Name: 예방 접종 된 마우스에서 항원 특정 CD8 T 세포의 세포 주기 분석을위한 DNA / Ki67 기반 유동 세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 배우세요 예방 접종된 마우스에서 항원 특이 CD8 T 세포의 세포 주기를 분석하는 DNA/Ki67 기반 유동 세포 분석법을. 이 기법은 면역 반응 동역학 연구에 활용됩니다.

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<ol><li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8%2B+T+cells+to+sites+of+CD4%2B+T+cell-dendritic+cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440 (7086), 890-895 (2006).</li>
<li>Zhang, N., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%28%2B%29+T+cells%3A+foot+soldiers+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.</a> Immunity. 35 (2), 161-168 (2011).</li>
<li>Bajénoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highways%2C+byways+and+breadcrumbs%3A+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunology%22%5BJournal%5D)">Highways, byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunology. 28 (8), 346-352 (2007).</li>
<li>Bevan, M. J., Fink, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD8+response+on+autopilot%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The CD8 response on autopilot.</a> Nature Immunology. 2 (5), 381-382 (2001).</li>
<li>Van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+CTLs+require+a+single+brief+period+of+antigenic+stimulation+for+clonal+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Naïve CTLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation.</a> Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).</li>
<li>Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+and+memory+T-cell+differentiation%3A+implications+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development.</a> Nature Review Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).</li>
<li>Beverley, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer%3A+making+sense+of+T-cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clinical+Practice+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Primer: making sense of T-cell memory.</a> Nature Clinical Practice Rheumatology. 4 (1), 43-49 (2008).</li>
<li>Parretta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+cell+division+maintaining+cytotoxic+memory+occurs+predominantly+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD8 cell division maintaining cytotoxic memory occurs predominantly in the bone marrow.</a> Journal of Immunology. 174 (12), 7654-7664 (2005).</li>
<li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+memory+T+cells+in+the+bone+marrow%3A+survival+or+homeostatic+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of memory T cells in the bone marrow: survival or homeostatic proliferation.</a> Nature Review Immunology. 16 (4), 271(2016).</li>
<li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+niches+in+the+bone+marrow%3A+a+hypothesis+on+life-long+T+cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Two niches in the bone marrow: a hypothesis on life-long T cell memory.</a> Trends in Immunology. 37 (8), 503-512 (2016).</li>
<li>Di Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commentary%3A+Memory+CD8%28%2B%29+T+cells+colocalize+with+IL-7%28%2B%29+stromal+cells+in+bone+marrow+and+rest+in+terms+of+proliferation+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Commentary: Memory CD8(+) T cells colocalize with IL-7(+) stromal cells in bone marrow and rest in terms of proliferation and transcription.</a> Frontiers in Immunology. 7, 102(2016).</li>
<li>Simonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+CD8+T+cells+in+cell+cycle+circulate+in+the+blood+after+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific CD8 T cells in cell cycle circulate in the blood after vaccination.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 89 (2), 12735(2019).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Myc+controls+the+balance+between+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genes & Development. 18 (22), 2747-2763 (2004).</li>
<li>Hirche, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+virus+infections+differentially+modulate+cell+cycle+state+and+functionality+of+long-term+hematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Report%22%5BJournal%5D)">Systemic virus infections differentially modulate cell cycle state and functionality of long-term hematopoietic stem cells in vivo.</a> Cell Report. 19 (11), 2345-2356 (2017).</li>
<li>Colloca, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+vectors+derived+from+a+large+collection+of+simian+adenoviruses+induce+potent+cellular+immunity+across+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccine vectors derived from a large collection of simian adenoviruses induce potent cellular immunity across multiple species.</a> Science Translational Medicine. 4 (115), (2012).</li>
<li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+gene+swapping+facilitates+recombinant+Modified+Vaccinia+Virus+Ankara+production+by+host-range+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection.</a> Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).</li>
<li>Di Lullo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+marker+gene+swapping+and+fluorescence-activated+cell+sorting+improves+the+efficiency+of+recombinant+modified+vaccinia+virus+Ankara+vaccine+production+for+human+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">The combination of marker gene swapping and fluorescence-activated cell sorting improves the efficiency of recombinant modified vaccinia virus Ankara vaccine production for human use.</a> Journal of Virological Methods. 163 (2), 195-204 (2010).</li>
<li>Mouse phenotype. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i">https://www.mousephenotype.org/data/secondaryproject/3i</a> (2020).</li>
<li>Yoon, H., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+cycle+time+of+CD8%2B+T+cells+responding+in+vivo+is+controlled+by+the+type+of+antigenic+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The cell cycle time of CD8+ T cells responding in vivo is controlled by the type of antigenic stimulus.</a> PLoS One. 5 (11), 15423(2010).</li>
<li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li>
<li>Vignon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantification+of+all+phases+of+the+cell+cycle+and+apoptosis+in+a+two-color+fluorescence+plot%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantification of all phases of the cell cycle and apoptosis in a two-color fluorescence plot.</a> PLoS One. 8 (7), 68425(2013).</li>
</ol>

A. Folgori와 S. Capone은 Reithera Srl. A. 니코시아의 직원으로 특허 출원 WO 2005071093 (A3) "침팬지 아데노바이러스 백신 캐리어"에 발명가로 임명되었습니다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.

T 세포 복제 확장집중적으로 연구되었지만, 일부 측면은 알 수없는 상태로 남아 있습니다. 이러한 관점에서, 우리는 마우스 모형에 있는 백신 주사 후에 초기에 항원 특정 CD8 T 세포의 세포 주기를 분석하기 위하여 고과민성 유동 세포 측정 방법을 설치했습니다. 상기 프로토콜은 이전에 마우스13,14에서BM 조혈 세포의 세포 주기를 분석하기 위해 사용된 Ki67 및 DNA 염색의 조합을 기반으로 한다. 항원 특이적 CD8 T 세포에 프로토콜을 적용하기 위해 DNA 염료 의 선택, 다른 샘플에 걸쳐 유사한 DNA 염색을 얻기 위한 적절한 조건, 데이터 분석을 위한 게이팅 전략을 포함하여 몇 가지 중요한 문제를 고려해야 했습니다.
많은 염료는 프로피듐 이오디드와 7-아미노락티노마이신 D를 포함하여 DNA 염색에 사용할 수 있습니다. 우리는 Ki67 염색에 필요한 멤브레인 염색 및 가벼운 고정 / 투과화 프로토콜과 호환되었기 때문에 Hoechst를 선택했습니다. 동시에, Hoechst를 염색하면 우수한 품질의 DNA 히스토그램을 얻을 수 있었으며, 즉 G0/G1 및 G2/MDNA 피크는 일반적으로 다른 DNA 염료로 얻은 DNA 피크보다 훨씬 낮은 계수(CV)를 가졌다( DRAQ519). 실제로, Hoechst는 살아있는 세포20에서도DNA를 얼룩지게 할 수 있습니다.
일부 전략은 동일한 실험의 다른 샘플에서 Hoechst 강도의 변동을 피하기 위해 사용되었다. Hoechst 염색은 시간 동안 염료 강도의 감소를 최소화하기 위해 유동 세포계에서 시료 수집 직전에 수행되었다. 수많은 샘플과 큰 실험에서 프로토콜을 재현하는 데 관심이있는 사람들을 위해 한 번에 몇 가지 샘플에 Hoechst 염색을 수행하는 것이 좋습니다. 또 다른 단점은 Hoechst 강도가 염료를 가진 잠복기 도중 세포 수에 의해 무겁게 영향을 받을 수 있다는 것입니다. 이러한 이유로, 우리는 강력하게 DNA 염색을위한 샘플 당 세포의 동일한 수와 동일한 볼륨을 사용하는 것이 좋습니다. 유동 세포계에서 획득하기 위해 많은 수의 세포가 필요한 경우, 두 개 이상의 동일한 샘플을 준비하고 Hoechst 염색 단계 직전에 병합하는 것이 좋습니다.
프로토콜의 핵심은 데이터 분석을 위한 게이팅 전략입니다. 최근에는 면역 반응 초기에 T 세포 분석을 위한 새로운 전략을 발표하여 항원 특이적 T세포(12)의검출 민감도를 높일 수 있게 되었다. 이 전략을 다음과 같이 여기에 표시된 데이터에 적용했습니다. 첫째, 우리는 DNA-A/W 플롯에서 세포 응집체를 제외했습니다. 둘째, 죽은 세포를 게이팅 한 후, 우리는 FSC / SSC 플롯 ("편안한 게이트")에서 상당히 큰 림프구 게이트를 사용했습니다. 이 전략에 의해, 우리는 이러한 세포가 높은 FSC-A 및 SSC-A를 가지고 있기 때문에, 일반적으로 현재 게이팅 전략에 의해 놓친 S-G2/M에 고도로 활성화 된 항원 특이CD8 T 세포를 포함 할 수 있었다. 요약하자면, 데이터 분석은 항원 특이적 T 세포의 활성/증식의 민감한 검출을 얻는 데 필수적인 방법의 중요한 부분을 나타낸다.
이 방법은 면역 반응의 초기 단계에서 중요한 T 세포 데이터를 누락할 가능성을 방지하고 T 세포 면역 모니터링을 위한 새로운 관점을 엽니다. 향후 개선은 G2와 M21사이의 분화를 허용하는 인히스톤 3에 대한 염색을 포함할 수 있다. 현재 한계는 세포가 핵 마커, Ki67에 대한 얼룩을 위해 고정되고 투과화되어야 한다는 것입니다. 따라서 셀은 정렬 및 후속 기능 분석과 같은 다른 유형의 분석에 사용할 수 없습니다. 더욱이, Hoechst를 포함하여 DNA 염료는 일반적으로 게놈 DNA 분석을 방해하고 평가의 이 모형을 위해 적합하지 않습니다. 다른 세포 주기 단계와 상관 관계가 있고 살아있는 세포에 얼룩질 수 있는 막 마커의 확인은 이 한계를 극복할 수 있었습니다. 결론적으로, 이 방법은 예방 접종, 감염, 면역 매개 질환 및 면역 요법과 같은 여러 맥락에서 T 세포를 활성화/증식하는 평가를 위한 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were updated.
The authors section was updated from:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome “Sapienza”, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
* These authors contributed equally
To:
Sonia Simonetti*1,2, Ambra Natalini*1,2, Giovanna Peruzzi3, Alfredo Nicosia4, Antonella Folgori5, Stefania Capone5, Angela Santoni2,6, Francesca Di Rosa1 
1Institute of Molecular Biology and Pathology, National Research Council of Italy (CNR), 
2Department of Molecular Medicine, University of Rome “Sapienza”, 
3Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, 
4Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 
5Reithera Srl 
6IRCCS, Neuromed 
* These authors contributed equally
Figure 1 was updated from:
<img alt="Lymph node, spleen, bone marrow flow cytometry workflow; staining, fixation, data analysis diagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
To:
<img alt="Flow cytometry process diagram; lymph node and bone marrow cell staining, Ki67, DNA with Hoechst 33342." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: Scheme of the protocol for cell cycle analysis of antigen-specific CD8 T cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Authors section and a figure were&#160;updated.

Erratum: A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol, Representative Results, and Discussion sections have been&#160;updated.
Step 9.5 of the Protocol was updated from:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window.
to:
Double click on the fully stained sample in the group to open the graph window and display the ungated events in a dot plot. Note that the x-and y-axis are labelled as in the fcs files, according to the Flow Cytometer settings (Table 2).
Step 9.6 of the Protocol was updated from:
Display the total events acquired for this sample in a dot plot with DNA-A on the x axis and DNA-W on the y-axis.
to:
Check that a sufficient number of ungated events is displayed for appropriate visualization. If necessary, open Preferences by clicking on the &#8220;heart&#8221; icon in the Workspace ribbon, select Graphs, then Dot Plot as graph type, and indicate the number of dots drawn in the corresponding box. Display ungated events in the graph window as a dot plot with DNA-A on the x-axis and DNA-W on the y-axis. Use linear scale for both axes. If necessary, change scale from logarithmic to linear by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis in the graph window.
Step 9.12 of the Protocol was updated from:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis.
to:
Double click in the center of the &#34;relaxed&#34; gate to display the cells in a dot plot with CD3 on the x-axis and CD8 on the y-axis. Use appropriate axis scale for visualization in the graph window. If necessary, modify x- and/or y-scale by clicking on the box indicated with a &#8220;T&#8221; (Transform Data Display) close to each axis, choose Customize axis function, and modify Extra Neg. decades, Width basis and Positive decades, as necessary.
Step 9.19 of the Protocol was updated from:
Repeat step 9.5 to 9.18 for the &#34;b-LN group.
to:
Copy the entire gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#34;b-spleen&#8221; group. Copy the first 3 gates of the gating strategy from the &#8220;a-LN&#8221; to the &#8220;c-BM&#8221; group (Figure 2A).
The fourth paragraph of the Representative Results was&#160;updated from:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The overlay of gag-specific CD8 T cells onto total CD8 T cells in the FSC-A / SSC-A plot showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gating to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
to:
Notably, the protocol allowed us to have an extremely low background in the antigen-specific CD8 T cell gate of LNs and spleen&#160;of untreated mice (usually 0.00% and at maximum 0.02%). The&#160;comparison of gag-specific and not gag-specific FSC-A / SSC-A plots&#160;showed that the gag-specific cells had high SSC-A and FSC-A (Figure 3D), confirming the need to use a &#34;relaxed&#34; FSC-A/ SSC-A gate&#160;to capture these cells. We then evaluated the percentages of gag-specific CD8 T cells in different cell cycle phases (Figure 4A). We found that gag-specific CD8 T cells in the spleen and even more in the draining LNs contained a high proportion of cells in S-G2/M phases at day 3 post-boost (18.60% and 33.52%, respectively)
The fourth paragraph of the Discussion was&#160;updated from:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.
to:
A key point of the protocol is the gating strategy for data analysis. We recently published a novel strategy for T cell analysis at early times of the immune response, which allowed us to increase the sensitivity of detection of antigen-specific T cells12. We applied this strategy to the data shown here as follows. First, we excluded cell aggregates in the DNA-A/W plot. Second, after gating out dead cells, we used a fairly large lymphocyte gate in the FSC/SSC plot (&#34;relaxed gate&#34;). Then, we gated on CD8 T cells, and on antigen-specific cells among them. We analyzed cell cycle by evaluating the DNA/ Ki67 staining profile of the antigen-specific CD8 T cells. By this strategy, we were able to include highly activated antigen-specific CD8 T cells in S-G2/M that are usually missed by current gating strategies, as these cells have high FSC-A and SSC-A. In summary, the data analysis represents a critical part of the method, which is essential to obtain a sensitive detection of activated /proliferating antigen-specific T cells.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61867">A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice</a>. The Protocol,&#160;Representative Results, and Discussion&#160;sections have been&#160;updated.

Naïve T 세포는 항원 프라이밍시 클로날 팽창 및 분화를 겪습니다. 분화 된 T 세포는 항원 클리어런스와 항원 특이적 기억유지에 필수적인 이펙터 기능을 표시하며, 이는 오래 지속되는 보호의 핵심입니다. 1차 반응의 첫 번째 단계 동안, 림프구내 의 전문 틈새 시장 내의 항원 제시 세포(APC)와의 순진한 T 세포 상호 작용은 클론 팽창 단계1,2,3을특징으로 하는 거대한 T 세포 증식을 유도하는 데 중요하다. T 세포-APC 상호작용은 T 세포 클론 자손4,5,6,7의양과 질에 영향을 미치는 항원, 공동 자극 신호 및 수용성 인자(사이토카인 및 케모키네)의 농도 및 지속성에 의해 미세하게 조절된다.
T 세포 클론 확장의 집중적인 연구에도 불구하고 항원 프라이밍 T 세포가 항원 인식 부위에서 전체 세포 주기를 완료했는지 또는 세포 주기 진행 중에 다른 장기로 마이그레이션하는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다. 지식의 이 부족은 세포 주기 분석에 사용할 수 있는 공구의 속성 때문입니다. 여기에는 핵 마커, Ki67 및 세포 염료에 특이적 단일 클론 항체(mAbs)가 포함되며, 세포 주기의 S-phase를 겪은 세포를 식별하거나 딸 세포와 그 조상들 사이에서 차별(예: 카박스시플루오레신 succinimidyl(ESTERSE).
그러나, CFSE 및 BrdU와 같은 세포 라벨링 염료는, 특정 기관에서 발견된 세포가 로컬로 증식되었는지 또는 오히려 분할후이 사이트로 마이그레이션되었는지 여부에 대한 결정을 허용하지 않는다8,9. 더욱이, 핵 내 단백질인 Ki67은 G 0(Ki67-음성 세포)의 세포와 다른 세포 주기 단계(Ki67 양성 세포)의 세포만 구별할 수 있다. 따라서, Ki67 분석은 활성 증식(즉, S, G2또는 M)에서 세포를G1의세포와 구별하지 않으며, 이는 G1에서 장기간 분할 또는 체류또는10,11로되돌아갈 수 있다.
여기서, 예방접종된 마우스의 비장 및 림프절(LNs)으로부터 항원 특이적 CD8 T 세포의 세포 주기 분석을 위한 새로운 유동 세포측정 방법을 설명한다(도1). 상기 방법은 이전에 마우스골수(BM) 조혈세포의 세포주기를 분석하기 위해 사용하였던 Ki67 및 DNA 염색의 조합을이도(13,14)이다. 여기서는 최근 발표된 혁신적인 게이팅전략(12)과함께 KI67 플러스 DNA 염색을 CD8 T 세포 클론 확장 의 분석에 성공적으로 적용했습니다. G0,G1,S-G2/M상에서 백신 접종 된 마우스의 비장 및 배수 LN에서 항원 특이적 CD8 T 세포를 명확하게 구별 할 수 있었습니다.

<table><tbody><tr><td>1-200 &뮤; L 유니버설 핏 벌크 팩 피펫 팁</td><td>Corning&nbsp;</td><td>CLS4866-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>2.4G2 안티-F&감마; R mAb&nbsp;</td><td>BD</td><td>553141</td><td>10 &mu; g/ml 최종 농도</td></tr><tr><td>5ml 주사기 플런저</td><td>BD 에메랄드&nbsp;</td><td></td><td></td>307733</tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>MercK Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBHA025SB 60mm TC 처리 된 세포 배양 접시</td><td>팔콘</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M 세포 스트레이너&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 클리어 라운드 바텀 TC-treated Culture Microplate</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353077</tr><tr><td>안티-랫/햄스터 Ig,k/음성 제어 보상 입자</td><td>BD- 바이오사이언</td>스 <td>552845</td><td></td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올&nbsp; &nbsp;</td><td>시그마</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>소 세럼 알부민</td><td>시그마</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>BUV805 랫 안티-마우스 CD8a&nbsp;</td><td>BD- 생명 과학</td><td>564920</td><td>4 &mu; g/ml 최종 농도</td></tr><tr><td>Dulbecco's 인산염 완충액 칼슘 없음 마그네슘 없음&nbsp;</td><td>유로클론</td><td>ECB4004L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120159</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>34852-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐염 용액(EDTA)&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Corning</td><td>35-079-CV</td><td></td></tr><tr><td>Filcon, 멸균, 주사기형 70 &mu; m</td><td>팔콘&nbsp;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>정착성 생존도 염료 eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>1:1000 최종 농도</td></tr><tr><td>Foxp3 / 전사 인자 염색 완충액 세트</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>이 세트에는 고정/투과화 농축액 및 희석액, 투과화 완충액 10x</td></tr><tr><td>H-2k(d) AMQMLKETI 알로피코시아닌(APC) 표지 테트라머</td>가 포함되어 <td>있습니다. NIH Tetramer Core Facility에서 제공</td><td></td><td>6 &뮤; g/ml 최종 농도</td></tr><tr><td>H-2k(d) AMQMLKETI 피코에리트린(PE) 표지 펜타머</td><td>프로이뮨&nbsp;</td><td>F176-2A-E - 176</td><td>10 & L / 샘플&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 물 내 10 mg/mL 용액</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 단클론 항체 (SolA15), FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5698-82</td><td>5 &mu; g/ml 최종 농도</td></tr><tr><td>L-글루타민 100X (200 mM)</td><td>유로클론</td><td>ECB3000D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HA 필터 0,45 &마이크로; m</td><td>BD</td><td>340606</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 100X</td><td>유로클론</td><td>ECB3001D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 안티-마우스 CD62L 항체</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>104418</td><td>0.2 & g/ml 최종 농도</td></tr><tr><td>PerCP-Cy&trade; 5.5 햄스터 안티-마우스 CD3e&nbsp;</td><td>BD- 생명과학</td><td>551163</td><td>4.4 &mu; g/ml 최종 농도</td></tr><tr><td>적혈구 용해 버퍼</td><td>시그마</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>라운드-바텀 폴리스티렌 튜브, 5 mL</td><td>팔콘&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>352058 RPMI 1640 미디엄 L-글루타민 및 페놀 레드</td><td>유로클론</td><td>ECB9006L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석 데이터 분석을 위한 소프트웨어 패키지</td><td>FlowJo</td><td>v.10</td><td></td></tr><tr><td>유세포분석기에서 시료 수집을 위한 소프트웨어</td><td>BD FACSDiva&nbsp;</td><td>v 6.2</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루 솔루션</td><td>유로클론</td><td>ECM0990D</td><td></td></tr></tbody></table>

예방 접종 된 마우스에서 항원 특정 cd8 t 세포의 세포 주기 분석을위한 dna / ki67 기반 유동 세포 분석

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

생체 내항원 특이적 T 세포의 세포 주기는 몇 가지 방법을 사용하여 검사되었으며, 모두 몇 가지 한계를 가지고 있습니다. Bromodeoxyuridine (BrdU)는 S-phase에 있거나 최근에 완료된 세포를 표시하고, 카박스피플루오레세인 succinimidyl ester (CFSE)는 분할 후 딸 세포를 검출합니다. 그러나, 이러한 염료는 분석 시 세포 주기 단계의 식별을 허용하지 않는다. 대안적 접근법은 정지상G0을제외한 세포 주기의 모든 단계에서 세포에 의해 높게 발현되는 마커인 Ki67을 악용하는 것입니다. 불행하게도, Ki67은 이 단계에서 남아 있거나, 사이클링으로진행하거나, G0으로이동할 수 있는 G1의 세포로부터 미토시스에 전념하는 S-phase에서 세포를 분리하지 않기 때문에 추가 분화를 허용하지 않는다.
여기서는 마우스 이차 림프구 기관의 상이한 세포 주기 단계에서 T 세포의 "스냅샷"을 캡처하기 위한 유동 세포 측정 방법을 설명합니다. 이 방법은 Ki67 및 DNA 염색을 주요 조직 적합성 복합체(MHC)-펩타이드 멀티머 염색 및 혁신적인 게이팅 전략과 결합하고,G0,G1, S-G/M 상에서 항원 특이적 CD8 T 세포를 성공적으로 분화할 수 있도록 하는 것은 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-1의 모델 항원 개그를 운반하는 바이러스 벡터를 이용한 백신 접종 후 마우스의 비장 및 배수 림프절의 S-G2/M상에서.1.
이 방법의 중요한 단계는 분석 민감도를 높이고 현재 분석 기준에 의해 누락되었을 고도로 활성화/증식하는 항원 특이적 T 세포를 포함하는 DNA 염료 및 게이팅 전략의 선택이었다. DNA 염료, Hoechst 33342는 막및 세포 내 염색을 보존하면서 G0/G1 및 G2/M DNA 피크의 고품질 차별을 얻을 수 있었습니다. 이 방법은 생체 내에서 T 세포 반응에 대한 지식을 증가시키고 면역 모니터링 분석을 개선할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

도 1에서요약된 프로토콜에 따라 Balb/c 마우스의 비장, LNs 및 BM으로부터세포의 세포 주기 단계는 형광 DNA 염료, Hoechst 및 항 Ki67 mAb를 사용하여 분석하였다. 이러한 염색은 세포 주기의 다음 단계에서 세포의 분화를 허용했다: G0 (Ki67neg, DNAlow로 정의 된 DNA의 2N), G1 (Ki67pos, DNAlow), 및 S-G2/M (Ki67pos, 2N과 4N 사이에 구성 된 DNA 함량, 또는 DN/DN로 정의 된 DNA의 4N).
우리는 먼저 이전에 발표 된 결과13,14를 재현하기 위해 BM 세포의 세포 주기 분석을 수행한 다음 관심있는 세포, 즉 CD8 T 세포를 분석했습니다. 도 2는 BM 세포의 세포 주기 분석의 전형적인 예를나타낸다(도 2A). 이 프로토콜은 G0/G1 및 G2/MDNA 피크의 낮은 계수(CV)를 산출하여 DNA 염색의 우수한 품질을 나타내며(도2B,CV &lt; 2.5를 가진 예를 나타낸다; CV는 항상 모든 실험에서 5&lt;).
그런 다음 예방 접종된 마우스로부터 항원 특이적 CD8 T 세포에 동일한 프로토콜을 적용했습니다. BALB/c 마우스는 HIV-1 개그를 운반하도록 설계된 프라이밍용 채드3 개그와 MVA-gag를 사용하여 HIV-1의 항원 개그에 대한 예방 접종을 받았습니다. 날 (d) 3 포스트 부스트에서, 우리는 비장과 배수 LN에서 개그 특정 CD8 T 세포의 주파수를 분석했다. 우리는 기존의 전략과 는 달리, 고도로 활성화 된 항원 반응 CD8 T 세포(12)를검출하는 데 적합한 면역 반응의 초기 단계에서 T 세포에 대한 새로 정의 된 게이팅 전략을 활용하였다. 우리는 다섯 단계의 새로운 전략을 실행했습니다. 1단계에서는 DNA-A/-W 게이트에 의한 이중 또는 골재를 배제하고, 2단계에서는 죽은 세포 마커 배제에 의해 살아있는 세포를 확인했습니다. 3단계에서는 표준좁은 림프구게이트(12)대신 비통상적 "완화" FSC-A/SSC-A게이트(그림 3A)를사용하여 관심인구를 규명하였다. CD3+CD8+ 셀 (그림 3A의4 단계)에 게이팅 후, 우리는 두 개의 서로 다른 MHC 멀티머, 즉 펜트 개그와 테트개그 (그림 3A의단계 5)를 사용하여 개그 특정 CD8 T 세포를 식별했습니다. 치료되지 않은마우스(도 3B 및 C,단계 5)의 염색 배경을 증가하지 않고, 예방 접종 된 마우스에서 개그 특정 CD8 T 세포 검출의 감도를 향상시키기 위해 하나 대신 두 개의 멀티머를 사용했다. 따라서, 우리는 성공적으로 예방 접종 마우스에서 치료되지 않은 마우스 (0.00 % 및 0.00 % 항원 특이 CD8 T 세포, LNs및 비장에서 각각) 예방 접종 마우스에서 (0.46 % 및 0.29% LNs 및 비장의 항원 특이적 CD8 T 세포, 각각, 도 3B 및 C)를구별하였다.
특히, 이 프로토콜을 통해 우리는 LNs의 항원 특이적 CD8 T 세포 게이트와 치료되지 않은 마우스의 비장(보통 0.00% 및 최대 0.02%)에서 매우 낮은 배경을 가질 수 있었습니다. 개그 특이적 및 개그별 FSC-A/SSC-A 플롯의 비교는 개그 특이적 세포가 높은 SSC-A 및 FSC-A(도3D)를가지고 있음을 보여주었으며, 이러한 세포를 포착하기 위해 "편안한" FSC-A/SSC-A 게이트를 사용할 필요성을 확인하였다. 그런 다음 상이한 세포 주기 상에서 개그 특이적 CD8 T 세포의 백분율을 평가하였다(그림4A). 우리는 비장에서 개그 특정 CD8 T 세포가 배수 LN에서 더 많은 3 사후 부스트 (18.60 %와 33.52 %, 각각)에서 S-G2/ M 단계에서 세포의 높은 비율을 포함하는 것으로 나타났습니다.
더욱이, 우리는 S-G2/M상에서 개그 특이적 CD8 T 세포가 동일한 장기(도4B)로부터총 CD8 T 세포에 오버레이될 때 높은 FSC-A 및 SSC-A를 가졌다는 것을 발견했습니다. 개그 특이적 CD8 T 세포에 의한 CD62L 발현은 LN(도4C)에서G0내의 몇 세포를 제외하고 활성화된 T 세포에 대해 예상대로 낮았다. 모두, 이들 결과는 "이완된" 게이트(도 3A, B 및 C의3단계)가 증식하는 항원 특이적 CD8 T세포(12)를모두 포함하도록 요구되었다는 것을 확인하였다. 프로토콜은 상이한 세포 주기 상에서 세포에 의한 분석 및 CD62L 발현의 분석 시 항원 특이적 CD8 T 세포의 세포 주기 단계의 "스냅샷" 평가를 위해 매우 유용했다.
<img alt="분석을 위한 림프절 및 골수 세포 염색 일정이 포함된 유세포 분석 공정 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 도 1: 항원 특이적 CD8 T 세포의 세포 주기 분석을 위한 프로토콜의 구성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig1v4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
<img alt="유세포 분석 분석; DNA-W 대 DNA-A; Ki67, 세포 주기 단계; 데이터 플롯, 게이팅 전략." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: BM 세포의 세포 주기 분석. 치료되지 않은 Balb/c 마우스에서 BM 세포는 혈류 세포측정에 의해 염색되고 분석되었다. (A) 게이팅 전략의 예. 우리는 DNA-A/-W 플롯(왼쪽)의 단일 세포에 게이트를 두었고, 그 후 죽은 세포 염료 배제(가운데)에 의해 살아있는 세포에 문이 있었습니다. 그런 다음 모든 BM 셀(오른쪽)에 대해 "편안한" FSC-A/SSC-A 게이트가 사용되었습니다. (B) BM 세포의 세포 주기 분석의 예 (왼쪽). 우리는 세포 주기의 다음 단계에서 세포를 식별하기 위해 Ki67및 DNA 염색의 조합을 사용: G0 (아래 왼쪽 사분면, Ki67neg-DNAlow 세포), G1 (상단 왼쪽 사분면, Ki67pos-DNAlow), S-G2/M (오른쪽 상단 사분면, Ki67pos-DNA 중간/높은). 키67 mAb(가운데)와 DNA 히스토그램(오른쪽)의 형광 마이너스 원(FMO) 제어가 도시된다. DNA 히스토그램 플롯에서, 좌우 게이트는 G0/G1 및 G2/MDNA 피크에 각각 대응하며, 숫자는 각 피크의 변이계(CV)를 나타낸다. 다른 모든 플롯에서 숫자는 표시된 게이트의 셀 백분율을 나타냅니다. 그림은 5개 중 1개의 대표적인 실험을 보여줍니다. 각 실험에서, 우리는 3 마우스에서 풀린 BM 세포를 분석했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="CD8 T 세포의 유세포 분석 분석; DNA 게이팅, 림프구 분리, 백신 접종 대 미치료." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: LNs 및 비장으로부터 항원 특이적 CD8 T 세포의 분석. Balb/c 마우스는 Chad3-gag와 근육질(i.m.) 프라이밍되었고 MVA-gag로 i.m를 높였습니다. 3일째에, 예방 접종 및 치료되지 않은 대조군 마우스로부터 LN 및 비장 세포를 배출하는 후 혈류 세포측정에 의해 염색되고 분석하였다. (A) 단일 세포를 식별하는 5단계로 게이팅 전략의 계획(1단계); 라이브 셀 (2 단계); 림프구 (3 단계); CD8 T 셀(4단계); 개그 별 세포(5단계). (B-C) 플롯의 예: (B) LNs 및 (C) 비장의 세포 분석 (상단) 및 예방 접종 (하단) 마우스. 우리는 1 단계에서 DNA-A / -W 플롯에 단 하나 세포를 확인했습니다. 그런 다음, 2단계에서, 우리는 죽은 세포 염료 배제에 의해 살아있는 세포를 선택했습니다. 3단계에서는 림프구에 대해 비정식 "편안한" 게이트를 사용했습니다. 4단계에서는 CD3 및 CD8의 이중 발현으로 CD8 T 셀을 확인했습니다. 그런 다음 5단계에서 개그 별 세포를 식별했으며, 불소크롬 라벨이 부착된 H-2kd-개그 펜타머(펜트 개그)와 H-2kd-개그-테트라머(Tetr-gag)를 각각 묶는 능력에 따라 개그 특이성 세포를 확인했습니다. (D) 상기와 같이 게이팅 후 개그 특이적(파란색)과 개그 특이적(grey) 세포의 FSC-A/SSC-A 프로파일. 숫자는 표시된 게이트의 셀 백분율을 나타냅니다. 그림은 5개 중 1개의 대표적인 실험을 보여줍니다. 각 실험에서, 우리는 3명의 예방 접종마우스및 3개의 처리되지 않은 마우스에게서 풀로 풀린 비장을 분석하고 풀로 한 LN 세포를 분석했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="림프절과 비장의 세포 DNA 함량 및 CD8+ T 세포 증식에 대한 유세포 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 도 4: 항원 특이적 CD8 T 세포의 세포 주기 분석. 마우스는 도 3에서와 같이 예방 접종을 받았고, 개그 특이적 세포의 세포 주기 분석은 도3에서와 같이 5단계로 게이팅 후 3일째 에 수행되었다. (a)예방 접종된 마우스의 LNs(위) 및 비장(bottom)으로부터 개그 특이적 CD8 T 세포의 세포 주기 분석의 예. 세포 주기 단계는 도 2B에서와같이 확인되었다. 패널은 G0,G1,S-G 2/M(왼쪽) 및 형광 마이너스 원(FMO) 제어에서 Ki67 mAb(오른쪽)의 세포를 나타낸다. 숫자는 표시된 게이트의 셀 백분율을 나타냅니다. (B) FSC-A/SSC-A 도트 플롯은 S-G2/M상(빨간색)에서 개그 별 CD8 T 세포를 총 CD3+CD8+ T 세포(회색)에 오버레이하여 백신 접종된 마우스의 LNs(위쪽)와 비장(아래쪽)에서 겹쳐낸다. (C) G 0(녹색)에서 개그 특이적 CD8 T 세포에 의해 CD62L 발현을 나타내는 히스토그램을 상쇄하고, G1(파란색), S-G 2/M(빨간색)에서 LNs(위) 및 백신 접종 된 마우스의 비장(bottom)에서 분리된다. y축은 정규화된 이벤트 수를 나타냅니다. 이 수치는 총 15개의 마우스를 가진 5개의 독립적인 실험 중 1개의 대표적인 예를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/61867fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 재료 : 흐름 세포계 설정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61867/JoVE-DiRosa-FlowCytometer-Configuration_.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

클로날 팽창은 항원 특이적 T 세포 반응의 주요 특징이다. 그러나, 항원 반응 T 세포의 세포 주기는 기술적인 한계 때문에 부분적으로, 제대로 조사되었습니다. 우리는 예방 접종 마우스의 비장 및 림프절에서 복제 확장 항원 특정 CD8 T 세포를 분석하는 유동 세포 측정 방법을 설명합니다.

예방 접종 된 마우스에서 항원 특정 CD8 T 세포의 세포 주기 분석을위한 DNA / Ki67 기반 유동 세포 분석

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

우리의 프로토콜은 마우스 비장과 림프절이 꾸준한 상태 페노티픽 스냅 샷을 제공하는 것보다 T 세포 반응의 역학을 반영하는 데 사용할 수있는 실용적인 접근 방식을 제공합니다. 우리의 기술은 지속적인 반응에 종사하는 항원 특이적 CD8 T 세포를 민감하게 감지합니다. 증식 CD8 T 세포는 생체 내 약물 치료 또는 세포 전달의 혼동 효과 없이 측정된다.우리의 기술은 여러 설정에서 면역 역학의 창을 제공 할 수 있습니다. 예를 들면, 예방 접종 및 감염, 자가 면역 질환 및 암 면역 요법에 대한 반응과 관련하여. 증류수로 10배 의 충류 버퍼를 희석하여 신선한 1배 의 충류 세척 버퍼를 준비하고 0.45 마이크로미터 필터를 통해 걸러하여 골재를 제거합니다.단일 클론 항체 Ki67 FITC를 1배 의 충혈 세척 버퍼로 희석하여 시료당 100 마이크로리터의 최종 부피에 대한 적정 실험으로 결정하였다. 1x 투과성 세척 버퍼3밀리리터를 각 튜브에 세포와 원심분리기를 400G의 400G에 넣고 실온에서 5분간 추가합니다. 상부체를 폐기합니다.다시, 1x 충류 세척 버퍼와 원심분리기를 추가하여 세포를 펠릿합니다. 그런 다음 상체를 폐기하십시오. 희석된 단일 클론 항체 Ki67 FITC 100 마이크로리터를 펠릿에 넣고 소용돌이에 넣고 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.인큐베이션 후, 1배 의 투과화 버퍼 4밀리리터로 세포를 두 번 씻고, 매 세척 후 원심분리를 하고, 상체를 폐기한다. 350마이크로리터의 PBS를 세포 펠릿에 추가하여 시료를 혈중 세포계에서 직접 획득할 수 있고 250마이크로리터의 PBS를 세포 펠릿에 첨가하여 DNA 염색을 위해 Hoechst로 배양할 샘플을 허용합니다. Hoechst 및 PBS 용액을 준비하고 최종 농도가 밀리리터 당 2 마이크로그램되도록 각 샘플에 추가합니다.소용돌이와 어둠 속에서 15 분 동안 샘플을 배양하십시오. 그런 다음 샘플을 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿에 PBS 350 마이크로리터를 추가합니다. 소프트웨어를 열고 작업 영역 리본 섹션에서 그룹 만들기"를 클릭하여 분석할 서로 다른 장기에 해당하는 다른 그룹을 만듭니다.그룹 이름을 두 번 클릭하여 수정된 그룹 창을 열고 동기화된 함수에 체크 표시를 삽입하여 새로 만든 그룹을 동기화합니다. 각 FCS 파일을 해당 그룹으로 드래그한 다음 A-LN 그룹으로 시작하는 게이팅 전략을 만듭니다. 완전히 스테인드된 샘플을 두 번 클릭하여 그래프 창을 열어 점 플롯에 샘플에 대해 획득한 웅여진 이벤트를 표시합니다.x축과 y축은 이 원고의 흐름 사이토미터 설정 파일의 표 2에 표시된 대로 FCS 파일과 같이 레이블이 지정됩니다. 적절한 시각화를 위해 충분한 수의 이벤트가 표시되는지 확인합니다. 필요한 경우 작업 공간 리본의 하트 아이콘을 클릭하여 기본 설정을 열고 그래프 유형으로 그래프 플롯을 선택한 다음 해당 상자에 그려진 점 수가 올바른지 또는 변경합니다.y축의 x축에 DNA-A와 DNA-W가 있는 도트 플롯에 그래프 창에 있는 웅힌 이벤트를 표시합니다. 두 축모두에 선형 축을 사용합니다. 필요한 경우 그래프 창의 각 축에 T가 가깝게 표시된 상자를 클릭하여 logarithmic에서 선형으로 조정합니다.게이팅 도구 섹션의 직사각형을 클릭하여 단일 셀 모집단을 선택한 다음 직사각형 게이트의 중앙을 두 번 클릭하여 x 축에 FSC-A 매개 변수가 있는 도트 플롯에 단일 셀을 표시하고 y축에서 죽은 셀이 죽는다. 다각형을 클릭하여 죽은 세포 다이에 대해 부정적인 살아있는 세포 집단을 선택합니다. 다각형 게이트의 중앙을 두 번 클릭하여 x 축의 FSC-A 매개 변수와 y축의 SSC-A 매개 변수를 사용하여 점 플롯에 셀을 표시합니다.사각형을 클릭하고 해당 그래프에 모든 단일 라이브 셀을 포함하도록 편안한 게이트를 만듭니다. 완화된 게이트 의 중앙을 두 번 클릭하여 x축에 CD3가 있는 점 플롯에 셀을 표시하고 y축의 CD8을 표시합니다. 그래프 창에서 시각화에 적합한 액세스 척도를 사용합니다.필요한 경우 각 축에 T가 가깝게 표시된 상자를 클릭하여 x 및 y 스케일을 수정하고 Access 함수 사용자 지정을 선택하고 필요에 따라 기본 및 긍정적 수십 년 으로 추가 neg 수십 년을 수정합니다. 다각형을 클릭하여 CD3+CD8+셀을 선택합니다. CD3+CD8+게이트 중앙을 두 번 클릭하여 x축의 Tetr-gag와 y축의 펜트 개그와 함께 점 플롯에 셀을 표시합니다.다각형을 클릭하여 항원 특이적 CD8 T 세포를 선택한다. 개그 별 게이트의 중앙을 두 번 클릭하여 x 축에 DNA-A가 있는 점 플롯에 세포를 표시하고 y축의 Ki67을 표시합니다. 그래프 창의 게이팅 도구 섹션에서 Quad"를 클릭하여 다른 세포 주기 단계에서 셀을 선택합니다.한 샘플에서 만든 게이팅 전략을 해당 그룹에 복사하여 그룹의 모든 샘플에 게이트를 적용합니다. 그런 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 b-비장 및 CBM 그룹에 대한 게이팅 전략을 복사합니다. 모든 게이트가 세 그룹의 각 샘플에 적합한지 확인합니다.필요한 경우 그룹을 비동기화하고 원고에 설명된 대로 게이트를 수정합니다. y축에 있는 x축및 Ki67에 DNA-A를 사용하여 점 플롯에 편안한 게이트의 BM 셀을 표시합니다. 작업 공간 리본 섹션에서 레이아웃 편집기"를 클릭하여 결과를 시각화합니다.샘플 창의 게이팅 전략의 각 게이트를 레이아웃 편집기로 드래그하고 게이팅 시퀀스에 따라 플롯을 배치합니다. 필요한 경우 레이아웃의 해당 플롯을 두 번 클릭하고 그래프 정의 창에서 적절한 형식을 선택하여 그래프 유형을 변경합니다. 각 기관에서 항원 별 CD8 T 세포에서 얻은 결과를 시각화하고 다른 샘플을 비교하기 위해 레이아웃 리본의 함수에 의해 반복하고 반복합니다.양수 조절을 나타내는 골수 세포의 결과를 시각화합니다. 골수 세포의 세포 주기 분석의 전형적인 예는 여기에 도시된다. 이 프로토콜은 G0에서 G1및 G2내지 M DNA 피크의 낮은 계수를 산출하여 DNA 염색의 우수한 품질을 나타냅니다.항원 특이적 CD8 세포를 식별하기 위해 5단계 게이팅 전략이 사용되었다. 2개의 멀티머는 치료되지 않은 마우스에 있는 염색 배경을 증가하지 않고 백신 접종마우스에 있는 개그 특정 CD8 T 세포 검출의 감도를 향상시키기 위하여 이용되었습니다. 개그 별 CD8 T 세포는 배수 림프절과 비장에서 3 일째에 S-G2/M 단계에서 세포의 높은 비율을 포함 하 여 부스트.더욱이, S-G2/M 단계에서 개그 특이적 CD8 T 세포는 동일한 장기로부터 총 CD8 T 세포에 오버레이될 때 높은 FSC-A 및 SSC-A를 가졌다. 오프셋 히스토그램은 개그 특정 CD8 T 세포에 의한 CD62L 발현이 림프절에서 G0의 몇 세포를 제외하고 활성화된 T 세포에 대해 예상대로 낮았다는 것을 보여주었다. 이 방법은 T 세포가 멤브레인 및 Ki67 염색과 함께 DNA 염색의 우수한 품질을 달성하기 위해 설계되었습니다.유동 세포측정 데이터 분석이 핵심 포인트입니다. 게이트 포지셔닝에 적절한 제어를 사용해야 합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 마우스와 인간 말초 혈액에 있는 세포 주기의 S-G2/M 단계에서 T 세포를 발견했습니다.이 기술은 타입-1 당뇨병, 전염하는 단핵구증 및 COVID-19에 있는 면역 감시 연구 결과에서 유용했습니다.

a-dnaki67-based-flow-cytometry-assay-for-cell-cycle-analysis-antigen

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 총뿐만 아니라 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 CD4 +와 CD8 + T 세포, HIV / AIDS 백신 연구를위한 이상적인 모델의 메모리 하위 집합에 대한 자세한 phenotypic와 기능 특성에 대한 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 유틸리티를 보여줍니다.

붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

이 비디오에서는 말초 혈액 단핵 세포 배양에서 확장된 사이토카인 유도 킬러 T 세포, CIK 세포의 비율을 결정하기 위한 유세포 분석 기반 기술을 보여줍니다.

유세포 분석법을 통한 인간 사이토카인 유도 킬러 세포의 CD 마커 인식

이 동영상은 다양한 세포주기 단계에서 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분석하는 분석을 보여줍니다. 형광 표지된 생존 세포는 유세포 분석을 사용하여 선택되며, 세포 증식 관련 핵 단백질 및 핵산 염색에 대한 항체를 사용하여 서로 다른 세포 주기 단계에 있는 세포를 DNA 함량으로 식별합니다.

항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포주기 분석을 위한 분석

이 비디오는 in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte 또는 CTL 생산을 모니터링하는 면역학적 방법을 보여줍니다. 마우스에는 유전자 조작된 증식성 염료 염색 공여체 CD8+ T 림프구가 사전 주입됩니다. 보조제와 함께 오브알부민을 피하 주사하면 세포독성 CD8+ T 림프구가 생성되며, 이는 면역염색 및 유세포 분석을 통해 수확 후 확인됩니다.

보조 매개 세포독성 T 림프구 생성을 모니터링하기 위한 면역학적 기술

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

쥐 백신 접종 모델에서 나노 입자를 사용한 면역에 대한 반응으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 모니터링하기 위한 전체 동물 이미징 및 유세포 분석 기반 기술에 대해 설명합니다.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

여기, 전 대 한 프로토콜 선물이 vivo 항 원 특정 CD8의 질적 검색+ T 세포. 분석은 단일 셀 정지 적은 양의 혈액 또는 기관에서 가능 합니다. 광범위 한 연구는 세포 독성 T 세포 응답 (예방 접종과 암 immunotherapy 연구)의 분석을 필요로 합니다.

반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 CD8의 동시 정량화+ T 세포가 MHC를 통해 내가 Tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩

여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름

이 프로토콜은 마우스 모델에서 피부 각질을 분리하고, 금속 태그가 달린 항체로 염색하고, 다른 세포 주기 단계에서 관심 있는 단백질의 발현 패턴을 프로파일화하기 위해 질량 세포 측정에 의해 염색된 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

여기에서는 암-면역 주기를 구성하는 단계를 모니터링하고 특성화하기 위한 간단하고 빠르며 신뢰할 수 있는 다중 파라메트릭 유세포 분석 및 종양 온 칩 지원 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 실제로, 암과 면역 세포 간의 상호 작용에 대한 철저한 이해는 종양을 능가하고 임상 치료를 안내하는 데 중요한 통찰력을 제공합니다.

암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

배우세요 예방 접종된 마우스에서 항원 특이 CD8 T 세포의 세포 주기를 분석하는 DNA/Ki67 기반 유동 세포 분석법을. 이 기법은 면역 반응 동역학 연구에 활용됩니다.

예방 접종 된 마우스에서 항원 특정 CD8 T 세포의 세포 주기 분석을위한 DNA / Ki67 기반 유동 세포 분석

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