Name: 昆虫关键热极限的高通量测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 了解高通量测定昆虫关键热极限的方法，使用Drosophila模型评估耐热性与耐寒性。该技术为气候变化下的物种分布预测和生物多样性研究提供高效工具。

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感谢 Ellie McCabe 在果蝇饲养方面提供的帮助。本工作由美国农业部国家食品与农业研究所哈奇项目基金 1010996 和美国国家科学基金会基金 OIA-1826689 资助，资助对象为 N.M.T.。

1. 高通量CTmin检测
<ol>
	<li>组装夹套柱图1A, 图2)
	<ol>
		<li>使用钢锯将最宽（7 cm × 6.35 cm × 0.3 cm）和最窄（5.7 cm × 5.1 cm × 0.3 cm）的亚克力管切割成相同长度（31.5 cm）图2A）。这两根管子将作为夹套柱的外壁和内壁。</li>
		<li>用钢锯从中等尺寸（6.35 cm × 5.7 cm × 0.3 cm）的亚克力管上切割两个宽2 cm的环图2A）。这两个环将作为内层和最外层管之间的间隔物，在两根长丙烯酸管之间形成供液体流动的空间。</li>
		<li>在外部（最宽）亚克力管上仔细钻两个孔，一孔位于顶部，另一孔位于底部。确保每个孔距离管端 3.5 cm。将两孔钻在管子相对的两侧（图2B).</li>
		<li>为减少开裂，将胶带贴在试管预定打孔位置，然后在钻机的最低扭矩设置下极其缓慢地钻孔。</li>
		<li>使用丝锥对两个孔进行攻丝，以便软管接头可以拧入外管的两个孔中。为减少开裂，应使用润滑剂，并用手缓慢攻丝。</li>
		<li>将两个垫片分别滑入内护套的两端（底部和顶部），每个端部各一个。垫片与内护套末端之间需留出一小段间隙（0.5 cm）。图2B).</li>
		<li>使用丙烯酸胶水将间隔件焊接固定。</li>
		<li>内管和间隔物上的水泥凝固后，将该组件插入带有孔洞的较大外管中。确保外管和内管两端齐平。间隔物距离管端0.5 cm，从而在柱子两端形成小沟槽。图2C).</li>
		<li>使用丙烯酸胶水将外管与间隔件焊接在一起，并使用可调节的钢夹固定装置。等待胶水固化。</li>
		<li>将软管接头旋入外管上的孔中，此时外管已固定在垫片和内管上。 
		注意：接头应仅旋入外管，而不得旋入内管与最外层管之间的空隙。若软管接头旋入过深，可使用钢锯将其截短至适当长度。</li>
		<li>用硅胶密封剂将软管接头密封在外管的螺纹上。</li>
		<li>在夹套柱两端的内侧和最外侧管道之间的两个沟槽中填入硅酮密封剂。</li>
		<li>为测试色谱柱，将直径为0.6 cm的管路连接至软管接头。用一段管路将色谱柱底部的接头连接至水源，再用另一段管路将顶部的接头连接至排水口。</li>
		<li>从底部到顶部向装置中通水，检查是否存在泄漏。如果发现泄漏，需确定泄漏位置，并使用硅胶进行密封。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装夹套柱 果蝇 漏斗监测器（DFM）
	<ol>
		<li>将夹套柱用三爪铁夹固定在铁架台上。使柱体垂直对齐，一端开口朝向天花板，另一端开口朝向实验台面。图1B).</li>
		<li>将控温冷藏浴的流体输入和输出端通过直径为0.6 cm的塑料管连接至色谱柱的适配器喷嘴（图1B将流体输入端连接至柱体底部的喷嘴，将流体输出端连接至柱体顶部的喷嘴。</li>
		<li>切割两个3 cm厚的圆形泡沫隔热塞（周长与柱体最内层隔室的开口相同）。确保隔热塞插入柱体两端时能够紧密贴合，并完全密封最内层柱体图1B).</li>
		<li>在其中一个塞子的中心打一个孔，将热电偶的裸露端穿过孔约5 cm，并用胶带固定。将热电偶的另一端插入热电偶数据记录仪。</li>
		<li>将热电偶数据记录仪连接到计算机。</li>
		<li>将两块塑料排水槽防护网（5 cm × 7 cm，孔径约 0.5 cm）楔入柱内，作为栖木材料。将其中一块防护网置于距底部约 2/3 处rds 从柱子的上部以及另外的1/3处rd 从柱子的顶部（图1B).</li>
		<li>固定底部塞子（不带热电偶）和顶部塞子（带热电偶）。将塞子插入柱体顶部时，应确保热电偶不与柱体侧壁接触。</li>
		<li>调节铁架台上色谱柱的高度，使柱底与实验台面之间的距离为25 cm。</li>
		<li>将一个直径为5 cm的铁环固定在铁架台上，位置位于柱子底部下方5 cm处，并将铁环旋转至柱子的一侧。</li>
		<li>将DFM直接置于圆底烧瓶的磨口环上（图1B）。根据制造商的协议连接所有电子组件：电源、电源接口和计算机。</li>
		<li>组件连接完成后，按照制造商的说明书完成DFM及DFM软件的设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算机断层扫描分钟 检测
	<ol>
		<li>将流体浴的输入阀和输出阀转至开启位置。</li>
		<li>按下电源按钮以开启温控液体浴，然后按播放按钮运行程序，将液体浴的温度升至并维持在 25 °C。等待液体浴和色谱柱 5–10 分钟，使其达到并稳定在 25 °C。</li>
		<li>移除柱子顶部的塞子，并替换为一个漏斗（5.08 cm 直径；参见 图1C).</li>
		<li>将果蝇从培养瓶中轻拍入柱中。</li>
		<li>移除漏斗，并迅速更换为顶部塞子，注意防止果蝇逃逸。让果蝇静置5分钟，期间偶尔轻敲底部塞子，促使果蝇向上爬行。</li>
		<li>按下流体浴的启动按钮，开始CT扫描分钟 变温程序（25 °C 保持 5 分钟；以 0.5 °C/min 从 25 °C 降至 10 °C；10 °C 保持 2 分钟；然后以 0.25 °C/min 从 10 °C 降至 -10 °C）。 
		注意：本CT的其他变体分钟 根据研究问题，可采用不同的升速方案（例如，比较不同升速速率对CT的影响）分钟28).</li>
		<li>单击打开计算机上的热电偶记录软件，然后单击 记录 使用图标开始记录柱内温度，每秒记录一次，持续整个检测过程。确保每次温度记录均包含精确到秒的时间戳，以便后续将温度数据与DFM数据合并。</li>
		<li>向一个15 mL圆锥形离心管中加入5 mL 90%乙醇，并将其置于柱下方的支架上。</li>
		<li>偶尔轻敲柱子的底部塞子，促使停留在底部的果蝇向上爬行。当温度降至15 °C时，大多数果蝇会停留在栖木上或柱子的上部附近。</li>
		<li>在15 °C下，取下底部塞子，收集仍停留在底部塞子上的果蝇至乙醇中。计数并记录这些果蝇是在15 °C收集的，但其CT分钟 未知。 
		注意：应在实验前根据预测的CT值确定移除底部塞子的温度。分钟 测试物种或处理的温度。在本实验中，选择15 °C是基于CT分钟 这些在初步实验中发现的特定DGRP品系。</li>
		<li>将一个外径为75 mm的玻璃漏斗放入DFM中。调节铁圈、DFM和漏斗的位置，使其位于柱体正下方。确保漏斗边缘完全密封柱体底部图1D).</li>
		<li>将漏斗底部插入15 mL收集管中（图1D).</li>
		<li>单击计算机上的图标以打开DFM软件 软件 图标。软件将立即开始记录果蝇到达其CT的时间/日期分钟到达CT的果蝇分钟 失去神经肌肉功能，从栖木上跌落，随后通过DFM。</li>
		<li>监测所有果蝇是否均已达到其CT分钟 随着温度下降，通过检查顶部塞子和栖木，观察是否有果蝇仍停留在上面（即仍保持神经肌肉功能）。当所有果蝇均达到其临界温度（CT）时，试验结束。分钟.</li>
		<li>试验结束时，调整 DFM 并将其从柱孔处移开。部分果蝇可能已达到其 CT分钟 但会卡在柱子中（例如，卡在栖木上或仅由一个跗节钩悬挂）。打开顶部塞子，移除这些果蝇。CT分钟 这些果蝇的来源未知。</li>
		<li>使用温度记录软件（即温度、日期和时间）和DFM软件（即通过漏斗的果蝇数量、日期和时间）生成的.txt输出文件进行合并 合并 在 RStudio 中使用命令。根据共同的日期/时间变量合并这两个文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 高通量热激KD检测
<ol>
	<li>仪器组装与准备
	<ol>
		<li>使用粘合剂将钢丝编织网（约1.5 mm孔径）固定在96孔无底板的底部。</li>
		<li>使用热熔胶枪和热熔胶将磁铁固定在96孔无底板底部的相对两侧（图3）。</li>
		<li>使用专为96孔板设计的粘性薄膜制作定制隔膜盖：将两片薄膜的粘性面贴合在一起，形成一张带棱纹的塑料片。</li>
		<li>将塑料片覆盖在96孔板上，并用胶带将其粘附在板的四个侧面。在板上每个孔的开口处，使用美工刀在塑料片上切出“x”形切口（即共96个“x”）。</li>
		<li>用CO2麻醉果蝇，并使用吸虫器和隔膜盖将果蝇逐个装入改装后的96孔无底板的各个孔中。在果蝇仍处于CO2麻醉状态下，取下隔膜盖，并替换为紧密贴合的透明盖。</li>
		<li>将装有果蝇并加盖紧密透明盖的96孔无底板放置于食物上。确保果蝇在CO2麻醉后至实验开始前（步骤2.2.1–2.2.5）至少有48小时的恢复时间。 
		注意：改装后的96孔无底板底部为网状结构，因此经CO2麻醉的果蝇可被装载并置于食物上至少48小时后再开始实验。任何宽度&#62;8.5 cm、长度13 cm、深度至少2 cm以容纳1 cm厚食物层的塑料容器均可使用。</li>
		<li>用胶带将网络摄像头固定在温控培养箱内部底部，使摄像头镜头垂直向上（图4）。在摄像头上方约10 cm处固定一层培养箱搁板。 
		注意：摄像头朝上拍摄，从下方记录96孔板，以确保尽可能多的孔表面可见（例如，避免因板孔壁遮挡而视野受限）。当果蝇达到其击倒时间（KDT）时，它们会落入孔底，即最靠近摄像头的一侧，因此无论其所在孔距离视野中心多远，均能被清晰观察到。</li>
		<li>将网络摄像头连接至计算机。</li>
		<li>用胶带将一张白色纸张（8.5 cm × 13 cm；与96孔板底部面积完全相同）固定在搁板底部（图4）。确保通过网络摄像头观察时，纸张完全填满画面。</li>
		<li>在培养箱内放置光源。使用纸张或其他材料减弱光照，以最小化反光。 
		注意：步骤2.1.10需根据具体培养箱调整，因为不同培养箱的照明和反射情况各异。目标是使培养箱内光照充足，以便通过网络摄像头观察时，每个孔中的果蝇与板后白色纸张之间具有良好的对比度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行热击倒实验
	<ol>
		<li>将培养箱温度设定为37.5 °C，并等待约30分钟，使培养箱达到并稳定在目标温度。具体温度取决于所测试的昆虫种类及其他时间相关因素。</li>
		<li>将96孔板倒置放入培养箱中，使板的底部（网面）紧贴托盘底部的白色纸张（图4）。注意记录板上各孔的方位（列和行名称）在托盘及网络摄像头视野中的位置。可在96孔板侧面和白色纸张边缘粘贴彩色胶带以确认方位（图4）。 
		注意：应通过热电偶在热击倒实验的预试验中记录板内温度，以确保培养箱温度与96孔板内部温度一致。此外，在正式实验前，使用多个热电偶检测96孔板各孔之间是否存在显著温差，也是必要的预防措施。</li>
		<li>关闭培养箱门。</li>
		<li>点击视频录制软件中的录制按钮。</li>
		<li>2小时后，检查录像，确认所有果蝇均已到达最终静止位置且不再移动。当所有果蝇均停止活动后，点击视频录制软件中的停止按钮。对于本实验中在25 °C条件下培养的基因型，大多数果蝇在37.5 °C下约60分钟内达到其KDT（另见Jørgensen等9）。</li>
		<li>处理掉果蝇。</li>
		<li>使用自定义Python脚本（补充代码文件1–3）估算视频中果蝇达到热击倒时间（KDT）的时刻。 
		注意：步骤2.2.7为可选步骤。为加快视频分析速度，开发了一组自定义Python脚本，用于测量每个孔内像素密度随时间的变化（见补充代码文件）。当果蝇停止移动时，像素密度趋于稳定，通过绘制这些数据的变化图可大致确定果蝇被击倒的时间点。尽管该脚本可能用于自动化数据分析，但目前视频中的轻微缺陷会导致像素密度变化与真实击倒时间之间存在微小偏差。</li>
		<li>打开视频文件，记录每个孔中每只果蝇的KDT。在不同实验和观察者之间，最一致的热KDT测量方法是记录果蝇到达其最终静止位置的时间。</li>
		<li>反向回放视频，聚焦于单个孔，记录果蝇首次从其最终静止位置开始移动的时间点。对每个孔重复此过程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Kelty, J. D., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+rapid+cold+hardening+by+cooling+at+ecologically+relevant+rates+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Induction of rapid cold hardening by cooling at ecologically relevant rates in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Insect Physiology. 45 (8), 719-726 (1999).</li>
<li>MacMillan, H. A., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+insect+chill-coma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying insect chill-coma.</a> Journal of Insect Physiology. 57 (1), 12-20 (2011).</li>
<li>Salachan, P. V., Sørensen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+thermal+limits+affected+differently+by+developmental+and+adult+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical thermal limits affected differently by developmental and adult thermal fluctuations.</a> Journal of Experimental Biology. 220 (23), 4471-4478 (2017).</li>
<li>Hoffmann, A. A., Hallas, R., Anderson, A. R., Telonis-Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+robust+sex-specific+trade-off+between+cold+resistance+and+starvation+resistance+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for a robust sex-specific trade-off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Evolutionary Biology. 18 (4), 804-810 (2005).</li>
<li>Kelty, J. D., Lee, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cold-hardening+of+Drosophila+melanogaster+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29+during+ecologically+based+thermoperiodic+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid cold-hardening of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae) during ecologically based thermoperiodic cycles.</a> Journal of Experimental Biology. 204 (9), 1659-1666 (2001).</li>
<li>Sinclair, B. J., Vernon, P., Klok, C. J., Chown, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insects+at+low+temperatures%3A+An+ecological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Insects at low temperatures: An ecological perspective.</a> Trends in Ecology and Evolution. 18 (5), 257-262 (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

上述两种方法可对与生态相关的高温和低温耐受性指标进行高通量数据采集。这些实验方案基于以往研究昆虫热耐受极限的常用方法（详见Sinclair等人6的综述）。两种方案均可在较短时间内完成（每项约2小时），能够产生大样本量的数据集，且不牺牲重复性和准确性；同时通过消除手动记录和输入数据（冷击倒实验，CTmin assay），或通过为每次实验保留视频备份（热击倒实验，heat KD assay），最大限度地减少了实验人员的操作误差。
代表性结果通过比较DGRP特定品系成年雌性个体的热耐受极限获得24。两种实验方法均显示出不同品系间热耐受性的显著差异。每种实验中品系间的效应量相对较大，因此可通过视觉观察和统计分析可靠地区分各组。两个DGRP品系在KDT上的显著差异凸显了静态实验相较于动态升温实验的潜在优势；静态实验可能比动态实验更易于检测组间较小的差异9。接受热诱导KD实验的两个DGRP品系在平均KDT上相差14....

昆虫的热耐受极限 
环境条件（包括温度）的变化是影响生物体表现、适合度、存活率和地理分布的主要因素1,2。生物体的高温和低温耐受极限决定了其理论上可耐受的环境范围，因此这些极限是预测动植物分布的重要指标，尤其是在气候变化背景下尤为关键3,4。因此，准确测定热耐受极限的实验方案是生态学家、生理学家、进化生物学家和保护生物学家等研究人员的重要工具。
作为最丰富且种类最多的陆生动物，昆虫常被用于测定热耐受极限。&#160;临界热最大值（CTmax）和临界热最小值（CTmin）常用于评估种内和种间在热耐受性方面的变异5,6,7。尽管CTmax和CTmin可用于多种表型的测量，包括生长、繁殖输出和行为，但它们最常应用于运动功能的评估5,6,7。因此，CTmax（也称为热击倒温度）和CTmin通常被定义为昆虫丧失运动功能并无法保持直立状态时的高温和低温5,6,7,8,9,10,11。CTmin与冷昏迷的起始相一致，冷昏迷是由低温引起的可逆性麻痹状态6。尽管在热极限下的麻痹通常是可逆的，但持续暴露于这些温度将导致生态死亡5。
测定热耐受极限的常用方法 
已有多种装置被用于测定热耐受极限（详见Sinclair等人的综述）6。简而言之，将昆虫置于培养箱12,13、浸入液体浴中的容器11,14,15,16、铝块10,17或夹套容器18中进行加热或冷却，并持续监测直至其运动能力丧失。在实验过程中对昆虫进行监测时，最常用的方法是直接观察，即实时连续观察个体，或通过回放录制的视频进行回顾性观察6,9,10,11,15,17。尽管直接观察法对设备要求较低，但其劳动强度大，且通量受限。另一种方法是间接观察，例如在个体从栖木上跌落时于特定时间点收集样本6,19,20,21，或使用活动监测装置进行监测13。
测量热极限的间接方法通常比直接观察法通量更高，且潜在误差更小。最常用的间接监测方法是使用带有夹套控温的柱状装置6,8,19,20,21。将昆虫置于内部设有栖木的柱体中，通过将恒温液体浴中的液体泵入柱体夹套层，从而控制内腔温度。当个体达到其热极限时，会从栖木上跌落，并在特定温度或时间间隔下被收集。尽管该方法适用于测定CTmin，但已被发现不适用于CTmax，因为果蝇在温度升高时会主动从柱体底部爬出。本文所描述的新方法通过在自动化测量过程中对果蝇进行单个隔离，从而避免了这一问题。
除了观察方法外，评估生物体上临界热耐受限值通常采用两种温度处理方式。动态实验通过逐步升高温度直至运动功能丧失，该温度即为动态临界热最大值（dynamic CTmax7,8,9,13）。相比之下，静态实验则在恒定的胁迫温度下持续处理，直至运动功能丧失，该时间点即为热击倒时间（heat knockdown time, heat KDT），在Jørgensen等人最近的一项研究中也称为静态临界热最大值（static CTmax，sCTmax）7,8,9,16,22。尽管CTmax与热击倒实验（heat KD assays）所得指标的单位不同，但对这两个性状的数学建模表明，它们在热耐受性评估方面提供可比的信息，且均具有生态学意义8,9。动态实验获得的温度值可直接与环境条件进行比较，在热耐受性差异较大的情况下更具优势，例如热生态位差异显著的物种间比较。然而，由于热损伤累积的Q10值较高，静态实验在检测效应量较小的差异时可能更为适宜，例如种内热耐受性的变异9。此外，从实际操作角度看，静态实验所需的设备比动态实验更简单。
目的 
本文的目的是规范可用于未来研究中评估活动性昆虫热耐受极限的 CTmin 和热击倒（heat KD）实验方法。这些实验方案借鉴了已建立的先前方法，设计为高通量、自动化且成本效益高。两种实验均可在较短时间内完成（约 2 小时），这意味着可在一天内开展多次实验，在不牺牲重复性或准确性的前提下产生大量数据。在此实验设置下，可同时测量 96 只果蝇的热耐受性，而 CTmin 实验的列可容纳超过 100 只果蝇，前提是具有足够的栖息表面积。
观察CTmin的高通量方法通过在常见的夹套柱法基础上增加红外传感器以自动计数果蝇而实现。Shuman等人于1996年首次提出使用红外传感器进行计数23，但该技术尚未被广泛采用。红外传感器的引入使得能够连续生成数据，而非在离散时间点采集数据。此外，本方案通过消除手动数据录入以及在特定时间点人工更换夹套柱下方收集管的需要，最大限度地减少了实验人员误差。
记录热击倒温度（heat KDT）的高通量方法改进自先前两项关于昆虫耐热性的研究10,12。将单只果蝇置于96孔板中，并在温度可控的培养箱内进行视频录制。该方案通过回放录像对实验结果进行复核与验证，从而最大限度地减少实验人员在判定热击倒时间时的主观偏差。本方案还提供了一套自定义的Python脚本，可用于加快视频分析速度。使用独立孔位可避免个体间相互干扰，例如在群体观察时可能出现的移动或倾倒现象，而此类问题在多个个体共处同一观察区域时尤为明显10,17。此外，温度可控培养箱能够为全部96个孔位提供稳定的温度环境，相比之下，温控铝块则可能在不同位置产生温度梯度10。还需注意的是，96孔记录法可进一步调整用于测定动态CTmax，甚至可能用于测定CTmin（详见讨论部分）。
为了演示每种实验方案，成虫的热耐受极限 黑腹果蝇 选定品系的雌性个体 黑腹果蝇 遗传参考面板（DGRP）进行了比较24。选择这些品系是因为初步实验表明其在耐热性方面存在显著差异。这些检测方法被证实为区分耐热性差异的可靠手段。以下两种方案，即高通量临界温度（CT）测定分钟 检测（第1节）和高通量热激KD检测（第2节），描述了生成CT所需的必要操作步骤分钟 以及适用于任何可放入装置中且具有活动能力的昆虫生活阶段（如成虫）的热敏感性数据 果蝇. 用于CT分钟 昆虫还必须能够停靠。此处展示了每种检测方法在成虫中的应用 黑腹果蝇然而，对于其他分类群或生活史阶段，可能需要进行相应的修改。6. 微小的调整可能包括在CT中使用孔径更大的栖木材料，以适应较大的样本分钟 检测，或使用更高品质的相机来分辨在热诱导KD检测中缓慢移动的昆虫或生命阶段的细微KDT。本方案未描述果蝇制备的方法，但标准化饲养方案对于确保可重复性至关重要。25 （参见 Garcia 和 Teets）26 和 Teets 与 Hahn27）。所提供的实验方案包含仪器的搭建与设置方法、测量记录方式，以及数据分析的简要说明。

<table><tbody><tr><td>ARCTIC A40 制冷液体循环器（可编程温度斜坡）</td><td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td><td>153-5401</td><td></td></tr><tr><td>C922 Pro Stream 网络摄像头</td><td>Logitech; Newark, CA</td><td>960-001087</td><td></td></tr><tr><td>圆形可调钢制夹具 &amp;ndash; 5.08 cm 至 7.62 cm</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>透明亚克力管 &amp;ndash; 5.7 cm × 5.1 cm × 0.3 cm</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>44036</td><td></td></tr><tr><td>透明亚克力管 &amp;ndash; 6.35 cm × 5.7 cm × 0.3 cm</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>440515</td><td></td></tr><tr><td>透明亚克力管 &amp;ndash; 7 cm × 6.35 cm × 0.3 cm</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>44041</td><td></td></tr><tr><td>透明硅酮密封胶</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>收集管（15 ml）</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>无线电钻</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>果蝇漏斗监测仪（DFM）</td><td>TriKinetics; Waltham, MA</td><td>DFM</td><td>用于计数在特定时间点通过漏斗掉落的果蝇数量</td></tr><tr><td>DAM 数据采集软件</td><td>TriKinetics; Waltham, MA</td><td></td><td>记录来自 DFM 的数据输入</td></tr><tr><td>果蝇储存盖</td><td>FlySorter; Seatle, WA</td><td>FS-96LID-5PK</td><td>用于将果蝇装入 sCTmax 检测用储存板</td></tr><tr><td>果蝇储存板</td><td>FlySorter; Seatle, WA</td><td>FS-96PLATE-5PK</td><td>用于在 sCTmax 检测期间容纳果蝇</td></tr><tr><td>果蝇食物托盘</td><td>FlySorter; Seatle, WA</td><td>FS-TRAY-5PK</td><td>用于在将果蝇装入 96 孔板后、进行 sCTmax 检测前，使果蝇保持在食物上</td></tr><tr><td>玻璃漏斗</td><td>Kimax</td><td>28950-75</td><td>75 mm</td></tr><tr><td>滤网护罩</td><td>Any</td><td>Any</td><td>约 0.5 cm 直径的孔</td></tr><tr><td>钢锯</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Heratherm Thermo Scientific 培养箱</td><td>Thermo Scientific; Waltham, MA</td><td>OMS100</td><td></td></tr><tr><td>尼龙软管接头（2 个）&amp;ndash; &amp;frac14; MNPT × 3/8</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>61135</td><td></td></tr><tr><td>热熔胶枪及胶棒</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>磁铁</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>OMEGA TC-08 记录仪及 TC-08 Player 软件</td><td>OMEGA; Norwalk, CT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMEGA 热电偶（T 型）</td><td>OMEGA; Norwalk, CT</td><td>5LRTC-TT-K-20-36</td><td></td></tr><tr><td>塑料漏斗</td><td>Any</td><td>Any</td><td>直径 2&quot;</td></tr><tr><td>塑料软管 - 直径 0.6 cm</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>62852</td><td></td></tr><tr><td>铁环架</td><td>Any</td><td>Any</td><td>直径 2&quot;</td></tr><tr><td>铁架台</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>铁架台三爪夹</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>串行端口连接器（PSIU9）</td><td>TriKinetics; Waltham, MA</td><td>PSIU9</td><td>DFM 与计算机之间的中间连接装置，支持多个 DFM 连接</td></tr><tr><td>聚苯乙烯泡沫板（厚 2&quot;）</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>Any</td><td>Any</td><td></td></tr><tr><td>不间断电源（PS9-1）</td><td>TriKinetics; Waltham, MA</td><td>PS9-1</td><td>为 DFM 和 PSIU9 提供电源</td></tr><tr><td>Weld-on #4 亚克力胶水</td><td>United States Plastic Corp., OH</td><td>45737</td><td></td></tr></tbody></table>

昆虫临界热耐受的高通量测定

High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

植物和动物的上下临界温度是预测其表现、存活能力及地理分布的重要指标，对于预测其对气候变化的响应至关重要。本文描述了两种高通量测定昆虫热耐受极限的实验方案：一种用于测定临界低温最小值（CTmin），另一种用于测定在恒定热胁迫条件下的热击倒时间（KDT）。在CTmin测定中，将个体置于带丙烯酸护套的柱形容器内，经历逐步降温过程，并通过红外传感器记录个体从栖木上掉落的时间点。在热KDT测定中，个体被置于96孔板中，放入设定为高温胁迫条件的培养箱内，并进行视频记录，以确定其无法保持直立和运动的时间点。这两种方法相较于常用技术具有多项优势。两项实验成本较低，且可在相对较短的时间内完成（约2小时）。CTmin测定可减少实验者误差，并能同时测量大量个体。热KDT方案则为每次实验提供视频记录，从而消除了实验者的主观偏差，也无需实时持续观察个体状态。

热极限（即 CT分钟 以及雌性个体的产热KDT 黑腹果蝇 利用遗传参考面板（DGRP）进行测量，以展示由上述两种所述方案生成的高通量数据。CT分钟 使用DGRP品系714（n = 37）和913（n = 45）进行了检测。对热击倒时间（Heat KDT）的检测则与DGRP品系189（n = 42）和461（n = 42）进行了比较，视频文件采用人工分析。包括观看视频在内的整个实验耗时 &lt;每个方案2小时。
DGRP 913 系的雌性个体的平均 CTmin 温度显著低于 DGRP 714 系的雌性个体（图 5A；Wilcoxon 秩和检验，W = 1585，P &lt; 0.001）。两个品系的 CTmin 分布明显不同：913 系的 CTmi...

热极限可以预测生物体所能耐受的环境，这一信息在快速气候变化背景下具有重要价值。本文描述了用于评估昆虫临界低温极限和热击倒时间的高通量实验方案。这两种方案均能最大限度地提高检测通量，并降低实验成本。

植物和动物的上、下临界温度限值是预测其生理表现、存活能力及地理分布的重要指标，并且是……

耐热性是物种分布及其对气候变化响应的关键因素。本文提供了快速评估小型昆虫耐热性和耐寒性的方法。这些通过临界低温（临界热最小值）测定耐寒性以及通过热击倒时间测定耐热性的方法具有高通量、半自动化的特点，且所需设备极少。本实验操作将由我实验室的博士后 David Awde 演示。进行临界低温最小值测定前，先打开控温液体浴槽的电源，然后按下播放按钮运行程序，使浴槽温度升至并维持在 25 摄氏度。等待 5 到 10 分钟，待液体浴槽的液柱温度达到 25 摄氏度后，将柱顶的塞子更换为直径 5.08 厘米的滤膜。通过漏斗将约40只果蝇从培养管中轻拍入柱中，迅速用塞子替换漏斗，注意防止果蝇逃逸。然后让果蝇静置，偶尔轻敲底部塞子以促使果蝇向上爬行。五分钟后，按下流体浴增益装置上的启动按钮，开始临界热最小值升温程序。在计算机上点击打开热电偶记录软件，然后点击“记录”按钮，以每秒一次的频率持续记录分析过程中柱内的温度。确保每次温度记录均包含对应秒级的时间戳，以便后续将温度数据与果蝇漏斗监测仪的数据进行整合。向一个15毫升的锥形离心管中加入5毫升90%乙醇，并将该管置于层析柱下方的支架上。轻轻敲击层析柱底部的塞子，促使底部的果蝇向上爬行。当温度为15摄氏度时，大多数果蝇会停留在栖木上或位于柱子的上部区域。在 15 摄氏度条件下，将外径为 75 毫米的玻璃漏斗放入果蝇漏斗监测仪中。取下底部塞子，将仍停留在塞子上的果蝇收集到乙醇中。调节铁环、漏斗监测仪和漏斗的位置，使其位于柱体下方。确保漏斗的边缘完全密封柱的底部，并将漏斗底部插入15毫升收集管中。打开果蝇漏斗监测软件。该软件将立即开始记录果蝇达到其临界低温的时间和日期。当果蝇达到其临界低温时，会失去神经肌肉功能，并通过果蝇漏斗监测装置从栖木上掉落。随着温度下降，为监测是否所有果蝇均已达到其临界低温，需检查顶部塞子和栖木，观察是否仍有果蝇停留在上面。当所有果蝇均达到其临界低温后，将果蝇漏斗监测装置及漏斗从柱体开口处移开。在极少数情况下，果蝇可能已达到其临界低温极限，但仍卡在柱中。此时可打开顶部塞子以移除这些果蝇。为建立高通量热击倒实验，可使用吸虫器和带隔膜的盖子，将经二氧化碳麻醉的单只果蝇分别装入经改造的无底96孔板的各个孔中，并用透明且紧密贴合的盖子密封该板。然后将培养板置于食物供应源上，让果蝇适应96孔板环境至少48小时。在检测当天，将培养箱温度设置为37.5摄氏度，30分钟后将果蝇培养板放入培养箱中，使板的底部紧贴托盘底部的白纸。注意记录托盘上孔列和孔行名称的方向，以及网络摄像头画面中的框架方向，并在培养板的侧面和边缘贴上彩色胶带，以帮助确认方向。当培养板放置到位后，关闭培养箱门，并在视频录制软件中点击“记录”。两小时后，检查录像，观察所有果蝇是否已到达最终的静止位置并停止活动。当所有果蝇均停止移动后，点击“停止”，并妥善处理果蝇

high-throughput-assays-of-critical-thermal-limits-in-insects

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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