Biology
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Establecimiento y Mantenimiento de Cucarachas Americanas Gnotobiotic (Periplaneta americana)
Chapters
Summary May 28th, 2021
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Este protocolo se utiliza en el establecimiento y mantenimiento de cucarachas americanas gnotobióticas (Periplaneta americana) mediante la esterilización superficial de las cajas de huevos (ootecas) antes de la eclosión. Estos insectos gnotobióticos contienen sus endosimbiontes de Blattabacterium transmitidos verticalmente, pero tienen intestinos axénicos.
Transcript
El protocolo de generación de cucarachas gnotobióticas facilita las pruebas del impacto de la eliminación y el reemplazo de la comunidad microbiana intestinal nativa en la salud del huésped y el ensamblaje del microbioma. Esta técnica utiliza métodos de múltiples fuentes para formar un flujo de trabajo cohesivo y optimizado para generar cucarachas gnotobióticas sin el uso de costosos equipos de laboratorio especializados. Teniendo en cuenta las muchas partes móviles diferentes de este protocolo gnotobiótico, la visualización ayuda a los investigadores a establecer más fácilmente sus propias instalaciones gnotobióticas a pequeña escala, de bajo costo y de sobremesa.
Para facilitar la recolección del número apropiado de hembras que llevan ootecas para los experimentos planificados, use pórceps para mover los tubos de cartón que contienen hembras grávidas en el tanque de almacenamiento. Si un tubo de cartón contiene varios insectos además de la hembra grávida, agite el contenido del tubo en un recipiente de plástico adicional anillado con vaselina y anime al insecto objetivo a volver al tubo de cartón solo. Tras la recolección, transfiera a cada mujer grávida a la sala de maternidad.
Una vez que las hembras han dejado caer sus ootecas, devolver a las hembras al tanque de stock y utilizar pórceps para recuperar las ootecas de la camada. Para limpiar las ootecas, coloque hasta cinco cajas de huevos en un tubo centrífugo de cinco mililitros que contenga tres mililitros de sulfato de dodecil sódico y vórtice las ootecas durante 10 segundos. Después de un segundo lavado como se acaba de demostrar, use una delicada toallita de tarea para fregar suavemente la superficie de cada ooteca para eliminar cualquier residuo y coloque la ooteca limpia en un bote de pesaje.
Antes de la esterilización, llene dos tubos centrífugos de 1,5 mililitros por ooteca con un mililitro de agua estéril por tubo. También agregue 10 microlitros de solución de culata de ácido peracético al 32% a 3.2 mililitros de agua doble destilada en un tubo de centrífuga de cinco mililitros en una campana extractora de humos. Tapar e invertir varias veces para mezclar y colocar hasta cinco ootecas limpiadas en la solución de ácido peracético al 0,1% recién preparada durante cinco minutos, invirtiendo el tubo varias veces cada 60 segundos.
El ácido peracético es un oxidante fuerte para los ojos, la piel y el irritante respiratorio, y es inflamable y corrosivo. Siempre use el EPP adecuado durante la manipulación y deseche sus residuos adecuadamente. Al final de la incubación, use pinzas estériles y una campana de flujo laminar para transferir cada ooteca a su propio tubo de centrífuga de agua de enjuague estéril.
Invertir varias veces para mezclar antes de transferir las ootecas al segundo conjunto de tubos de agua de enjuague. Después del segundo enjuague, use pinzas estériles para transferir las ootecas a los slants individuales de BHI. Coloque los slants en un recipiente secundario esterilizado y mueva el contenedor a una incubadora humidificada de 30 grados Celsius durante cuatro a cinco semanas hasta que eclosione.
Revise los slants regularmente una o dos veces por semana para el crecimiento de hongos o bacterias hasta la cuarta semana, momento en el cual los slants deben revisarse diariamente. Cuando las ninfas comienzan a eclosionar, use pinzas estériles y una capucha de flujo laminar para transferir asépticamente un pellet de chow de rata esterilizado a un matraz de BHI preparado. Como control de esterilidad, coloque el matraz en el recipiente secundario en la incubadora de 30 grados Centígrados durante 24 horas para confirmar la falta de crecimiento contaminante.
Si el matraz ha permanecido estéril, agite las ninfas fuera de la inclinación, dejándolas caer en el matraz en la campana de flujo laminar. Luego riele las ninfas con 300 microlitros de agua estéril una vez por semana en la campana de flujo laminar. Cuando las heces de ninfa comienzan a cubrir el piso medio, transfiera las ninfas a un nuevo matraz de BHI que contenga chow de rata esterilizado agregado con 24 horas de anticipación, como se demostró.
Las hembras embarazadas pueden ser identificadas por la ooteca unida a sus abdomenes posteriores. Las ootecas eclosionan un promedio de 34 días después de la esterilización. En casos de esterilización infructuosa, el crecimiento puede aparecer alrededor de las ootecas durante la incubación, comprometiendo el estado gnotobiótico de las crías.
Luego, la tasa de crecimiento ninfal se puede rastrear midiendo la longitud corporal del insecto. El polimorfismo de la longitud del fragmento de la restricción de la DNA ribosómica 16S de una ninfa homogeneizada se puede utilizar para confirmar la situación gnotobiotic. Las cucarachas gnotobióticas pueden ser inoculadas con comunidades microbianas sintéticas o xenobióticas.
Si bien este flujo de trabajo en particular es nuevo, estudios anteriores que utilizan cucarachas gnotobióticas han generado información sobre el ensamblaje del microbioma intestinal y los roles microbianos en la conformación del comportamiento social, la salud intestinal y la inmunidad de sus huéspedes insectos.
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