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Articolo metodologico
Questo protocollo descrive il clonaggio e l'espansione di cellule T regolatorie umane per la generazione di Treg umane vitali ad altissima purezza con demetilazione stabile nella regione demetilata specifica per le Treg (TSDR) e caratteristiche fenotipiche specifiche per le Treg.
Le cellule T regolatorie umane (Treg) sono notoriamente difficili da isolare in elevata purezza dati gli attuali metodi di arricchimento delle Treg. Queste metodiche si basano sull'identificazione delle Treg attraverso diversi marcatori di superficie cellulare attivazione-dipendenti con livelli di espressione variabili in diverse condizioni fisiologiche e patologiche. Le popolazioni isolate come "Treg" contengono quindi spesso un numero considerevole di cellule effettrici non-Treg (ad esempio, Teff) che ostacolano la precisa caratterizzazione fenotipica e funzionale di queste cellule, la loro caratterizzazione genomica e proteomica, la loro enumerazione affidabile in diversi stati di salute e malattia, nonché il loro isolamento ed espansione per scopi terapeutici. Quest'ultimo, in particolare, rimane un grosso ostacolo, poiché l'espansione involontaria dell'homing delle cellule effettrici nei compartimenti cellulari rilevanti per le Treg (ad esempio, le cellule T CD4+CD25+ ) può rendere l'immunoterapia basata sulle Treg inefficace, o addirittura dannosa. Questo lavoro presenta un metodo che elude i problemi associati all'isolamento e all'espansione delle Treg su base di popolazione e mostra che la generazione di cloni candidati Treg con la successiva selezione, coltura ed espansione di solo cellule monoclonali attentamente controllate, consente la generazione di un prodotto di cellule Treg ultrapure che può essere conservato in coltura per molti mesi. consentire lo studio a valle di queste cellule, anche per possibili applicazioni terapeutiche.
Lo scopo di questo protocollo è quello di consentire la propagazione in vitro di Treg umane clonali di altissima purezza. L'isolamento di popolazioni arricchite con Treg e la successiva clonazione consente la selezione dei fenotipi di Treg desiderati e la loro espansione per ulteriori studi sulla biologia di queste cellule, l'esplorazione della loro potenziale utilità terapeutica e altre applicazioni sperimentali a valle.
La clonazione delle Treg produrrà una purezza delle Treg significativamente migliore rispetto agli approcci di isolamento ed espansione policlonali. Ciò è dovuto all'esclusione affidabile ....
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Questo protocollo segue tutte le linee guida istituzionali relative alla conduzione etica della ricerca che prevede l'uso di campioni umani. Il lavoro con cellule umane e altri prodotti del sangue umano deve avvenire almeno in un ambiente certificato BSL-2 seguendo almeno le linee guida di sicurezza BLS-2.
1. Pre-arricchimento di cellule mononucleate del sangue periferico umano per cellule CD4+CD127loCD25hi
ATTENZIONE: Utilizzare una tecnica sterile in tutto il testo. Gettare immediatamente gli oggetti taglienti in un contenitore per oggetti taglien....
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Il successo dell'implementazione di questo protocollo porterà alla generazione di cloni e linee di cellule T regolatorie umane stabili.
La preselezione/prearricchimento delle cellule CD4+CD127 e CD25hi era un metodo semplice per ottenere una popolazione iniziale checontenessela maggior parte delle Treg umane (Figura 1A-C). Non tutti i cloni mostravano un fenotipo Treg. Il prescreening dei cloni mediante misurazione.......
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Questo protocollo descrive la propagazione di cellule T regolatorie umane ultrapure attraverso l'isolamento, l'espansione e l'attento controllo di cellule ottenute in un approccio di diluizione limitante e di espansione basato su cellule feeder da popolazioni iniziali contenenti Treg.
I passaggi critici di questo approccio sono: 1) la scelta di una popolazione di partenza appropriata. Generalmente, il compartimento CD127oCD25hi delle cell.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo progetto è stato sostenuto dal National Eye Institute del National Institutes of Health con il numero di premio K08EY025324 (Nowatzky) e da un Colton Scholar Award del Judith and Stewart Colton Center for Autoimmunity (Nowatzky).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ m Stericup, 500 mL | Millipore | 5500 | Conservazione e preparazione dei terreni |
| 100x Aminoacidi non essenziali | Gibco | 11140-050 | Componente del terreno |
| 15 mL di provette da centrifuga coniche (50/sacchetto, confezione da 500) | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | Componente del terreno |
| 25 ml Bacino per pipette a pozzetto singolo | Fischer Scientific | 13-681-508 | |
| Provetta da centrifuga conica da 50 mL (25/manicotto) | ThermoFisher Scientific 339652 | ||
| 50x Penicillina Streptomicina Soln | Corning | Corning, 30-001-Cl | Componente del terreno |
| CryoTube Fial Int Thread Round Btm Starfoot PP Screw Stopper Sterile PP 1,8 mL | Nalge Nunc | 377267 | |
| DMSO | Corning | 25-950-CQC | |
| Kit di selezione positiva EasySep Human CD25 | Stemcell Technologies | 18231 | Le alternative sono lo smistamento basato su colonne FACS o MACS |
| EasySep Human CD4+CD127low T cell Pre-Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 19231 | Le alternative sono lo smistamento basato su colonne FACS o MACS |
| isolamento delle cellule T regolatorie EasySep Human CD4+CD127lowCD25+ (in alternativa all'articolo 12) | Stemcell Technologies | 18063 | Le alternative sono la selezione basata su colonne FACS o MACS |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-5442-03 | Purificazione PBMC dal sangue periferico dei prodotti della leucaferesi; mezzo di gradiente |
| di densità Siero AB umano (PHS-AB) | Valley Biomedical Inc | HP1022 | Componente del terreno |
| Kit di colorazione a cellule morte blu fissabile LIVE/DEAD, per eccitazione UV | Thermo Fischer | L-34962 | Colorante |
| di vitalitàFitoemoagglutinina-L (PHA-L) | Millipore/Sigma | 11249738001 | stimolazione delle cellule T |
| IL-2 ricombinante (ad es. PROLEUCHINAâ )Stimolazione | e mantenimento delle cellule | T Prometheus | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Componente multimediale |
| Colorazione degli anticorpi per la citometria a flusso (fenotipizzazione Treg) | Vedi "Commenti" | Vedi "Commenti"Gli | anticorpi coloranti sono arruolati in: Nowatzky et al. (2019) PubMed PMID: 30584695; PubMed Central PMCID: PMC6497402. Nel caso in cui si utilizzi il kit di selezione positivo per CD25 umano EasySep, colorare con anticorpo anti-CD25 2A3 o BC96, ad esempio: Brilliant Violet 421 anticorpo CD25 umano (Biolegend; 302629) |
| TCR Vβ Kit di repertorio; IOTest Beta Mark | Beckman Coulter | PN IM3497 | Verifica delle espansioni per la monoclonalità |
| Piastra di coltura tissutale, 96 pozzetti, fondo a U con coperchio a bassa evaporazione Corning | 353077 |
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