Análise funcional de células mieloides infiltrantes de tumor por citometria de fluxo e transferência adotiva

Resumo

Este protocolo fornece métodos confiáveis de dissociação de tumores sólidos e isolamento de células mieloides em modelos de tumores intradérmicos ou subcutâneos murinos. A citometria de fluxo permite a caracterização fenotípica de populações mieloides heterogêneas dentro do microambiente tumoral e a classificação demonstrará sua funcionalidade no contexto da transferência adotiva.

Resumo

O compartimento de células mielóides infiltrantes do tumor representa uma população heterogênea de células amplamente imunossupressoras que foram exploradas pelo tumor para apoiar seu crescimento. Seu acúmulo no tumor e no tecido linfóide secundário leva à supressão das respostas imunes antitumorais e, portanto, é alvo de intervenção terapêutica. Como se sabe que o meio local de citocinas pode ditar a programação funcional das células mieloides infiltrantes de tumores, estratégias foram elaboradas para manipular o microambiente tumoral (TME) para expressar um cenário de citocinas mais propício à atividade das células mieloides antitumorais. Para avaliar as alterações induzidas pela terapia em células mieloides infiltrantes de tumor, este artigo descreverá o procedimento para dissociar o tecido tumoral intradérmico/subcutâneo de camundongos portadores de tumor sólido em preparação para a recuperação de leucócitos. Estratégias para análise de citometria de fluxo serão fornecidas para permitir a identificação de populações mieloides heterogêneas dentro de leucócitos isolados e a caracterização de fenótipos mieloides únicos. Por fim, este artigo descreverá um meio de purificar células mieloides viáveis para ensaios funcionais e determinar seu valor terapêutico no contexto da transferência adotiva.

Introdução

O microambiente tumoral (TME) é composto por células neoplásicas de rápida proliferação e um compartimento de células estromais heterogêneas circundantes. Como os tumores em crescimento são frequentemente pouco vascularizados, o TME é um local periférico caracterizado exclusivamente por hipóxia, privação de nutrientes e acidose¹. Para sobreviver nesse cenário, as respostas ao estresse tumoral e a reprogramação metabólica resultam na secreção de fatores solúveis que promovem a remodelação tecidual e a angiogênese, bem como o recrutamento seletivo de células imunes². Como as células mieloi....

Protocolo

NOTA: Todos os estudos em animais cumpriram as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados com Animais e foram aprovados pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade McMaster.

1. Colheita e dissociação do tumor

1. Inocular camundongos C57BL/6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade por via intradérmica/subcutânea com 2 × 10⁵ células de melanoma B16, conforme descrito por Nguyen et ^al.8 Permitir que os tumores cresçam por 7 dias antes da colheita.
2. Eutanasiar o camundongo por luxação cervical, certificando-se de não interromper o tumor ao f....

Resultados

Os resultados demonstram que este método produz um alto rendimento de células mieloides de tumores murinos sólidos. A preservação da integridade do receptor e da viabilidade celular facilita a análise funcional confiável dos subconjuntos mieloides desejados. Essas melhorias no isolamento de células mieloides permitiram o discernimento da mudança de função das células mieloides intratumorais após a normalização do TME com o inibidor de histona desacetilase classe I (HDACi), MS-275, durante a terapia adotiva com células T........

Discussão

Embora as células mieloides infiltrantes de tumor existam em estados variados de ativação e diferenciação dentro do tumor, vários subconjuntos foram identificados, incluindo DCs associadas a tumores (TADCs), neutrófilos associados a tumores (TANs), células supressoras derivadas de mielóides (MDSCs) e macrófagos associados a tumores (TAMs) ¹² . Infelizmente, a expressão sobreposta de marcadores de superfície celular usados para identificar esses subconjuntos de cél.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	560693	1:100
APC-Cy7 Mouse Anti-Mouse NK-1.1	BD Biosciences	560618	1:100
Biotina Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	553771
BV421 Hamster Anti-Mouse CD11c	BD Biosciences	562782	1:100
BV650 Rato Anti-Mouse F4/80	BD Biosciences	743282	1:100
BV711 Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	563046	1:100
Colagenase, Tipo IV, pó	Gibco	17104019
DNase I	Roche	10104159001
EasySep Mouse CD11b Kit de Seleção Positiva II	Stemcell technologies	18970
EasySep Mouse CD11c Kit de Seleção Positiva II	Stemcell technologies	18780
Kit de Seleção Positiva de Biotina de Camundongo de Liberação EasySep	Stemcell technologies	17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6C	BD Biosciences	553104	1:100
Mancha de Viabilidade Fixável 510	BD Biosciences	564406	1:1000
Kit de Solução de Fixação/Permeabilização (BD Cytofix/Cytoperm)	BD Biosciences
PE Rato Anti-CD11b	BD Biosciences	557397	1:100
PE-Cy7 Rato Anti-Rato CD4	BD Biosciences	552775	1:100
PerCP-Cy5.5 Rato Anti-Rato Ly-6G	BD Biosciences	560602	1:100
Perm/Lavagem (BD Perm/Lavagem)	BD Biosciences	554723
Rato Purificado Anti-Rato CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141
Anticorpo Monoclonal iNOS (CXNFT), APC	Thermo Fisher	17-5920-82	1:100
Arginase Humana/Camundongo  1/ARG1 Anticorpo conjugado com fluoresceína	R& D Systems	IC5868F	1:100

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