Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
İnsan Doğal Katil Hücre Metabolizmasının Analizi
Chapters
Summary June 22nd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Bu yazıda, periferik kandan izole edilen primer insan Doğal Öldürücü (NK) hücrelerinde glikoliz ve mitokondriyal solunumu ölçmek için bir yöntem, istirahatte veya IL15 kaynaklı aktivasyonu takiben açıklıyoruz. Açıklanan protokol kolayca birincil insan NK hücreleri diğer sitokinler veya çözünür uyaranlar tarafından aktive genişletilebilir.
Transcript
Bu yöntem doğal öldürücü hücre metabolizmasının belirlenmesiiçin izin verir. Oksijen tüketimini ve hücre dışı ortamdaki pH değişimlerini ölçerek aktivasyonda önemli bir parametredir. Hücre dışı akı analizörünün avantajı, tam otomatik olması ve düşük miktarlarda hücre ile gerçek zamanlı olarak 92 numuneyi test edebilmesidir.
Böylece yüksek iş elde ekranlar sağlar. Kliniğimizde glikoliz ve inky hücrelerde solunumu belirlemek için geçerli bir yöntem çok önemlidir. Obezite ve kanser gibi birçok hastalık olduğu için hücre metabolizması bozuldu.
50 mililitrelik konik tüp içine lenfosit ayırma orta 20 mililitre pipetting ile başlayın. Tüpü 30 derecelik açıda tutarken, orta üzerinde 20 mililitre kan pipeti yavaşça. İki sıvı arasında görünür ve iyi tanımlanmış bir arayüz oluşturma.
Tüpleri 1000 kez 25 dakika santrifüj edin.Sonra tüpleri dikkatlice santrifüjden çıkarıp rafa koyun. LSM ve plazma arasındaki arabirimde dikkat çekici bir hücre tabakasının varlığını kontrol edin. 10 mililitrelik plastik pipetle mononükleer hücre tabakasını hafifçe aspire edin ve yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe yerleştirin.
Mononükleer hücreleri 45 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Ve onları 800 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Doğal öldürücü hücreleri veya engaves izole etmek için, PVM denizleri saymak ve mililitre başına sekizinci hücrelere bir kez 10 NK ayırma tampon onları yeniden askıya.
Sonra yeni bir 50 mililitre tüp içine hücre süspansiyon 10 mililitre aktarın. NK hücre izolasyonantikor karışımı 500 mikrolitre ekleyin. Ve 10 mikrolitre anti CD üç pozitif izolasyon antikor karışımı PBMCs için.
Ve onları 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Vortex manyetik boncuklar ve PBMCs ve antikorlar için bir mililitre ekleyin. Daha sonra MIGS'i oda sıcaklığında ara sıra karıştırarak 10 dakika kuluçkaya yatırın.
35 mililitre NK izolasyon tamponu ekleyin ve tüpü mıknatısın üzerine 15 dakika yerleştirin. 50 mililitrelik plastik pipetle tüpün kenarlarına veya dibine dokunmadan supernatant'ı dikkatlice toplayın. Hücreleri say ve 5 dakika boyunca 800 kez G santrifüj.
Çözünür koridor 15 ile NK hücreleri uyarmak için, imdm 100 mikrolitre içinde 750, 000 hücreleri bir 96 iyi plaka bir kuyuda% 10 HS içeren. ImDM'de mililitre başına 15 ila bir mikrogram ve %10 HS insan koridoru seyreltin. Ve hücrelere seyreltilmiş insan koridoru 15 100 mikrolitre ekleyin.
Bir kontrol örneğini uyarılmamış hücrelerle onarın ve her iki örneği de 37 santigrat derecede kuvöze yerleştirin. 48 saat boyunca hücreleri uyarmak sonra ekstrasellüler akı tayini gerçekleştirmek. Deneyden bir gün önce, analizciyi açın ve 37 santigrat dereceye kadar ısınmasını sağlar.
Sansür kartuşu paketini açın ve kartuş'u yardımcı plakadan ayırın. Daha sonra yardımcı plakanın her kuyuya 200 mikrolitre kalibrasyon çözeltisi ekleyin. Ve sensörlerin tamamen batırılmış olduğundan emin olmak için merkezi kartuşu geri koyun.
Optimum sonuçlar için kartuş bir gecede 37 santigrat derecede karbondioksitsiz bir kuluçka makinesinde inkübün. Bu da düzgün bir şekilde nemlendirildi. Yapışkan kaplı bir bıçak hazırlamak için, plakanın her kuyusundaki hücre yapışkan çözeltisinin 25 mikrolitresi.
Ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yattı. Daha sonra çözeltiyi çıkarın ve plakayı kuyu başına 200 mikrolitre steril su ile iki kez yıkayın. Kuyuların kuruması için plakayı hücre kültürü başlığı içinde 15 dakika açık tutun.
Önceden yalıtılmış NK hücreleri beş dakika için 200 kez G ekleyin santrifüj. Sonra supernatants kaldırmak ve ısıtılmış mitokondriyal stres testi orta veya glikoliz stres testi orta hücreleri yıkayın. Hücreleri tekrar peletleyin ve aynı ortamda tercih edilen hücre konsantrasyonuna geri uzaklaştırın.
180 mikrolitre hücre süspansiyonu her şeyi de tsayme plakasına yerleştirin. Arka plan düzeltme için kontrol kuyuları olarak a bir, A 12 H bir ve H 12 kuyuları kullanın. Bu Wells Kuluçka için 180 mikrolitre sayak orta ekleme 30 dakika boyunca 37 santigrat derece bir karbondioksit içermeyen kuluçka plaka.
Plakayı 200 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Daha sonra mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin ve kuyunun dibinde bir mano tabakası oluşturabileceklerini kontrol edin. Hücreleri 25 dakika daha kuluçkaya yatırın.
37 santigrat derecesıcak çalışma çözümleri. Ve gerekirse 7.4 onların pH'ı hazırla. Mitokondriyal stres testi veya sulu sansür kartuşu A, B ve C panolarına glikoliz stres testi için önceden hazırlanmış bileşikleri yükleyin Programı kurarken yüklü sansür kartuşu geri kuvöze koyun.
Hücre dışı akı test protokolünü ayarlamak için yazılımı açın ve ön işlem koşullarını tanımlamak için Grup tanımlarını kullanın. Benzer koşullara sahip kuyu gruplarını belirtmek için Plaka haritası sekmesini kullanın Ayrıca arka plan düzeltmeve boş kuyuları gösterir. Ardından programı protokoller sekmesinde ayarlayın.
Programı başlatın ve sensör kartuşu ve yardımcı plakayı tepsiye yerleştirin. Kalibrasyon adımından sonra, asay plakası için kalibrasyon plakasını ekli hücrelerle değiştirin. Çalıştırma tamamlandıktan sonra verileri alın ve analiz edin.
NK hücrelerinin saflığını ve canlılığını değerlendirmek için. PVM denizlerinden küçük Alec Watt ve izole NK hücre popülasyonu akış sitometrisi ile boyandı ve analiz edildi. NK hücre popülasyonunun saflığı CD üç ve CD 56 veya NKP 46'ya karşı çift kalarak kurulmuştur.
İnsan NK hücreleri için mitokondriyal oksijen tüketim oranı lots burada gösterilmiştir. Beklendiği gibi I hücre numaraları daha yüksek OCR değerleri görüntülenir. Hücre sayıları da kuyudaki DNA veya protein miktarı ile doğrusal ilişkili.
Öte yandan daha yüksek hücre numaraları optimal değildi. Çünkü DNP'nin eklenmesiyle kuyudaki oksijen konsantrasyonu her döngüde tamamen tükenmişti. Bu da OCR'nin doğru hesaplanmasını engelledi.
İnsan NK hücrelerinde, 100 mikromolar DNP optimal doz olarak bulundu. Her kuyu başına 750, 000 NK hücreli tipik bir mitokondriyal stres testi deneyi burada gösterilmiştir. Bu testte Oligomisin oksijen tüketiminde dramatik bir azalmaya yol açar.
Ve ECAR'da artış. Glikoliye geçiş ivediliği ve hücresel ATP seviyelerini koruma çabasını temsil ediyor. NK hücrelerinin koridor 15 ile aktivasyonu hem mitokondriyal oksijen tüketiminde hem de hücre dışı asitleşmede artışa neden oldu.
Bazal Maksimal ve ATP bağlantılı solunum artmış ancak proton sızıntısı veya non mitokondriyal solunum. Ayrıca, OCR/ECA oranı azaldı IL 15 stimülasyonu ndan sonra glikolitik metabolizmaya geçiş olduğunu gösteren. Bu protokolü gerçekleştirirken, en uygun hücre sayısını belirlemek ve kablosuz ların konsantrasyonu titre etmek için saf ve sağlıklı bir hücre popülasyonu elde etmek çok önemlidir.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
