Name: Fraccionamiento flujo de campo de flujo asimétrico para dimensionamiento de nanopartículas de oro en suspensión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprende a utilizar la fraccionación de flujo de campo asimétrico (AF4) con detección UV-vis para determinar la distribución de tamaño de nanopartículas de oro en suspensión. Este método versátil permite analizar muestras complejas y mal dispersas con alta precisión.

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Los autores quieren agradecer a todo el consorcio ACEnano por sus fructíferas discusiones a lo largo de todas las etapas de la preparación del protocolo presentado aquí. Los autores también aprecian la financiación del Programa Horizonte 2020 de la Unión Europea (H2020) en virtud del acuerdo de subvención nº 720952 en el marco del proyecto ACEnano.

1. Configuración del sistema AF4
<ol><li>Monte el cartucho AF4 y conecte todos los componentes de hardware del sistema AF4 y el detector UV-vis(Tabla de materiales)siguiendo las instrucciones dadas en el manual del fabricante.</li>
	<li>Instale todos los paquetes de software necesarios para el control, adquisición de datos, procesamiento y evaluación siguiendo las instrucciones dadas en el manual del fabricante.</li>
	<li>Asegúrese de que se han establecido todas las conexiones de señal necesarias entre el sistema AF4 y el detector UV-vis.</li>
	<li>Asegúrese de que las conexiones AF4-UV-vis establecidas sean estrechas y sin fugas tirando la configuración con agua ultrapura (UPW) durante 15 min (caudal de punta 1 mL∙min-1,caudal de enfoque 1 mL∙min-1y caudal cruzado 1,5 ml∙min-1). Para ello, abra el software de control AF4 e introduzca los caudales en los paneles respectivos en el lado superior derecho de la página de destino. Apriete los conectores respectivos (empalmes), si es necesario, y repita el procedimiento hasta que no se respeten las fugas. NOTA: La presión interna del sistema durante todas las mediciones debe ser monitoreada y debe estar dentro de 4 a 12 bar. En caso de que la presión sea mayor o menor, es necesario ajustar el tubo de contrapresión. Además, la tendencia de presión del canal debe ser constante durante todo el tiempo de medición. NOTA: Si hay un horno de canal disponible, ajuste su temperatura a 25 °C para garantizar condiciones de medición comparables a lo largo de todos los experimentos af4.</li>
</ol>2. Preparación de soluciones y suspensiones para la calificación del sistema AF4-UV-vis y análisis de muestras
<ol><li>Solución de limpieza<ol>
<li>Añadir 8 g de hidróxido de sodio sólido (NaOH) y 2 g de sulfato de dodecilo sódico (SDS) a 1 L de UPW y agitar la solución hasta la disolución total.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluyente<ol>
<li>Añadir 500 μL de mezcla de tensioactivo filtrado a 2 L de UPW filtrado y desgasificación para obtener el eluent (0,025% (v/v), pH alrededor de 9,4). NOTA: En el Cuadro 1 (también Tabla de Materiales) se indica una descripción detallada de los compuestos de la mezcla de tensioactivos . </li>
	</ol>
</li>
	<li>Norma arbitraria de tamaño AuNP para la determinación de recuperación masiva<ol>
<li>Vórtice un estándar de tamaño AuNP arbitrario (50 mg∙L-1)durante 2 min y diluirlo 1:4 con UPW para obtener una concentración de masa final de 12,5 mg∙L-1. Vórtice durante 2 minutos adicionales después de la dilución para homogeneizar la suspensión obtenida. PRECAUCIÓN: Se requieren medidas de precaución necesarias y equipos de protección adecuados cuando se trabaja con productos químicos, especialmente pellets NaOH. NOTA: Generalmente se recomienda desgastear y filtrar todas las soluciones necesarias (excepto la solución de limpieza) utilizando un filtro de membrana de 0,1 μm (PVDF hidrófilo o similar) para garantizar fondos de partículas bajos durante los experimentos af4-UV-vis. Esto puede ser establecido por una unidad de filtración de vacío dedicada o mediante el uso de filtros de jeringa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Calificación del sistema AF4-UV-vis
<ol><li>Utilice los ajustes de software descritos en el paso 1.4 para vaciar el sistema con la solución de limpieza durante 30 min (caudal de punta 1 mL∙min-1,caudal de enfoque 1 mL∙min-1y caudal cruzado 1,5 mL∙min-1).</li>
	<li>Cambie el frasco eluent respectivo y enjuague el sistema con UPW durante 20 min (caudal de punta 1 mL∙min-1,caudal de enfoque 1 mL∙min-1y caudal cruzado 1,5 mL∙min-1).</li>
	<li>Reemplace los filtros de bomba en línea respectivos.</li>
	<li>Abra el cartucho AF4 y reemplace la membrana AF4. Vuelva a montar el cartucho AF4 y vuelva a conectarlo con el sistema AF4-UV-vis.</li>
	<li>Enjuague el sistema AF4-UV-vis limpiado con el eluent durante al menos 30 minutos con el fin de equilibrar la membrana y estabilizar el sistema (caudal de punta 1 mL∙min-1,caudal de enfoque 1 mL∙min-1,y caudal cruzado 1,5 mL∙min-1). Compruebe si hay posibles fugas de nuevo (consulte el paso 1.4).</li>
	<li>Califique el sistema AF4-UV-vis determinando la recuperación masiva y la variación del tiempo de retención utilizando un estándar arbitrario de tamaño AuNP.<ol>
<li>Realice una ejecución de inyección directa sin la aplicación de una fuerza de separación.<ol>
<li>Cree un nuevo archivo de medición abriendo file | Nueva | Ejecutar en el software de control AF4.</li>
			<li>Defina la descripción de la muestra y la medición, así como el volumen de inyección y el nombre de la muestra dentro de la pestaña Ejecutar. Las condiciones de medición se muestran en la Tabla 2.</li>
			<li>Establezca los parámetros de medición en la segunda ficha método FFF según la Tabla 2.</li>
			<li>Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar la medición.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Realice una ejecución de fraccionamiento con la aplicación de una fuerza de separación (Flujo cruzado).<ol>
<li>Defina el método de fraccionamiento como se describe en la sección anterior utilizando las condiciones de fraccionamiento especificadas en la Tabla 3.</li>
			<li>Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar la medición.</li>
			<li>Realice la medición en cuadrúplicado. NOTA: La primera ejecución tiene como objetivo acondicionar el sistema (es decir, la membrana AF4) y se excluirá de la evaluación final de los resultados de calificación del sistema. NOTA: Se recomienda guardar todos los archivos de ejecución generados abriendo file | Ahorre en el software de control AF4.</li>
			<li>Considere el af4-UV-vis-system calificado si se obtiene una recuperación masiva de &gt;80% y una variación del tiempo de retención &lt;2% para el estándar de tamaño AuNP arbitrario.</li>
			<li>Cuando utilice un autoamplificador como sistema de inyección, llene la botella del depósito de lavado de agujas del autoamplificador con la misma solución que se bombea a través del sistema AF4-UV-vis (por ejemplo, solución de limpieza, UPW o eluent respectivo) para garantizar condiciones óptimas de funcionamiento. Al cambiar el eluent, generalmente se recomienda seguir el reequilibrado del sistema AF4 mediante la supervisión de la señal UV-vis-detector hasta que su línea base permanezca estable en un nivel constante.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análisis de muestras AF4-UV-vis
<ol><li>Prepare todos los estándares de tamaño AuNP para la calibración de tamaño externo mediante el vórtice de la suspensión AuNP respectiva (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, cada 50 mg. L-1) durante 2 min y diluirlo 1:4 con UPW para obtener una concentración de masa final de 12,5 mg∙L-1. Vórtice durante 2 minutos adicionales después de la dilución para homogeneizar las suspensiones obtenidas.</li>
	<li>Prepare la muestra AuNP desconocida para el análisis aplicando el mismo procedimiento que para los estándares de calibración descritos en el paso 4.1.</li>
	<li>Realice una medición directa de la inyección de todos los estándares de tamaño AuNP utilizando el método AF4 que se muestra en la Tabla 2.<ol>
<li>Para ello, introduzca los valores respectivos resumidos en la Tabla 2 en el software del fabricante en las posiciones adecuadas para definir los parámetros de separación y muestra y pulse el botón Ejecutar para iniciar el experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fraccionar cada estándar de tamaño AuNP individualmente utilizando el método AF4 que se muestra en la Tabla 3 para establecer la función de calibración de tamaño externo.<ol>
<li>Introduzca los valores respectivos resumidos en la Tabla 3 en el software del fabricante en las posiciones adecuadas. El método de fraccionamiento se define mediante un paso de enfoque, varios pasos de elución y un paso de enjuague. Después de configurar el método, pulse el botón Ejecutar para iniciar el experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realice una medición directa de inyección de la muestra AuNP desconocida utilizando el método AF4 que se muestra en la Tabla 2.</li>
	<li>Realice el fraccionamiento de la muestra AuNP desconocida realizando el método AF4 enumerado en la Tabla 3.</li>
	<li>Llevar a cabo todas las mediciones mencionadas en las Secciones 3 y 4 en triplicado a menos que se indique lo contrario para asegurar resultados significativos y estadísticamente relevantes.<ol>
<li>Almacene 50 mg∙L-1 Suspensiones de stock AuNP a 4-8 °C antes de su uso. Las suspensiones AuNP diluidas se preparan idealmente dentro de los 30 minutos anteriores a la aplicación. NOTA: El vórticeing suele ser suficiente y no es necesaria la ultrasonidos de las suspensiones.</li>
		<li>Para habilitar una correlación del tiempo de retención de la muestra AuNP desconocida con los tiempos de retención obtenidos para los estándares de tamaño AuNP, mida todas las muestras utilizando el mismo método AF4. NOTA: Para asegurar condiciones de separación constantes y válidas, incluya/repita el paso de fraccionamiento descrito en la sección de calificación del sistema (véase el paso 3.6.2) después de un número definido de mediciones de muestra (por ejemplo, 10 mediciones). Además, registre la presión del sistema y la estabilidad basal del detector UV-vis. Deben permanecer estables y constantes a lo largo de una carrera af4-UV-vis completa. NOTA: Por lo general, reemplazar la membrana de ultrafiltración cuando se pierda el detector uv-vis (o detector de dispersión de luz multi ángulo (MALS), si está disponible) muestra un mayor nivel de ruido o los criterios definidos de calificación del sistema, como la recuperación, la forma del pico de la muestra o la repetibilidad (o el sistema AF4-UV-vis fue sometido a un procedimiento de limpieza exhaustivo). En las condiciones descritas aquí, el sistema AF4-UV-vis calificado suele ser estable para al menos 50 mediciones utilizando la misma membrana; sin embargo, el número de posibles mediciones consecutivas que cumplen los criterios de calidad definidos puede variar significativamente dependiendo de la muestra, la matriz de muestras y la composición eluente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Evaluación de datos
<ol><li>Realice el cálculo de recuperación masiva utilizando el software de evaluación de datos proporcionado por el fabricante del sistema AF4-UV-vis o el análisis de hojas de cálculo después de la exportación de todos los datos sin procesar necesarios (es decir, zona de pico UV-vis) desde el software de adquisición de datos respectivo siguiendo las instrucciones dadas en el manual del fabricante.<ol>
<li>Calcule la recuperación de masa AuNP comparando las áreas bajo los respectivos picos UV-vis de la medición del fraccionamiento(fraccionamientoA) y la medición directa de inyección (unainyección directa)utilizando la siguiente ecuación: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ02.jpg"> NOTA: Durante una medición directa de la inyección, no se aplica ninguna fuerza de separación, y por lo tanto se pueden descuidar las interacciones potenciales de una especie de analito con la pared de acumulación. El área bajo un pico UV-vis respectivo puede estar directamente correlacionada con la masa AuNP usando la ley Beer-Lambert suponiendo que ninguna otra especie dentro de la muestra absorbe en los respectivos elutes de longitud de onda y/o i) en otro momento de retención bajo condiciones de fraccionamiento ii) se elimina a través de la membrana AF4.</li>
		<li>Importe los archivos dat. obtenidos tanto de la inyección directa como de la ejecución de fraccionamiento.</li>
		<li>Seleccione la traza del detector UV-vis en la pestaña Visión general.</li>
		<li>Defina una región de interés (ROI) y una línea base en la vista de señal y línea base para todas las mediciones.</li>
		<li>Inserte una calibración de inyección directa mediante insertar.</li>
		<li>Seleccione todas las ejecuciones de inyección directa en la vista Configuración de calibración de inyección directa e introduzca un coeficiente de extinción UV. NOTA: Es importante utilizar el mismo coeficiente de extinción UV-vis tanto para la calibración como para la medición del fraccionamiento.</li>
		<li>Establezca la línea de calibración utilizando el área bajo la traza de señal UV-vis dentro del ROI y la cantidad inyectada calculada a partir de la concentración introducida y el volumen de inyección. La calibración obtenida se mostrará en la ventana independiente función de calibración directa de inyección.</li>
		<li>Asigne la función de calibración a las respectivas mediciones de fraccionamiento. NOTA: Para cada estándar de tamaño de calibración y la muestra AuNP desconocida, es necesario establecer una función de calibración independiente debido a la absorbancia uv-vis dependiente del tamaño de AuNP. Este inconveniente del detector UV-vis se puede eludir utilizando un detector sensible a la masa, como un ICP-MS.</li>
		<li>Realice los análisis insertando un cálculo de resultados cuantitativos y los resultados se mostrarán dentro de una tabla a la derecha como valores de concentración y cantidad inyectada.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcule la variación del tiempo de retención utilizando el software de evaluación de datos proporcionado por el fabricante del sistema AF4 o el análisis de hojas de cálculo después de la exportación de todos los datos sin procesar necesarios (es decir, los tiempos de retención de los estándares de calibración AuNP en los respectivos tiempos máximos de máximo de vis UV y los respectivos tiempos nulos) a partir del software de adquisición de datos respectivo siguiendo las instrucciones dadas en el manual del fabricante.<ol>
<li>Abra la ventana Visión general para mostrar las trazas UV respectivas para todas las mediciones importadas.</li>
		<li>La detección máxima se realizará automáticamente; ajustar los parámetros de detección de picos dentro de la caja de herramientas de procesamiento de señal para optimizar el rendimiento. Extraiga la máxima máxima de pico respectiva revisando todos los archivos de medición.</li>
		<li>Calcule la desviación estándar relativa para todas las mediciones utilizando la siguiente ecuación: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ01.jpg"> El cálculo también se puede realizar utilizando un software de hoja de cálculo respectivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar la determinación de tamaño utilizando el software de evaluación de datos proporcionado por el fabricante o el análisis de hojas de cálculo después de la exportación de todos los datos sin procesar necesarios (tiempo de retención en uv-vis máximo máximo de analito y tiempo nulo respectivo) desde el software de adquisición de datos respectivo siguiendo las instrucciones dadas en el manual del fabricante. Se puede establecer una función de calibración de tamaño externo trazando los tiempos de retención corregidos por tiempo nulo (tiempos de retención netos, véase la Tabla 5)de los estándares de tamaño AuNP (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) contra sus tamaños hidrodinámicos obtenidos de mediciones DLS realizadas previamente (véase la Tabla 4). NOTA: Las mediciones DLS deben realizarse idealmente el mismo día que las mediciones de fraccionamiento respectivas para garantizar propiedades de muestra comparables.<ol>
<li>Después de importar los archivos .dat, todas las mediciones se muestran en la pestaña Visión general. Seleccione la señal del detector UV-vis de la lista de detectores, que se muestra debajo de la ventana de superposición. Defina un ROI y una línea base para cada medición, que se pueden ajustar en la vista Señal y Línea base. Utilice la caja de herramientas procesamiento de señal a la derecha para suavizar las señales ruidosas. Utilice la función Asignar parámetros de procesamiento a otras ejecuciones para permitir que los parámetros se asignen a otras mediciones, respectivamente.</li>
		<li>Seleccione la Calibración de tamaño de partícula en la pestaña Insertar.</li>
		<li>Seleccione todas las ejecuciones de calibración haciendo clic en la medición respectiva en la tabla Seleccionar referencias para calibración en la parte superior derecha. Todas las mediciones seleccionadas se mostrarán en una tabla a continuación. Introduzca el radio hidrodinámico para todas las mediciones de calibración especificadas en la Tabla 4. La función se mostrará en la calibración tamaño de partícula – Ventana de función y la ecuación también se mostrará. NOTA: El coeficiente de correlación (R2)de la función de calibración de tamaño establecida debe ser ≥0.990.</li>
		<li>Asigne la función de calibración a las mediciones de la muestra AuNP desconocida seleccionando los fraccionamientos respectivos dentro de la lista Seleccionar ejecuciones para asignación.</li>
		<li>Muestre los resultados abriendo un cálculo de distribución de tamaño de partícula dentro de la pestaña insertar. La calibración de tamaño de partícula creada anteriormente se enumerará como calibración para las mediciones desconocidas de la muestra AuNP, que se muestra en la configuraciónde la ventana derecha. El tamaño calculado se mostrará en la ventana de distribución de tamaño etiquetada al máximo máximo. Seleccione la casilla Señales medias para muestra para promediar todas las mediciones de una muestra y enumere el resultado en la etiqueta máxima máxima.</li>
		<li>Además, trace la línea de calibración sobre el fractograma seleccionando la casilla Mostrar curva de calibración. Una distribución de tamaño acumulado está disponible seleccionando la casilla Mostrar distribución acumulativa. NOTA: Cuando se utiliza el software del fabricante para la evaluación de datos, se recomienda agregar todos los resultados a un informe, que se puede generar haciendo clic en Informe dentro de la pestaña Insertar. El botón Informe agrega todos los resultados, tablas y diagramas a un documento. En la pestaña Informe, la configuración del informe se puede cambiar abriendo Configuración de informe en la sección Documento.</li>
	</ol></li>
</ol>

Todos los autores de este manuscrito son empleados de Postnova Analytics GmbH, cuyos productos se utilizan en este protocolo.

El tamaño hidrodinámico de un AuNP desconocido fue evaluado con precisión por AF4 junto con un detector UV-vis utilizando estándares de tamaño AuNP bien definidos que van desde 20 nm a 100 nm. El método AF4 desarrollado fue optimizado utilizando un perfil de flujo cruzado constante con el fin de establecer una relación lineal entre el tiempo de retención medido y el tamaño auNP, permitiendo así una determinación de tamaño directa a partir del análisis de regresión lineal. También se centró especialmente en lograr tasas de recuperación suficientemente altas que indicaran que no había pérdida significativa de muestras durante el fraccionamiento, y que el método AF4 desarrollado, incluido el eluent aplicado y la membrana, coincidía bien con todas las muestras de AuNP fraccionadas.
El desarrollo del método es sin duda el paso más crítico en AF4 y varios parámetros, incluyendo dimensiones de canal, parámetros de flujo, así como eluent, membrana, altura del espaciador, e incluso propiedades de muestra tienen que ser tomados en cuenta con el fin de mejorar el fraccionamiento dentro de una ventana de tiempo de elución dada. El propósito de este párrafo es guiar al lector a través de los pasos críticos que fueron optimizados para determinar con éxito el tamaño de la muestra aunp desconocida discutida aquí. Para una descripción más detallada de cómo desarrollar generalmente un método AF4, el lector se hace referencia a la sección AF4 de 'ISO/TS21362:2018 - Nanotecnologías - Análisis de nano-objetos utilizando flujo asimétrico y fraccionamiento centrífugo de flujo decampo» 25. Teniendo un vistazo más de cerca a las condiciones de fraccionamiento aplicadas dadas en la Tabla 3,el primer paso crítico es la introducción y relajación de la muestra AuNP en el canal AF4. Este paso se rige por el flujo de inyección, el flujo de enfoque y el flujo cruzado, cuya interacción obliga a la muestra a localizar cerca de la superficie de la membrana y concentrarla en una banda estrecha cerca del puerto de inyección del canal AF4 básicamente definiendo el punto de partida del fraccionamiento. Una relajación suficiente de la muestra es obligatoria ya que durante este paso, los componentes de muestra de diferentes tamaños se localizan en diferentes alturas del canal AF4 proporcionando así la base para un fraccionamiento de tamaño exitoso. La relajación incompleta de la muestra suele ser visible por un aumento del área pico del vacío resultante de componentes de muestra no retenciones (es decir, no relajados). Este efecto se puede mitigar aumentando el tiempo de inyección y/o el caudal cruzado aplicado. Sin embargo, ambos parámetros necesitan una optimización cuidadosa, especialmente para muestras que son propensas a la aglomeración y adsorción en la membrana AF4, y pueden ser monitoreadas por las respectivas tasas de recuperación obtenidas para diferentes ajustes de parámetros36,37. El tiempo de inyección aplicado de 5 minutos junto con un caudal cruzado de 1,0 ml∙min-1 reveló tasas de recuperación >80% para todas las muestras auNP y una zona pico nula insignificante que indica condiciones de relajación casi óptimas. Después de una relajación suficiente de la muestra AuNP, el flujo de enfoque se detuvo y se inició el transporte de muestras a lo largo de la longitud del canal AF4 al detector uv-vis respectivo que representa el segundo paso crítico. Con el fin de garantizar una potencia de fraccionamiento suficientemente alta en tiempos de análisis razonables, se aplicó un caudal cruzado constante de 1,0 ml∙min-1 para 30-50 min (dependiendo del estándar de tamaño AuNP fraccionado respectivo) seguido de una decaimiento de flujo cruzado lineal de 10 minutos a un caudal de detector de 0,5 ml.min-1. El uso de un perfil de flujo cruzado constante a través de la separación de todos los estándares de tamaño AuNP reveló una relación lineal entre el tiempo de retención y el tamaño auNP después de la teoría FFF22,lo que permite la determinación de tamaño de la muestra AuNP desconocida mediante un simple análisis de regresión lineal. Sin embargo, perfiles distintos de un flujo cruzado constante también han sido explotados para dimensionar nanopartículas, lo que en última instancia conduce a una relación no lineal entre el tiempo de retención y el tamaño de las partículas38,39. Además, la determinación de tamaño en AF4 utilizando estándares de tamaño bien definidos no se limita a AuNP, sino que también se puede aplicar a nanopartículas con otros tamaños y composición elemental (por ejemplo, plata38,40 o nanopartículas de sílice41,42). Además, al trabajar con muestras diluidas, ICP-MS es un detector elemental altamente sensible, que se puede combinar con AF4, lo que se suma a la versatilidad de este enfoque analítico para dimensionar una gran variedad de nanopartículas en suspensión.
A pesar de su aplicación generalizada, la calibración de tamaño externo utilizando estándares de tamaño bien definidos en AF4 tiene algunas peculiaridades que deben tenerse en cuenta al usarlo para un dimensionamiento preciso de muestras desconocidas. En primer lugar, se basa en gran medida en la aplicación de condiciones comparables durante el fraccionamiento de las normas de tamaño respectivos y la muestra real. Por lo tanto, en el caso que se presenta aquí, es obligatorio que tanto las normas de tamaño AuNP como la muestra AuNP desconocida se fraccionen utilizando el mismo método AF4, así como el mismo eluent y la misma membrana que hace que este enfoque sea bastante inflexible. Además, al no tener detectores sensibles al tamaño, por ejemplo, dispersión de luz (MALS y DLS) a mano, es difícil determinar si un método AF4 respectivo que utiliza estándares de tamaño funciona lo suficientemente bien o no. Esto es especialmente cierto para muestras desconocidas que exhiben distribuciones de tamaño muy amplio, donde no está claro si todos los componentes de la muestra siguen el patrón de elución normal: fraccionamiento de partículas más pequeñas a más grandes, o si los componentes de muestra más grandes ya se provocan en modo de hipercapa esterica potencialmente co-eluting con componentes de muestra más pequeños43,44. Además, a pesar de que la teoría de FFF enfatiza que AF4 se separa únicamente en función de las diferencias en el tamaño hidrodinámico con partículas consideradas masas puntuales sin ninguna interacción con su entorno22,la realidad cuenta una historia diferente con interacciones partícula-partículas y partículas-membrana (como atracción electrostática/repulsión o atracción van-der-Waals) puede desempeñar un papel considerable y potencialmente puede introducir un sesgo medible en determinaciones de tamaño a través de la calibración de tamaño externo45,46. Por lo tanto, se recomienda utilizar estándares de tamaño que coincidan idealmente con la composición y las propiedades superficiales (potencial Zeta) de la partícula de interés40,42 o, si no están disponibles, al menos utilizar estándares de tamaño de partículas bien caracterizados (por ejemplo, partículas de látex de poliestireno) y evaluar cuidadosamente su comparabilidad con la partícula de interés especialmente en términos de su potencial zeta superficial en el entorno respectivo, en el que el análisis se llevará a cabo41,47.
La versatilidad de AF4 se considera a menudo su mayor fortaleza, ya que ofrece un rango de aplicaciones que va más allá de la mayoría de las otras técnicas de dimensionamiento comunes en este campo22,48,49. Al mismo tiempo, debido a su complejidad presumible asociada, también puede considerarse como su inconveniente más significativo, especialmente contra técnicas de dimensionamiento rápidas y aparentemente fáciles de usar, como DLS, análisis de seguimiento de nanopartículas o ICP-MS de partículas individuales. No obstante, al poner af4 en perspectiva con estas técnicas de dimensionamiento populares, queda claro que todas las técnicas tienen sus pros y sus contras, pero todas ellas contribuyen a una comprensión más completa de la naturaleza fisicoquímica de las nanopartículas y, por lo tanto, deben considerarse complementarias en lugar de competitivas.
El procedimiento operativo estándar (SOP) presentado aquí, destaca la excelente aplicabilidad de AF4-UV-vis con calibración de tamaño externo para dimensionamiento de una muestra aunp desconocida en suspensión y finalmente se aplicó como una directriz recomendada para el análisis AF4 de una muestra aunp desconocida dentro de una comparación interlaboratoria internacional (ILC) que se llevó a cabo en la trama del proyecto Horizonte 2020, ACEnano (el resultado de este ILC será objeto de una futura publicación). Este protocolo, por lo tanto, se suma a los esfuerzos internacionales alentadores y en curso para validar y estandarizar las metodologías AF425,50,51,52 subrayando el potencial prometedor de AF4 en el campo de la caracterización de nanopartículas.

Las nanopartículas de oro (AuNP) en forma de oro coloidal habían sido parte de la cultura humana mucho antes de que hubiera una comprensión de lo que eran las nanopartículas y antes de que el término nanopartícula hubiera encontrado su camino en el vocabulario contemporáneo y científico. Sin un conocimiento distintivo de su aspecto a nanoescala, auNP suspendido ya había sido utilizado para fines médicos y otros propósitos en la antigua China, Arabia, e India en los siglos V-VI aC1,y también los antiguos romanos aprovecharon su color rojo rubí para manchar famosamente su cerámica en la exposición de la Copa Lycurgus en el Museo Británico2. En el mundo occidental, a lo largo de los siglos desde la Edad Media hasta la Era Moderna, aunp suspendido fueron utilizados predominantemente como agentes colorantes para vidrio y esmalte (Púrpura de Cassius)3, así como para tratar una variedad de enfermedades (Oro Potable), especialmente sífilis4.
Sin embargo, todos estos estudios se habían centrado principalmente en la aplicación de AuNP suspendido y le ocurrió a Michael Faraday en 1857 introducir el primer enfoque racional para investigar su formación, su naturaleza, así como sus propiedades5. Aunque Faraday ya era consciente de que estos AuNP deben tener dimensiones muy minuciosas, no fue hasta el desarrollo de microscopía electrónica cuando la información explícita sobre su distribución de tamaño era accesible6,7,permitiendo finalmente la correlación entre el tamaño y otras propiedades aunp.
Hoy en día, gracias a su síntesis bastante fácil y directa, notables propiedades ópticas (resonancia de plasmón superficial), buena estabilidad química y por lo tanto toxicidad menor, así como su alta versatilidad en términos de tamaños disponibles y modificaciones superficiales, AuNP han encontrado aplicaciones generalizadas en campos como la nanoelectrónica8,diagnóstico9,terapia contra el cáncer10,o la administración de fármacos11. Obviamente, para estas aplicaciones, el conocimiento preciso del tamaño y la distribución del tamaño del AuNP aplicado es un requisito previo fundamental para garantizar una eficacia óptima12 y hay una demanda sustancial de herramientas robustas y fiables para determinar este parámetro fisicoquí químico crucial. Hoy en día, hay una gran cantidad de técnicas analíticas capaces de dimensionar AuNP en suspensión, incluyendo, por ejemplo, Espectroscopia UV-vis (UV-vis)13, Dispersión dinámica de luz (DLS)14 o Espectrometría de masa plasmática acoplada inductivamente de partículas únicas (SPICP-MS)15 con fraccionamiento de flujo de campo (FFF) siendo un jugador clave en este campo16,17,18,19,20.
Conceptualizado por primera vez en 1966 por J. Calvin Giddings21, FFF comprende una familia de técnicas de fraccionamiento basadas en elution, donde la separación tiene lugar dentro de un canal delgado, similar a una cinta sin una fase estacionaria22,23. En FFF, la separación es inducida por la interacción de una muestra con un campo de fuerza externo que actúa perpendicular a la dirección de un flujo de canal laminar, en el que la muestra se transporta río abajo normalmente hacia los detectores en línea respectivos. Entre estas técnicas FFF relacionadas, el Fraccionamiento flujo asimétrico campo-flujo (AF4), donde un segundo flujo (flujo cruzado) actúa como campo de fuerza, se ha convertido en el subtipo24más utilizado. En AF4, el fondo del canal (pared de acumulación) está equipado con una membrana de ultrafiltración semipermeable que es capaz de retener la muestra mientras que al mismo tiempo permite que el flujo cruzado pase a través de la membrana y salga del canal a través de una salida adicional. Por este medio, el flujo cruzado puede empujar la muestra hacia la pared de acumulación contrarrestando así su flujo inducido por difusión (movimiento browniano). En un equilibrio resultante de los fundentes inducidos por el campo y la difusión; los componentes de muestra más pequeños que exhiben coeficientes de difusión más altos se alinean más cerca del centro del canal, mientras que los componentes de muestra más grandes que exhiben coeficientes de difusión más bajos se ubican más cerca de la pared de acumulación. Debido al perfil de flujo parabólico dentro del canal, por lo tanto, los componentes de muestra más pequeños se transportan en las láminas más rápidas del flujo de canal y elute antes de componentes de muestra más grandes. Utilizando el parámetro de retención FFF y las ecuaciones de coeficiente de difusión Stokes-Einstein, el tiempo de elución y, respectivamente, el volumen de elución, de una muestra en AF4 se pueden traducir directamente a su tamaño hidrodinámico22. Aquí el comportamiento de elución descrito se refiere al modo de elución normal y suele ser válido para AF4 dentro de un rango de tamaño de partícula entre aproximadamente 1-500 nm (a veces hasta 2000 nm dependiendo de las propiedades de las partículas y los parámetros de fraccionamiento), mientras que la elución estetérica-hipercapa generalmente ocurre por encima de este umbral de tamaño25.
Hay tres maneras comunes de derivar información de tamaño después de la separación por FFF. Dado que FFF es un instrumento modular, se puede combinar aguas abajo con múltiples detectores tales como detectores de dispersión de luz sensibles al tamaño basados en el principio de dispersión de luz multi-ángulo (MALS)26,27, dispersión de luz dinámica (DLS)28,29, o incluso una combinación de ambos para obtener información de forma adicional30,31. Sin embargo, dado que el comportamiento de retención de una muestra en un canal FFF generalmente se rige por fuerzas físicas bien definidas, el tamaño también se puede calcular utilizando un enfoque matemático (teoría FFF), donde un detector de concentración simple (por ejemplo, un detector UV-vis) es suficiente para indicar la presencia de una muestra de elucio32,33.
Como tercera opción, aquí informamos de la aplicación de una calibración de tamaño externo34,35 utilizando estándares AuNP bien definidos en el rango de tamaño de 20-100 nm para dimensionar una muestra de nanopartícula de oro desconocida en suspensión utilizando AF4 junto con detección de vis UV. Esta sencilla configuración experimental fue elegida a propósito para permitir que tantos laboratorios como fuera posible se unieran a una comparación interlaboratoria internacional (ILC), que más tarde se realizó en el marco del proyecto de la Unión Europea Horizonte 2020 ACEnano basado en el protocolo presentado aquí.

<table><tbody><tr><td>0,1 y micro; m Filtros de membrana (PVDF hidrófilo)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-FIL-TEF-002</td><td>Se utiliza para la filtración de soluciones acuosas</td></tr><tr><td>0.22 & m Filtro de jeringa de PVDF (d = 33 mm)</td><td>Merck Millipore</td><td>Durapore Millex</td><td>Se utiliza para la filtración de pipetas de volumen ajustable NovaChem100</td></tr><tr><td>(1000 y micro; L)</td><td>Eppendorf AG</td><td>Research Plus</td><td>Se utiliza para preparar suspensiones de AuNP diluidas</td></tr><tr><td>Cartucho AF4</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF - AF4 Componente del canal analítico</td><td>AF2000 MF - MultiFlow FFF, que se describe como sistema AF4 en el manuscrito</td></tr><tr><td>Membrana AF4 - Celulosa regenerada (10 kDa MWCO)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td><td>Componente de la configuración AF2000 MF - MultiFlow FFF, que se describe como sistema AF4 en el manuscrito</td></tr><tr><td>Balanza analítica (precisión de 0,1 mg)</td><td>Sartorius</td><td>ENTRIS124I-1S</td><td>Se utiliza para pesar pellets de SDS y NaOH para la preparación de la solución de limpieza</td></tr><tr><td>Muestreador</td> automático <td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN5300</td><td>Componente de la configuración AF2000 MF - MultiFlow FFF, que se describe como sistema AF4 en el manuscrito</td></tr><tr><td>Channel Oven</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN4020</td><td>Componente de la configuración AF2000 MF - MultiFlow FFF, que se describe como sistema AF4 en el manuscrito</td></tr><tr><td>Módulo de flujo cruzado</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF Módulo</td><td>de control Componente de la configuración AF2000 MF - MultiFlow FFF, que se describe como sistema AF4 en el manuscrito</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta desechables (1000 &micro; L)</td><td>Eppendorf AG</td><td>ep T.I.P.S</td><td>Se utiliza para preparar suspensiones diluidas de AuNP</td></tr><tr><td>Matraces (p. ej., de 2 litros de volumen)</td><td>neoLab</td><td>1-0199</td><td>Se utiliza para el almacenamiento de eluyentes</td></tr><tr><td>Bomba de enfoque</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1131</td><td>Componente de la configuración AF2000 MF - MultiFlow FFF, que se describe como sistema AF4 en el manuscrito</td></tr><tr><td>Viales de vidrio (p. ej., volumen de 1,5 mL)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>VIA-002</td><td>Se utiliza para el almacenamiento de muestras</td></tr><tr><td>Estándares de tamaño de nanopartículas de oro (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaCal Gold</td><td>50 mg L-1 cada uno, utilizado para establecer la función de calibración de tamaño</td></tr><tr><td>Agitador magnético</td><td>IKA</td><td>VIBRAX-VXR</td><td>Se utiliza para acelerar la disolución de gránulos de SDS y NaOH en UPW</td></tr><tr><td>Personal Computer (PC)</td><td>Dell Technologies</td><td>/</td><td>Unidad para controlar las ejecuciones de AF4, registrar y evaluar los datos recopilados, para los requisitos necesarios de hardware y software, el lector se remite al manual Postnova AF2000</td></tr><tr><td>Equipo de protección personal (guantes, bata de laboratorio, gafas, etc.)</td><td>/</td><td>/</td><td>De acuerdo con el laboratorio respectivo' s Reglas de seguridad para trabajar con productos químicos, incluidos los nanomateriales de ingeniería</td></tr><tr><td>Tapa de rosca para viales de vidrio (por ejemplo, 1,5 mL de volumen)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-VIA-09150868</td><td>Se utiliza para el almacenamiento de muestras</td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de sodio (SDS), &ge; 99 %, Grado de secado</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG</td><td>2326.1</td><td>Se utiliza para la preparación de la solución de limpieza</td></tr><tr><td>Pellets de hidróxido de sodio (NaOH), &ge; 98 %, p.a</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG</td><td>6771.1</td><td>Se utiliza para la preparación de la solución de limpieza</td></tr><tr><td>Paquete de software para el control y la adquisición de datos</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Software NovaFFF AF2000</td><td>Software para realizar ejecuciones de Af4 y adquisición de datos, para los requisitos necesarios de hardware y software, el lector se remite al manual de Postnova AF2000</td></tr><tr><td>Paquete de software para la evaluación de datos</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Software NovaAnalysis</td><td>Software para la evaluación de datos AF4, para los requisitos necesarios de hardware y software, el lector se remite al manual Postnova NovaAnalysis</td></tr><tr><td>Paquete de software para el procesamiento final de datos</td><td>OriginLab Corporation</td><td>Origin 2019</td><td>Se utiliza para el procesamiento final de datos</td></tr><tr><td>Desgasificador de solventes</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7520</td><td>Componente de la configuración AF2000 MF - MultiFlow FFF, que se describe como sistema AF4 en el manuscrito</td></tr><tr><td>Selector de disolventes</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7310</td><td>Componente de la configuración AF2000 MF - MultiFlow FFF, que se describe como sistema AF4 en el manuscrito</td></tr><tr><td>Organizador de disolventes</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7140</td><td>Componente de la configuración AF2000 MF - MultiFlow FFF, que se describe como sistema AF4 en el manuscrito</td></tr><tr><td>Mezcla de tensioactivos</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaChem100</td><td>Mezcla de diferentes tensioactivos y sales utilizadas para la preparación de eluyentes</td></tr><tr><td>Bomba de punta</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1130</td><td>Componente de la configuración AF2000 MF - MultiFlow FFF, que se describe como sistema AF4 en el manuscrito</td></tr><tr><td>Muestra desconocida de AuNP</td><td>BBI Solutions</td><td>EM. GC60</td><td>Muestra de AuNP de 60 nm utilizada para la determinación del tamaño mediante la función de calibración de tamaño</td></tr><tr><td>Detector UV-vis</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN3211</td><td>Detector UV-vis Para el acoplamiento posterior con el sistema AF4</td></tr><tr><td>Unidad de filtración al vacío</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Sistema de filtración de eluyentes</td><td>Se utiliza para garantizar un bajo fondo de partículas y la eliminación del aire disuelto en los eluyentes utilizados para garantizar unas condiciones óptimas de fraccionamiento de AF4</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>Vortex Genie 2</td><td>Se utiliza para la homogeneización de suspensiones diluidas de AuNP Sistema de</td></tr><tr><td>purificación de agua</td><td>Merck Millipore</td><td>Milli-Q Integral 5</td><td>Se utiliza para generar agua ultrapura (UPW, 18.2 M&Omega; cm resistividad) para la preparación de la solución de limpieza, eluyentes y dilución de suspensiones de AuNP</td></tr></tbody></table>

fraccionamiento flujo de campo de flujo asimétrico para dimensionamiento de nanopartículas de oro en suspensión

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

El tamaño de las partículas es sin duda el parámetro físico-químico más importante asociado con la noción de una nanopartícula. El conocimiento preciso del tamaño y la distribución del tamaño de las nanopartículas es de suma importancia para diversas aplicaciones. El rango de tamaño también es importante, ya que define el componente más "activo" de una dosis de nanopartícula.
El Fraccionamiento flujo de campo de flujo asimétrico (AF4) es una técnica poderosa para dimensionar partículas en suspensión en un rango de tamaño de aproximadamente 1-1000 nm. Hay varias maneras de obtener información de tamaño de un experimento AF4. Además de acoplar AF4 en línea con detectores sensibles al tamaño basados en los principios de dispersión de luz multi-ángulo o dispersión dinámica de luz, también existe la posibilidad de correlacionar el tamaño de una muestra con su tiempo de retención utilizando un enfoque teórico bien establecido (teoría FFF) o comparándolo con los tiempos de retención de los estándares de tamaño de partículas bien definidos (calibración de tamaño externo).
Aquí describimos el desarrollo y la validación interna de un procedimiento operativo estándar (SOP) para el tamaño de una muestra de nanopartícula de oro desconocida por AF4 junto con la detección uv-vis utilizando la calibración de tamaño externo con estándares de nanopartícula de oro en el rango de tamaño de 20-100 nm. Este procedimiento proporciona una descripción detallada del flujo de trabajo desarrollado, incluida la preparación de muestras, la configuración y calificación del instrumento AF4, el desarrollo del método AF4 y el fraccionamiento de la muestra de nanopartículas de oro desconocida, así como la correlación de los resultados obtenidos con la calibración de tamaño externo establecida. El PSOE descrito aquí fue finalmente validado con éxito en el marco de un estudio de comparación interlaboratorio que destaca la excelente robustez y fiabilidad de AF4 para el dimensionamiento de muestras nanopartículas en suspensión.

En primer lugar, los estándares de tamaño AuNP fueron fraccionados por AF4 y detectados por UV-vis midiendo la absorbancia del AuNP a una longitud de onda de 532 nm (resonancia de plásmido superficial de AuNP). En la Figura 1se presenta una superposición de los fractogramas obtenidos. Los tiempos de retención de cada AuNP en su respectivo máximo uv-vis máximo obtenido de las mediciones triplicadas se enumeran en la Tabla 5. La desviación estándar relativa de todos los tiempos de retención fue inferior al 1,1% con una variación de medición decreciente con un tamaño creciente. En general, se logró una excelente repetibilidad. Se aplicó una fuerza de separación constante, lo que dio lugar a una relación lineal de tiempo de elución y tamaño hidrodinámico. La línea de calibración de tamaño externo se estableció trazando el radio hidrodinámico especificado contra el tiempo nulo corregido tiempo de elución (tiempo de retención neta). Un análisis de regresión lineal dio lugar a una función de calibración lineal con una intercepción a = -3.373 nm ± 1.716 nm y una pendiente b = 1.209 nm∙min-1 ± 0,055 nm∙min-1. El comportamiento lineal de la elución se confirmó con un coeficiente de correlación cuadrado R2 de 0,9958. La función de calibración respectiva se muestra visualmente en la Figura 2.
La segunda parte se ocupó del análisis de la muestra desconocida de AuNP. Se prepararon tres coácuotas de la muestra de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección del protocolo (sección 4.2). Cada una de las tres alícuotas fue investigada en triplicado utilizando el mismo método de fraccionamiento AF4 que también se aplicó para los estándares de tamaño AuNP. Los nueve fractogramas AF4-UV-vis obtenidos de la muestra aunp desconocida se presentan en la Figura 3 y sus respectivas evaluaciones se resumen en el Cuadro 6. La desviación estándar relativa de los respectivos tiempos de retención fue significativamente baja y osciló entre el 0,1% y el 0,5%. Utilizando la función de calibración del tamaño de partícula obtenida del fraccionamiento de los estándares de tamaño AuNP y correlacionándola con los tiempos de retención obtenidos de la muestra AuNP desconocida en el máximo máximo de uv-vis, se podría calcular un radio hidrodinámico promedio global de 29,4 nm ± 0,2 nm. Además, se obtuvo una recuperación razonable de masa del 83,1% ± 1,2% que indica que no se haya realizado ninguna aglomeración o disolución significativa de la muestra AuNP o una adsorción considerable de partículas en la superficie de la membrana. La Figura 4 muestra la distribución del tamaño de partícula obtenida con las nueve trazas de señal UV-vis promediadas destacando la excelente robustez del método AF4 aplicado.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg"> Figura 1: Fractogramas AF4-UV-vis obtenidos del análisis triplicado de los cuatro estándares individuales de calibración de tamaño AuNP con intensidades de señal normalizadas y caudal cruzado constante aplicado (línea negra). El pico vacío se resalta en gris alrededor de 5,9 minutos <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg"> Figura 2: Función de calibración de tamaño externo obtenida, incluidas las barras de error derivadas de las respectivas desviaciones estándar de las mediciones DLS(Tabla 4)y las desviaciones en los tiempos de retención AF4 obtenidos(Tabla 5),después de trazar el radio hidrodinámico especificado contra el tiempo de retención de cada estándar de calibración de tamaño AuNP individual en su máximo máximo de pico respectivo. Una función de calibración lineal con errores estándar en forma de y = a + bx con a = -3.373 nm ± 1.716 nm y b = 1.209 nm·min-1 ± 0.055 nm·min-1 se calculó a partir de un análisis de regresión lineal. Se determinó un coeficiente de correlación al cuadrado con R2 = 0,9958, lo que indica una relación lineal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg"> Figura 3: AF4-UV-vis fractogramas de mediciones triplicadas de tres alícuotas que muestran el AuNP desconocido. El caudal cruzado constante aplicado durante el tiempo de medición se ilustra como una línea negra. El pico vacío en torno a 5,9 min se resalta en gris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg"> Figura 4: Superposición de la distribución media de tamaño de partícula obtenida (rojo) de la muestra AuNP desconocida y la función de calibración lineal aplicada (línea punteada). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Componente</td>
			<td>CAS-No</td>
			<td>Peso (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Agua</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">9-Ácido octadecenoico (Z)-, compuesto con 2,2',2'-nitrilotris[etanol](1:1)</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Carbonato de sodio</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Alcoholes, C12-14-secundario, etoxilados</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Tetrasodium EDTA</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Polietilenglicol</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Oleato de sodio</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bicarbonato de sodio</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Lista de los componentes de la mezcla de tensioactivos utilizados para preparar el eluent (véase también Tabla de materiales).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parámetros AF4-UV-vis</td>
			<td>Unidad</td>
			<td>Valor</td>
		</tr>
<tr>
<td>Espesor del espaciador</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caudal del detector</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caudal cruzado</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0 (constante durante 8 min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caudal de enfoque</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiempo de retardo / tiempo de estabilización</td>
			<td>Min</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caudal de inyección</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiempo de transición</td>
			<td>Min</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiempo de inyección</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Paso de elución</td>
			<td>Min</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enjuagar el tiempo del paso</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tasa de flujo de pasos de enjuague</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volumen de inyección</td>
			<td>Μl</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentración de muestras</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de membrana</td>
			<td></td>
			<td>Celulosa regenerada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corte de peso molecular de membrana</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluyente</td>
			<td></td>
			<td>0.025% (v/v) mezcla de tensioactivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longitud de onda UV-vis</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sensibilidad UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Resumen de los parámetros del método de fraccionamiento AF4-UV-vis para realizar la ejecución de inyección directa sin la aplicación de una fuerza de separación.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parámetros AF4-UV-vis</td>
			<td>Unidad</td>
			<td>Valor</td>
		</tr>
<tr>
<td>Espesor del espaciador</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caudal del detector</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caudal cruzado</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1 (constante de 60 min, 10 min lineal)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caudal de enfoque</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiempo de retardo / tiempo de estabilización</td>
			<td>Min</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Caudal de inyección</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiempo de transición</td>
			<td>Min</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiempo de inyección</td>
			<td>Min</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Paso de elución</td>
			<td>Min</td>
			<td>70 (constante de 60 min, lineal de 10 min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Paso de enjuague</td>
			<td>Min</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tasa de flujo de pasos de enjuague</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volumen de inyección</td>
			<td>Μl</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentración de muestras</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo de membrana</td>
			<td></td>
			<td>Celulosa regenerada</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corte de peso molecular de membrana</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluyente</td>
			<td></td>
			<td>0.025% (v/v) mezcla de tensioactivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longitud de onda UV-vis</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sensibilidad UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 3: Resumen de los parámetros del método de fraccionamiento AF4-UV-vis para realizar la ejecución de fraccionamiento con la aplicación de un flujo cruzado como fuerza de separación.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Estándar de calibración</td>
			<td>Agente de taponamiento</td>
			<td>Tamaño medio (TEM) (nm)</td>
			<td>CV (tamaño medio TEM) (%)</td>
			<td>Potencial Zeta (mV)</td>
			<td>SD (potencial zeta) (mV)</td>
			<td>Radio hidrodinámico (DLS) (nm)</td>
			<td>SD (radio hidrodinámico) (nm)</td>
			<td>Pdi</td>
			<td>SD (PDI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 20 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>20.1</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-48.9</td>
			<td>1.5</td>
			<td>10.95</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.082</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 40 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>40.8</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-30.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20.30</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.127</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 80 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>79.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-51.5</td>
			<td>1.3</td>
			<td>38.85</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.138</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 100 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>102.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-50.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>52.30</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.078</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 4: Resumen de los parámetros fisicoquímicos de los estándares de calibración AuNP aplicados, incluyendo agente de tapado, tamaño medio TEM, potencial Zeta determinado en la suspensión nativa, radio hidrodinámico DLS e índice de polidispersidad (PDI) determinado en el eluent.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Estándar de calibración</td>
			<td>Ejecutar</td>
			<td>Tiempo de retención al máximo (min)</td>
			<td>Tiempo de retención neto al máximo (min)</td>
			<td>Tiempo medio de retención neta (min)</td>
			<td>SD (%) (tiempo de retención neta)</td>
			<td>SD (min) (tiempo de retención neta)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 20 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>17.368</td>
			<td>11.468</td>
			<td rowspan="3">11.56</td>
			<td rowspan="3">1.02</td>
			<td rowspan="3">0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>17.409</td>
			<td>11.509</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>17.589</td>
			<td>11.689</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 40 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>25.316</td>
			<td>19.416</td>
			<td rowspan="3">19.49</td>
			<td rowspan="3">0.68</td>
			<td rowspan="3">0.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>25.32</td>
			<td>19.42</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.548</td>
			<td>19.648</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 80 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>42.095</td>
			<td>36.195</td>
			<td rowspan="3">36.29</td>
			<td rowspan="3">0.23</td>
			<td rowspan="3">0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>42.219</td>
			<td>36.319</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>42.257</td>
			<td>36.357</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 100 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>50.975</td>
			<td>45.075</td>
			<td rowspan="3">45.06</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50.924</td>
			<td>45.024</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50.986</td>
			<td>45.086</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 5: Tiempos de retención de los estándares de calibración AuNP en el máximo máximo uv-vis respectivo derivado de los fractogramas AF4-UV-vis respectivos utilizando el método descrito en la Tabla 3.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Aliquote</td>
			<td>Ejecutar</td>
			<td>Máximo de tiempo de retención (min)</td>
			<td>Tiempo medio de retención al máximo (min)</td>
			<td>Tiempo de retención neto al máximo (min)</td>
			<td>SD (%) tiempo de retención</td>
			<td>Radio hidrodinámico (nm)</td>
			<td>Recuperación (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 6: Resumen de los tiempos de retención en el máximo máximo de pico UV-Vis respectivo, el radio hidrodinámico calculado a partir de la calibración de tamaño externo(Figura 2)y la tasa de recuperación de la muestra AuNP desconocida obtenida del análisis AF4-UV-vis.

Este protocolo describe el uso del Fraccionamiento flujo de campo de flujo asimétrico junto con la detección uv-vis para la determinación del tamaño de una muestra de nanopartícula de oro desconocida.

Fraccionamiento flujo de campo de flujo asimétrico para dimensionamiento de nanopartículas de oro en suspensión

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

El uso del fraccionamiento asimétrico de flujo de campo en combinación con la calibración de tamaño externo es una herramienta poderosa para determinar con precisión la distribución de tamaño de las nanopartículas de oro en suspensión. AF4 cubre toda la gama de tamaños, desde uno hasta 1000 nanómetros. Es independiente de la composición de la muestra de los constituyentes de la muestra y se puede aplicar incluso a muestras complejas y poco dispersas.La belleza de AF4 es su amplio rango de aplicación, que abarca no solo nanopartículas de diferentes naturalezas y tamaños, sino que también incluye proteínas, virus o macromoléculas sintéticas o naturales. Comience por vórtice 50 miligramos por litro de un estándar arbitrario de nanopartículas de oro durante dos minutos antes de diluir el estándar en una proporción de uno a cuatro con agua ultrapura. A continuación, agite la solución diluida durante dos minutos más para obtener una suspensión homogeneizada.Después de limpiar el sistema, abra el cartucho AF4 para permitir el reemplazo de la membrana AF4. Enjuague la nueva membrana con UPW y vuelva a montar el cartucho. A continuación, vuelva a conectar el cartucho al sistema AF4-UV-vis.Enjuague el sistema AF4-UV-vis limpio con eluyente filtrado y desgasificado durante al menos 30 minutos aplicando un caudal de punta de un mililitro por minuto, un caudal de enfoque de un mililitro por minuto y un caudal cruzado de 1,5 mililitros por minuto, para equilibrar la membrana, estabilizar el sistema y comprobar si hay posibles fugas. La presión del sistema debe alcanzar un nivel constante entre cuatro y 12 bar. Para calificar el sistema AF4-UV-vis determinando la recuperación de masa y la variación del tiempo de retención utilizando un estándar arbitrario de tamaño de nanopartícula de oro, realice una ejecución de inyección directa sin la aplicación de una fuerza de separación.A continuación, realice una ejecución de fraccionamiento con la aplicación de una fuerza de separación. Para preparar patrones de tamaño de nanopartículas de oro para el vórtice de calibración de tamaño externo, todos los estándares de tamaño de nanopartículas de oro de 50 miligramos por litro durante dos minutos y diluir cada muestra respectiva para su análisis en agua ultrapura en una proporción de uno a cuatro. Cuando se hayan preparado los estándares de tamaño, en la pestaña Método FFF, establezca el caudal del detector en 500 microlitros por minuto, el caudal de inyección en 500 microlitros por minuto y el tiempo de inyección en 0,1 minutos.Establezca una duración de elución de ocho minutos sin fuerza de separación definida e inyecte 10 microlitros del primer patrón en el sistema. Cuando se hayan medido todos los patrones de tamaño, inyecte 50 microlitros del primer estándar en el sistema. Ajuste el caudal del detector a 500 microlitros por minuto.Establezca el retraso en dos minutos, el caudal de inyección en 200 microlitros por minuto durante cinco minutos y el tiempo de transición en 0,2 minutos. El caudal de enfoque se calculará automáticamente. Ajuste la duración de la elución a 60 minutos y el caudal cruzado a un mililitro por minuto.Este método AF4 utiliza un caudal cruzado constante que es seguido por un decaimiento lineal durante 10 minutos hasta cero microlitros por minuto. Ajuste el paso de enjuague de nueve minutos con un caudal de punta de 500 microlitros por minuto. Cuando se hayan fraccionado todos los patrones de tamaño de nanopartículas de oro, prepare la muestra de nanopartículas de oro desconocidas y realice una medición de inyección directa y fraccionamiento de la muestra de nanopartículas de oro desconocidas como se acaba de demostrar.Para analizar los datos, importe los archivos de datos en el software del sistema. Visualice las mediciones en la pestaña de resumen y seleccione la señal del detector UV-vis de la lista de detectores. Defina una región de interés y una línea de base para cada medición, ajustando la señal y la vista de la línea de base según sea necesario.Utilice la caja de herramientas de procesamiento de señales para suavizar las señales ruidosas y utilice la función de asignación de parámetros de procesamiento a otras ejecuciones para permitir que los parámetros se asignen a otras mediciones. Para realizar un cálculo de recuperación de masa, abra las mediciones de inyección directa y los datos de fraccionamiento. Inserte una calibración de inyección directa y seleccione las mediciones de inyección directa respectivas en la vista de ajustes de calibración de inyección directa.El volumen de inyección y la concentración de la muestra se utilizarán para correlacionar el área del pico con la cantidad inyectada. A continuación, utilice la función de asignación a los ajustes preestablecidos de partículas seleccionadas para asignar la función de calibración obtenida a las mediciones de fraccionamiento respectivas. A continuación, utilice la ecuación para calcular la recuperación de masa de la nanopartícula de oro comparando el área bajo los respectivos picos de UV-vis de las mediciones de fraccionamiento e inyección directa.Para visualizar los resultados, abra la determinación cuantitativa de resultados. Se presentará una concentración de masa basada en el área del pico. La recuperación de masa se puede obtener comparando este valor con la concentración inyectada.En la pestaña Tamaño de partícula en la ventana de calibración del tamaño de partícula, haga clic en cada medición apropiada en la tabla Seleccionar referencias para calibración para seleccionar todas las ejecuciones de calibración. Las medidas se mostrarán en una tabla a medida que se seleccionen. Introduzca el radio hidrodinámico para todas las mediciones de calibración.La función y la ecuación se mostrarán en la ventana de la función de calibración del tamaño de partícula. Para asignar la función de calibración a las mediciones de la muestra de nanopartículas de oro desconocidas, seleccione los fraccionamientos respectivos dentro de la lista de selección de ejecuciones para asignación y abra un cálculo de distribución de tamaño de partícula para mostrar los resultados. El tamaño calculado se mostrará en la ventana de distribución de tamaños, etiquetado como el máximo máximo.Y la calibración del tamaño de partícula creada anteriormente se enumerará como la calibración para las mediciones de muestras de nanopartículas de oro desconocidas. Para promediar todas las mediciones de una muestra, seleccione la casilla de verificación Señales promedio para muestra. El resultado se mostrará en la etiqueta de máximo máximo.Aquí, se muestra una superposición representativa de patrones de tamaño de nanopartículas de oro fraccionados por AF4 y detectados por espectroscopia UV-vis de la absorbancia de las partículas a una longitud de onda de 532 nanómetros. La desviación estándar relativa de todos los tiempos de retención de cada nanopartícula en su respectivo pico máximo de espectroscopia UV-vis obtenido a partir de mediciones por triplicado fue inferior al 1,1%Un análisis de regresión lineal de estos datos dio como resultado una función de calibración lineal con un coeficiente de correlación al cuadrado, R cuadrado, de 0,9958. Cuando se obtuvieron nueve fractogramas de espectroscopia AF4-UV-vis a partir de muestras de nanopartículas de oro desconocidas, la desviación estándar relativa de los respectivos tiempos de retención fue significativamente baja, oscilando entre el 0,1 y el 0,5% Utilizando la función de calibración del tamaño de partícula obtenida del fraccionamiento de los estándares de tamaño de nanopartículas de oro y correlacionando estos datos con los tiempos de retención obtenidos de la muestra de nanopartículas de oro desconocidas en el máximo máximo de la espectroscopia UV-vis, Podría calcularse un radio hidrodinámico medio general.Además, se pudo obtener una recuperación de masa razonable que indica que no hay aglomeración o disolución significativa de las muestras de nanopartículas de oro ni una adsorción considerable de las partículas en la superficie de la membrana. Cuando se utiliza una calibración de tamaño externa y un análisis de AF4, es de suma importancia que el mismo método de AF4 se aplique de forma coherente a todos los patrones de tamaño y a la propia muestra. AF4 permite a los investigadores comprender mejor las propiedades de sus muestras de nanopartículas.Por lo tanto, es una importante herramienta de control de calidad que, en última instancia, ayuda a mejorar la eficacia de los productos nanohabilitados.

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