koldioxid. För att skörda OCM, samla supernatanten som innehåller oligodendrocytes utsöndras faktorer.
Filtrera sterilisera OCM med hjälp av ett 0,22-mikronfilter. I detta protokoll, oligodendrocyte härstamning celler renades från stödjeceller kulturer genom att skaka av astrocyter och microglia. Analys av uttrycket av olika markörer indikerade att oligodendrocyte kulturer var mestadels pre-oligodendrocytes med 90 plus eller minus 4%av O4 positiva celler, 85 plus eller minus 7%NG2 positiva celler, och 4,7 plus eller minus 2,1%av PLP positiva celler, medan 7,2 plus eller minus 2,5%av cellerna var GFAP positiva astrocyter.
OCM produceras från sådana kulturer lades till tre dagar in vitro till renad hippocampus neuron kulturer. Denna behandling främjar klustring av notalproteiner. Myelination av hippocampus nervceller studerades genom tillägg av oligodendroctyes vid 14 dagar in vitro.
Från 20 till 24 dagar in vitro, immunfärgning av myelin markörer, såsom myelin grundläggande protein, tillåts visualisering av de myelin segment och noder av Ranvier. Core PBS är viktigt för hjärnhinnorna borttagning. Den rask röjning är kritisk för oligodendroctyes livskraft och förverkliga styrkorna i flödet tillämpas med pipetten.
Oligodendrocyte-betingade medium kan läggas till neuronala kulturer för att få insikt i effekterna av oligodendroctyes utsöndras faktorer på neuronal fysiologi. Co-kulturer av oligodendroctyes med nervceller kan också utföras för att studera myelination processen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
