Biochemistry
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Cuantificación de ácidos húmicos y fúlvicos en minerales de humato, DOC, materiales humificados y productos comerciales que contienen sustancias húmicas
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Summary March 18th, 2022
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Este método proporciona una cuantificación gravimétrica de sustancias húmicas (por ejemplo, ácidos húmicos y fúlvicos) sobre una base libre de cenizas, en materiales secos y líquidos de carbones blandos (es decir, lignito oxidado y no oxidado y carbón subbituminoso), minerales y esquistos de humato, turbas, compost y fertilizantes comerciales y enmiendas del suelo.
Transcript
El nuevo método estándar para la cuantificación de ácidos húmicos proporciona un análisis más exacto y preciso en comparación con los métodos existentes aceptados reglamentariamente, y también proporciona un método estándar para la cuantificación de ácido fúlvico hidrófobo puro. La ventaja de este protocolo es que proporciona un análisis gravimétrico de las concentraciones de ácido fúlvico húmico e hidrófobo sobre una base libre de cenizas, y el proceso de extracción se ha optimizado para obtener las mayores recuperaciones de ácidos húmicos y fúlvicos de las muestras. Demostrando el procedimiento estará Ryan Fountain, un químico analítico de nuestro laboratorio de química húmica.
Para preparar una muestra sólida, use un mortero y un mortero para triturar aproximadamente cinco gramos de la muestra que se analizará hasta que el 100% de la muestra bien mezclada pueda pasar a través de un tamiz estándar de los Estados Unidos, tamaño de malla número 200. Para determinar gravimétricamente el contenido de humedad del polvo, transfiera aproximadamente dos gramos del polvo de muestra a un bote de pesaje de aluminio preponderado y registre la masa del bote y la muestra. A continuación, coloque el bote de pesaje en un horno de secado a 102 grados centígrados durante 24 horas.
Al día siguiente, coloque el bote en un desecador para que se enfríe durante al menos una hora antes de pesar y registrar la masa del bote de pesaje y la muestra seca, luego use la fórmula para determinar el contenido de humedad como se indica. Para realizar una extracción de una muestra sólida, pese aproximadamente 2,5 gramos de la muestra restante y registre el peso con cuatro decimales. Luego, cargue la muestra en un matraz Erlenmeyer de un litro y enjuague el bote de pesaje con agua desionizada para eliminar todo el mineral.
Llene el vaso de precipitados a un litro con hidróxido de sodio 0.1 molar y agregue una barra de agitación magnética de cinco a siete centímetros para facilitar una agitación rápida de la muestra a 300 a 400 revoluciones por minuto en una placa de agitación. Cuando la muestra se haya mezclado completamente, evacue el espacio de la cabeza del matraz con gas nitrógeno, luego selle la abertura del matraz con una cubierta hermética y coloque el matraz en una placa de agitación para mezclar a 300 a 400 revoluciones por minuto durante 16 a 18 horas. Para la extracción de material líquido, agite bien la muestra para asegurarse de que el líquido de prueba se mezcle de manera homogénea, incluido cualquier residuo que pueda haber caído al fondo del recipiente.
Pese aproximadamente cinco gramos del líquido de prueba y registre el peso con cuatro decimales. Luego, agregue el líquido a un cilindro graduado de un litro y llene el cilindro con hidróxido de sodio 0.1 molar a un volumen final de un litro. Utilice una barra de agitación magnética para mezclar rápidamente la muestra como se ha demostrado hasta que la muestra de prueba se mezcle completamente antes de transferir la mezcla a un matraz Erlenmeyer de un litro, luego evacue el espacio de la cabeza con gas nitrógeno y revuelva el contenido del matraz a 300 400 revoluciones por minuto durante una hora como se ha demostrado.
Para eliminar los materiales no solubles de los extractos alcalinos, al final de la incubación de agitación, transfiera la mezcla a tubos de centrífuga adecuados y centrífique todo el volumen de muestra a 4, 921x G durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la centrifugación, recoja el sobrenadante alcalino que contiene el ácido húmico y la fracción fúlvica, que contiene el ácido fúlvico hidrófobo, en un matraz Erlenmeyer limpio de un litro con una barra de agitación magnética. Para la precipitación de ácido húmico de la fracción fúlvica, mientras se agita el extracto alcalino recolectado a 300 a 400 revoluciones por minuto en una placa de agitación, inserte una sonda de pH en la parte media de la solución y agregue la gota de ácido clorhídrico concentrado hasta que se alcance un pH estable de pH 1.0 más o menos 0.1.
Una vez que el pH esté estable, retire la sonda y la barra de agitación, enjuáguelas con agua desionizada y selle el matraz con una cubierta hermética. Deje reposar el matraz durante una a seis horas hasta que el ácido húmico precipitado se haya asentado en el fondo antes de centrifugar el extracto y precipitar el ácido húmico a 4, 921x G durante una hora. Al final de la centrifugación, vierta los sobrenadantes que contienen fracción fúlvica en un matraz Erlenmeyer limpio de un litro y selle el matraz con una cubierta hermética.
Coloque los tubos de centrífuga que contienen ácido húmico en un horno de secado de 100 grados Celsius durante 24 horas y asegúrese de que las tapas estén sueltas o retiradas para garantizar el secado. Después del secado, enfríe los tubos en un desecador hasta que alcancen la temperatura ambiente. Después del enfriamiento, use una espátula para transferir el residuo de cada tubo a un solo bote de pesaje alquitranado para determinar la masa de la muestra de ácido húmico extraída.
Para determinar el contenido de cenizas dentro de la muestra, transfiera aproximadamente 30 miligramos del ácido húmico seco a un plato de cerámica limpio y prepesado para determinar la masa de la muestra de pesaje y el plato. A continuación, queme el ácido húmico en un horno de amortiguación durante dos horas a 600 grados centígrados antes de enfriar el plato en el desecador. Una vez frío, pesa el plato y usa la fórmula para calcular la proporción de cenizas.
Para determinar la masa final del ácido húmico puro, use la fórmula para corregir el contenido de cenizas. Luego use las fórmulas para determinar la concentración de ácido húmico puro. Para preparar una nueva columna de cromatografía llena de resina DAX8 de polimetacrilato de polimetacrilato de baja presión, remoje la resina en el metanol durante dos horas en un vaso de precipitados antes de enjuagar bien la resina con agua desionizada hasta que se elimine todo el metanol.
Luego retire las pequeñas partículas de resina que flotan en el agua. Una vez enjuagada a fondo, vierta la resina enjuagada o regenerada en una columna de cromatografía de vidrio de 5 por 25 centímetros equipada con una pieza final con una fritada de 10 micras para soporte de lecho de resina, dejando de 2,5 a 5 centímetros en la parte superior de la columna y reemplace la pieza superior en la columna. Para renovar una resina utilizada anteriormente, o preparar una nueva resina recién lavada, use la bomba peristáltica para bombear ácido clorhídrico 0.1 molar a un caudal de 35 a 40 mililitros a través de la parte inferior de la columna hasta que el pH del efluente sea igual al pH del influente, luego bombee agua desionizada en la parte superior de la columna hasta que el pH del efluente sea igual al pH del influente.
Una vez que el lecho de resina esté embalado, use una bomba peristáltica para cargar la fracción fúlvica en la columna a baja presión a través de la parte superior de la columna a una velocidad de flujo de 35 a 40 mililitros. Una vez que la fracción fúlvica se haya cargado completamente sobre la resina, lave la resina con agua desionizada para eliminar la fracción fúlvica hidrófila no adsorbida. Lavar la columna con agua desionizada hasta que la absorbancia del efluente de la columna a 350 nanómetros sea igual a la del agua desionizada utilizada para lavar la columna.
Para desorber el HFA, bombee hidróxido de sodio 0.1 molar a través de la parte inferior de la columna y capture el efluente de fulvato de sodio de la bomba en un recipiente limpio y de tamaño suficiente. Todo el HFA se ha desorbido cuando la absorbancia del efluente de la columna es igual a la absorbancia del influente de hidróxido de sodio 0,1 molar a 350 nanómetros. Para eliminar el HFA por protonación, primero vierta resina de intercambio de protones / cationes en un vaso de precipitados grande y cubra y mezcle la resina con agua fresca desionizada varias veces, vertiendo el agua después de cada enjuague hasta que el color rojo se haya eliminado por completo.
Después del último lavado, cubra la resina con un ácido clorhídrico molar y deje reposar la mezcla durante al menos dos horas, con agitación cada 30 minutos. Al final del tratamiento de acidificación, reemplace el ácido con agua desionizada y revuelva vigorosamente con una varilla de agitación durante 15 segundos antes de dejar que la resina caiga al fondo del matraz y verter el agua. Repita el proceso hasta que la conductividad eléctrica del agua de enjuague sea menor o igual a 0,7 microSiemens por centímetro y cargue la resina regenerada en una columna de 5 por 50 centímetros con una fritada de vidrio para retener la resina.
Luego, cubra la resina con agua fresca desionizada y pase repetidamente el fulvato de sodio a través de la resina fuerte intercambiada por catión / protones por gravedad hasta que la conductividad eléctrica del efluente sea inferior a 120 microSiemens por centímetro. Para asegurarse de que todo el FA se elimina de la resina, después del paso final, lave la resina con agua desionizada hasta que la absorbancia del efluente a 350 nanómetros sea la misma que el agua desionizada utilizada para lavar la columna. Agregue el lavado y cualquier efluente utilizado para verificar la absorbancia a la solución de FA purificada.
Para ayudar con la eliminación de la FA, la resina se puede agitar varias veces. Use un evaporador rotativo a 55 grados Celsius para concentrar el FA a un volumen de aproximadamente 15 más o menos dos mililitros y transfiera completamente todo el volumen del concentrado de FA a un tubo centrífugo de plástico de 50 mililitros. Seque la muestra a 60 grados centígrados más o menos tres grados centígrados a sequedad constante en el horno de secado y transfiera el tubo al desecador para que se enfríe.
Cuando la muestra se haya enfriado, use una espátula para raspar el FA extraído en un pedazo de papel de pesaje prepesado y determinar la proporción de cenizas, el peso de FA extraído y el porcentaje de FA puro en la muestra original como se demostró para el ácido húmico. En esta tabla, se muestran datos de precisión para el método de extracción de HA y HFA a partir de muestras comerciales líquidas con concentraciones muy diferentes de HA y HFA. La desviación estándar residual para HA fue menor que la de HFA, pero la desviación estándar residual promedio de HFA en tres muestras líquidas fue de 6,83%, lo que indica un alto grado de precisión.
La relación de Horowitz también fue mayor que dos para solo uno de los análisis de HFA. En esta tabla, se muestran datos de precisión para la extracción de HA y HFA a partir de tres muestras de mineral húmico. Al igual que en el análisis anterior, con la excepción del HFA extraído del mineral dos y el HA del mineral tres, todas las proporciones de Horowitz estaban por debajo de dos, lo que demuestra el alto grado de precisión de este método para la extracción de HA y HFA a partir de muestras de mineral húmico.
En este análisis, no se observó que los aditivos bioestimulantes vegetales afectaran significativamente la recuperación de HA o HFA. En estas tablas se muestran las recuperaciones de HA y HFA a partir de muestras líquidas que estimularon productos comerciales con concentraciones muy bajas. Las recuperaciones fueron excelentes, oscilando entre el 88% y el 97% para HA, y el 92% y el 104% para HFA, pero también indicaron la necesidad de realizar réplicas de laboratorio.
Siguiendo este procedimiento, los ácidos húmicos y fúlvicos secos obtenidos pueden ser utilizados para fines de caracterización, como la resonancia electrónica de RMN de carbono-13 y protón, y la espectrometría de masas de ultra alta resolución, entre otras técnicas útiles. Y esto se puede utilizar para la caracterización de la química del humus, así como una herramienta útil para profundizar en la relación estructura-actividad con la aptitud de la planta y los mecanismos de defensa subyacentes de la planta.
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