Functionele analyse van tumor-infiltrerende myeloïde cellen door middel van flowcytometrie en adoptieve overdracht

Samenvatting

Dit protocol biedt betrouwbare methoden voor solide tumordissociatie en myeloïde celisolatie in intradermale of subcutane tumormodellen van muizen. Flowcytometrie maakt fenotypische karakterisering van heterogene myeloïde populaties binnen de micro-omgeving van de tumor mogelijk en sortering zal hun functionaliteit aantonen in de context van adoptieve overdracht.

Samenvatting

Het tumor-infiltrerende myeloïde celcompartiment vertegenwoordigt een heterogene populatie van breed immunosuppressieve cellen die door de tumor zijn uitgebuit om de groei ervan te ondersteunen. Hun accumulatie in tumor- en secundair lymfoïde weefsel leidt tot de onderdrukking van antitumorimmuunresponsen en is dus een doelwit voor therapeutische interventie. Omdat bekend is dat het lokale cytokinemilieu de functionele programmering van tumor-infiltrerende myeloïde cellen kan dicteren, zijn er strategieën bedacht om de tumormicro-omgeving (TME) te manipuleren om een cytokinelandschap tot expressie te brengen dat meer bevorderlijk is voor antitumor myeloïde celactiviteit. Om therapie-geïnduceerde veranderingen in tumor-infiltrerende myeloïde cellen te evalueren, zal dit artikel de procedure schetsen om intradermaal/subcutaan tumorweefsel te dissociëren van solide tumordragende muizen ter voorbereiding op het herstel van leukocyten. Strategieën voor flowcytometrische analyse zullen worden aangereikt om de identificatie van heterogene myeloïde populaties binnen geïsoleerde leukocyten en de karakterisering van unieke myeloïde fenotypes mogelijk te maken. Ten slotte zal dit artikel een manier beschrijven om levensvatbare myeloïde cellen te zuiveren voor functionele assays en hun therapeutische waarde te bepalen in de context van adoptieve overdracht.

Inleiding

De tumormicro-omgeving (TME) bestaat uit snel prolifererende neoplastische cellen en een omringend heterogeen stromaal celcompartiment. Aangezien groeiende tumoren vaak slecht gevasculariseerd zijn, is de TME een perifere plaats die uniek wordt gekenmerkt door hypoxie, tekort aan voedingsstoffen en acidose¹. Om in dit landschap te overleven, resulteren tumorstressreacties en metabole herprogrammering in de secretie van oplosbare factoren die weefselremodellering en angiogenese bevorderen, evenals de selectieve rekrutering van immuuncellen². Aangezien myeloïde cellen een van de meest voor....

Protocol

OPMERKING: Alle dierstudies voldeden aan de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care en werden goedgekeurd door de Animal Research Ethics Board van McMaster University.

1. Tumoroogst en dissociatie

1. Inoculeer 6-8 weken oude, vrouwelijke, C57BL/6 muizen intradermaal/subcutaan met 2 × 10⁵ B16-melanoomcellen zoals beschreven door Nguyen et ^al.8 Laat tumoren 7 dagen groeien voordat ze worden geoogst.
2. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie en zorg ervoor dat de tumor hierbij niet wordt verstoord. Spuit de muis voor het oogsten in m....

Resultaten

De resultaten tonen aan dat deze methode een hoge opbrengst aan myeloïde cellen uit solide muizentumoren oplevert. Het behoud van de integriteit van de receptor en de cellulaire levensvatbaarheid vergemakkelijkt een betrouwbare functionele analyse van de gewenste myeloïde subsets. Deze verbeteringen in de isolatie van myeloïde cellen maakten het mogelijk om de veranderende functie van intratumorale myeloïde cellen te onderscheiden na normalisatie van de TME met de klasse I histondeacetyl.......

Discussie

Hoewel tumor-infiltrerende myeloïde cellen in verschillende activerings- en differentiatietoestanden binnen de tumor voorkomen, zijn er verschillende subgroepen geïdentificeerd, waaronder tumor-geassocieerde DC's (TADC's), tumor-geassocieerde neutrofielen (TAN's), myeloïde-afgeleide suppressorcellen (MDSC's) en tumor-geassocieerde macrofagen (TAM's)¹². Helaas maakt de overlappende expressie van celoppervlakmarkers die worden gebruikt om deze myeloïde celsubsets te.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	560693	1:100
APC-Cy7 Mouse Anti-Mouse NK-1.1	BD Biosciences	560618	1:100
Biotin Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	553771
BV421 Hamster Anti-Mouse CD11c	BD Biosciences	562782	1:100
BV650 Rat Anti-Mouse F4/80	BD Biosciences	743282	1:100
BV711 Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	563046	1:100
Collagenase, Type IV, poeder	Gibco	17104019
DNase I	Roche	10104159001
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18970
EasySep Mouse CD11c Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18780
EasySep Release Mouse Biotin Positive Selection Kit	Stemcell technologies	17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6C	BD Biosciences	553104	1:100
Fixable Viability Stain 510	BD Biosciences	564406	1:1000
Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Cytofix/Cytoperm)	BD Biosciences	554714
PE Rat Anti-CD11b	BD Biosciences	557397	1:100
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	552775	1:100
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse Ly-6G	BD Biosciences	560602	1:100
Perm/Wash (BD Perm/Wash)	BD Biosciences	554723
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141
iNOS Monoclonal Antibody (CXNFT), APC	Thermo Fisher	17-5920-82	1:100
Human/Mouse Arginase 1/ARG1 Fluorescein-geconjugeerd Antilichaam	R&D Systems	IC5868F	1:100