הכנת פיגומים בכליות Decellularized בחולדות

פרוטוקול זה מאפשר לפתח פיגומים וסקולריים באמצעות כליות במודל חולדה. הכליה היא האיבר המתאים ביותר לפיגומים של תאי גזע מובחנים. זהו פרוטוקול מוצלח מאוד עבור decellularization של הכליה.

זה מסיר ביעילות את הגרעינים עם הרס מינימלי של מבנה אולטרה ECM. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על רפואת השתלה והנדסת רקמות. הדגמת ההליך יהיה קים ג'ו היונג, MD / PhD פרופסור לכירורגיה פלסטית מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל, הניחו את עכברוש ספראג דולי בן השמונה שבועות על כרית חימום, והניחו בדיקת מדחום רקטלי בפי הטבעת כדי לפקח על טמפרטורת הליבה. לאחר הרדמה החולדה, מניחים אותה בתנוחה על-חושית, ומאבטחים את ארבעת הגפיים לשולחן עם סרט הדבקה. לגלח ולנקות את הבטן עם סבון germicidal.

החל 2%Betadine במשך דקה עד שתי דקות לפחות, ולאחר מכן לנגב אותו עם פתרון 70%אתנול. חזור על רצף זה שלוש פעמים. כסה את השדה האופרטיבי עם וילון סטרילי ופנסטי.

בצע חתך אנכי בבטן, ולחשוף את הכליה השמאלית, שופך, בטן כאבי העורקים, ו vena קאווה נחות. לנתח את הרקמה ממש לפני חיתוך הפדיקל. הכן 50 מיליליטר של פתרון זלוף לכל חולדה על ידי ערבוב PBS עם כ 10 יחידות לכל הפרין מיליליטר.

ערבב כמויות שוות של 8%PFA עם PBS כדי להפוך את פתרון 4%PFA. להאריך את החתך הבטן אנכית גולגולתית, הקפד למשוך את המספריים מן האיברים בעת חיתוך, כדי למנוע נזק. המשך את החתך דרך כלוב הצלעות, ולאחר מכן לחתוך דרך הסרעפת על ידי הרמת עצם החזה.

לסגת דש רופף של העור מהדרך עם מהדק אליס, ולשחרר את הלב על ידי קריעת כל רקמת חיבור עם מלקחיים. פתח את קו PBS, ולהבטיח כי הוא זורם לפני הנחת המחט לתוך החדר השמאלי. החזק את הלב בעדינות עם מלקחיים קהים, ולהשתמש hemostat כדי לשלוט על המחט.

יש להכניס את המחט לא יותר מרבע אינץ'. תוך תמיכה בלב עם המחט והמוסטט, לאתר את האטריום הנכון, ולצלוח דרכו עם מספריים iridectomy. הניחו את ההמוסטט על גופו של החולדה, וודאו שהמחט עדיין ממוקמת בתוך הלב.

המשך perfusing PBS במשך ארבע דקות או יותר אם יש עדיין דם גלוי בכליות ובכבד. לקצור את הכליה השמאלית עם כאבי העורקים הבטן ורידים נחותים. ליגייט השופרן, פי העורקים החזה, vena קאווה מעולה, וענפים שלאבי העורקים הבטן.

שמור על האיבר hydrated ב DPBS בצלחת פטרי 10 ס"מ. ניתן ללטף אתאבי הבטן ואת הווריד הנבוב הנחות עם קטטר 23-מד. כדי להסיר שאריות דם, לחבר את הצינורית עם משאבה peristaltic, ולשטוף את האיבר עם 500 מיליליטר של DPBS ו 16 יחידות לכל הפרין מיליליטר במשך 90 דקות בחמישה סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס.

כדי decellularize הכליה, לחלחל אותו עם 1%טריטון X-100 במשך שלוש שעות ולאחר מכן עם 0.75% פתרון SDS במשך שש שעות בלחץ מתמיד של 40 מיליליטר של כספית. כדי להסיר SDS שיורית, לחלחל המדגם עם 1%פניצילין במים מזוקקים במשך 18 שעות ולאחר מכן עם DPBS סטרילי 16 יחידות לכל הפרין מיליליטר במשך 90 דקות. המורפולוגיה הגסה של כליות חולדה הייתה אדומה כהה.

לאחר דקלולריזציה, הכליה הפכה חיוורת ושקוף. שאריות DNA גנומי היה לכמת פיגומים כליות decellularized לעומת זה בכליות יליד, המאשר כי DNA גנומי רקמה כמעט בוטלה לאחר decellularization. מ-14 מקרים, תכולת הדנ"א הממוצעת הייתה 115.05 ננוגרם למיקרוליטר לבקרה ו-1.96 ננוגרם למיקרוליטר לפיגום decellularized.

בסך הכל, 98.3% מהדנ"א הוסר. המבנה התלת מימדי נשמר, וגלומרולי תאי השתמר בפרנצ'ימה הקורטיקלית. בעת החדרת המחט לתוך החדר השמאלי, זה צריך להיות מוכנס לא יותר מרבע אינץ '.

כל הכנסה נוספת עלולה לצאת מהצד השני. יש לנו ביטחון כי טכניקה זו תפתח פרוספקט חדש בתחום הנדסת רקמות.