Name: 类器官来源的上皮单层:临床相关的肠道屏障功能体外模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 了解如何利用肠道类器官来源的上皮单层建立体外屏障功能模型。该方法通过TEER测量和渗透性实验评估上皮完整性，为个性化药物开发和胃肠道疾病研究提供患者特异性的生理相关平台。

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本工作由荷兰生命科学与健康领域（LSH）的 Topsector Life Sciences &amp;#38; Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland（LSH-TKI）公私合作伙伴关系（PPP）资助，项目编号 LSHM16021“类器官作为毒理学建模的新工具”授予 Hubrecht Organoid Technology（HUB），以及 HUB 对疾病建模与毒理学部门的内部资助。我们感谢萨宾·米登多普（Sabine Middendorp）实验室（乌得勒支大学医学中心威尔赫米娜儿童医院儿科胃肠病学部）和雨果·R·德容（Hugo R. de Jonge）与马塞尔·J·C·比弗尔茨（Marcel J.C. Bijvelds）实验室（鹿特丹伊拉斯姆斯医学中心胃肠病学与肝病学部）提供初始技术支持，以在膜插件上建立单层培养体系。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了肠道类器官的一般操作与维持方法，以及由此类类器官衍生的上皮单层细胞的制备及其可能的应用。迄今为止，已成功从十二指肠、回肠以及来自正常组织和既往及活动性炎症肠道组织的不同结肠区域的类器官中制备出单层细胞（未发表数据）。患者来源的类器官单层细胞的应用，有助于以疾病特异性和患者特异性的方式研究屏障功能，以及研究患者对多种药物治疗的个体化反应。尽管细胞系能够形成包含肠吸收细胞和杯状样细胞的分化且具有极性的单层细胞，但这些细胞系中许多不同的酶和转运蛋白表达异常，导致其复杂性和生理相关性降低3,30。类器官培养在技术上比细胞培养更具挑战性且更耗时；然而，类器官更能代表体内&#160;实际情况，而细胞系在复杂实验体系中反复表现出无法准确模拟组织反应的局限性。
尽管基于原代组织的模型能够较好地代表体内&#160;situation，但其需要使用实验动物或获取人体组织材料，而这些资源存在来源有限和伦理限制的问题。此外，原代组织无法扩增或扩增能力有限，且在...

肠上皮在肠道腔内容物与下方组织之间起到物理屏障作用。该屏障主要由单层吸收性肠上皮细胞构成，这些细胞通过紧密连接相互连接，从而在相邻细胞之间形成牢固的细胞间连接。这些细胞构成极化的上皮层，将肠道的顶膜侧（管腔侧）与基底外侧分开，同时调控消化后营养物质和代谢物的细胞旁转运。除肠上皮细胞外，其他重要的上皮细胞如杯状细胞、潘氏细胞和肠内分泌细胞也分别通过分泌黏液、抗菌肽和激素参与维持肠道稳态。肠上皮持续由位于肠隐窝底部的富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5阳性（LGR5+）干细胞分裂更新，这些干细胞产生过渡扩增（TA）细胞，向上迁移并分化为其他细胞类型1。遗传和环境因素（如食物过敏原、药物化合物以及微生物病原体的暴露）可破坏肠上皮稳态，导致肠道屏障功能受损。这些情况可引发多种肠道疾病，包括炎症性肠病（IBD）、乳糜泻和药物诱导的胃肠道毒性2。
使用多种体外平台系统（如膜插件、器官芯片系统、尤辛室和肠环）可开展肠道上皮相关研究。这些平台适用于建立具有顶膜和基底膜双侧通路的极化上皮单层，可采用永生化细胞系或原代组织作为模型。尽管永生化细胞系（如结肠直肠腺癌细胞系 Caco-2、T84 和 HT-29）在一定程度上能够分化为极化的肠上皮细胞或黏液分泌细胞，但其并不能真实代表体内情况&#160;上皮组织缺失多种细胞类型，且多种受体和转运蛋白异常表达3此外，由于细胞系来源于单一供体，无法代表患者间的异质性，且存在复杂性降低和生理相关性不足的问题。尽管在Ussing室和肠环实验中使用原代组织更能反映体内情况&#160;由于其来源有限、存活时间短且无法扩增，因此不适合作为高通量（HT）研究的实验材料。
类器官是由不同器官（如肠道、肾脏、肝脏、胰腺和肺）建立的体外上皮细胞培养物。研究表明，类器官具有长期稳定的扩增能力以及遗传和表型稳定性，因此可作为原始器官上皮组织的代表性生物学微缩模型，并能真实响应外界刺激4,5,6,7,8,9。类器官可高效地从切除或活检获得的正常、病变、炎症或癌变组织中建立，能够反映患者个体间的异质性反应10,11,12,13,14,15,16。本文展示了如何从类器官培养物中建立肠道上皮单层细胞模型。该单层模型已成功由小肠、结肠及直肠类器官培养物建立。此模型为研究药物在上皮细胞中的转运与通透性及其对上皮的毒理学效应提供了机会。此外，该模型还可用于与免疫细胞和细菌共培养，以研究它们与肠道上皮之间的相互作用17,18,19。进一步地，该模型可用于在患者特异性基础上研究对治疗的响应，并启动针对下一代以上皮屏障为靶点的治疗药物的筛选工作。这一方法有望拓展至临床应用，为实现个体化治疗铺平道路。
尽管本方案中的上皮单层细胞是由人正常肠道类器官制备的，但该方案也可适用于其他类器官模型，并可进行优化。上皮类器官单层细胞在含有Wnt的肠道类器官扩增培养基中培养，以支持干细胞增殖，并模拟肠道隐窝的细胞组成。通过调控Wnt、Notch和表皮生长因子（EGF）信号通路，可使肠道类器官富集为不同类型的肠道上皮细胞，例如肠吸收细胞、潘氏细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞。本研究中，在扩增培养基中建立单层细胞后，进一步诱导其向更成熟的肠道上皮细胞分化，如先前研究所述20,21,22,23,24,25。在筛选实验中，可根据目标化合物的作用机制、靶细胞类型及实验条件，将单层细胞诱导为特定的细胞组成，以便通过相关的功能性指标检测该化合物的作用效果。

<table><tbody><tr><td>100% 乙醇</td><td>Fisher Emergo</td><td>10644795</td><td></td></tr><tr><td>1250、300 和 20 &amp;micro;L 低吸附滤芯吸头</td><td>Greiner bio-one</td><td>732-1432 / 732-1434 / 732-2383</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>24 孔 HTS Fluoroblok Transwell 板（避光）</td><td>Corning</td><td>351156</td><td></td></tr><tr><td>24 孔 HTS Transwell 板（表 1）</td><td>Corning</td><td>3378</td><td></td></tr><tr><td>带 Transwell 插件的 24 孔板</td><td>Corning</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞筛</td><td>PluriSelect</td><td>43-50040-01</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>96 孔黑色板透明底</td><td>Greiner bio-one</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>96 孔快速热循环板</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 HTS Fluoroblok Transwell 板</td><td>Corning</td><td>351162</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 HTS Transwell 板（表 1）</td><td>Corning</td><td>7369</td><td></td></tr><tr><td>96 孔透明培养板</td><td>Greiner bio-one</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Bio-Techne Ltd</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Accutase 细胞解离试剂</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>A11105-01</td><td>细胞解离试剂 2</td></tr><tr><td>高级 DMEM/F-12</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养显微镜（光学显微镜）</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>PHCBI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 处理的 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>750024</td><td></td></tr><tr><td>含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 粉剂，无钙，无镁</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>21600069</td><td></td></tr><tr><td>EnzChek 溶菌酶检测试剂盒</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>E22013</td><td></td></tr><tr><td>EVOM2 电表配 STX 电极</td><td>WTI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胃泌素</td><td>Bio-Techne Ltd</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>Volac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>人 Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>人 Rspo3</td><td>Bio-Techne Ltd</td><td>3500-RS/CF</td><td></td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-335</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 一抗</td><td>Sanbio</td><td>BSH-7302-100</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 二抗</td><td>Agilent</td><td>K400111-2</td><td></td></tr><tr><td>Kova International Glasstic 计数板（带计数网格）</td><td>Fisher Emergo</td><td>10298483</td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lucifer Yellow CH 二锂盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel，生长因子减少型（GFR）</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>细胞外基质（ECM）</td></tr><tr><td>MicroAmp 快速 8 管条，0.1 mL</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>4358293</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 8 管盖条</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120 086</td><td></td></tr><tr><td>移液器（1000、200 和 20 &amp;micro;L）</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MUC2 一抗</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-15334</td><td></td></tr><tr><td>MUC2 二抗</td><td>VWR</td><td>VWRKS/DPVR-HRP</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器（200 &amp;micro;L）</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NGS Wnt</td><td>U-Protein Express</td><td>N001-0.5mg</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸 ALPI1/正向</td><td>定制</td><td>GGAGTTATCCTGCTCCCCAC</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸 ALPI1/反向</td><td>定制</td><td>CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸 LGR5/正向</td><td>定制</td><td>ACACGTACCCACAGAAGCTC</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸 LGR5/反向</td><td>定制</td><td>GGAATGCAGGCCACTGAAAC</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸 MUC2/正向</td><td>定制</td><td>AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸 MUC2/反向</td><td>定制</td><td>TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸 TBP/正向</td><td>定制</td><td>ACGCCGAATATAATCCCAAGCG</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸 TBP/反向</td><td>定制</td><td>AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG</td><td></td></tr><tr><td>光学粘合盖片</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Stemcell Technologies</td><td>72184</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>板式摇床</td><td>Panasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Fisher Emergo</td><td>A25776</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ANT-PM-2</td><td>原代细胞用抗菌制剂</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS 检测试剂盒</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>Q32852</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器用试剂储液槽</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4870</td><td></td></tr><tr><td>REMS AutoSampler 配 24 探针或 96C 探针</td><td>WTI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS 特殊染色试剂盒</td><td>Thermo scientific</td><td>87023</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase DNase 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180 / 607180 / 760180</td><td></td></tr><tr><td>血清移液器（Pipet-Aid）</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单刃剃刀片</td><td>GEM Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR 用 Superscript 第一链合成系统</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>11904018</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Spark 10M 酶标仪</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1x）</td><td>Life Technologies Europe BV</td><td>12605-010</td><td>细胞解离试剂 1</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Y27632（ROCK 抑制剂）</td><td>AbMole</td><td>M1817</td><td></td></tr></tbody></table>

类器官来源的上皮单层：一种用于肠道屏障功能研究的临床相关体外模型

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

过去，肠道上皮模型系统仅限于永生化细胞系和原代组织。这些模型系统存在固有局限性：前者不能真实反映原始组织的生理特性，而后者来源有限。因此，它们的应用阻碍了基础研究和药物开发研究。基于成体干细胞的类器官（下文简称为类器官）是其所来源的正常或病变上皮组织的微型复制品。类器官可从胃肠道（GI）不同区域高效建立，具有长期扩增能力，并可在体外模拟组织特异性和患者特异性的治疗反应。本文展示了由肠道类器官衍生的上皮单层细胞的建立方法，以及检测上皮屏障完整性、通透性与转运功能、&#160;抗菌蛋白分泌和组织学分析的方法。此外，肠道类器官衍生的单层细胞可富集增殖态干细胞和过渡扩增细胞，以及关键的已分化上皮细胞。因此，该模型系统可被定制用于研究化合物对靶细胞的作用及其作用机制。尽管类器官培养在技术上比细胞系更为复杂，但一旦建立，因其能真实再现体内上皮的复杂性及患者间的异质性，可显著减少药物研发后期的失败风险。

图1A 显示了从冻存管中解冻后肠类器官的代表性明场图像。以高密度解冻类器官对于确保最佳复苏至关重要。将类器官以约10 µL的细胞外基质（ECM）液滴形式接种于24孔或6孔板中（图1B）。大多数正常的肠类器官具有囊状形态。在完成解冻后的恢复过程中，类器官会生长至更大尺寸，并在3–7天后根据具体类器官培养条件准备进行传代（图1C）。收获类器官并洗去ECM后（图1D），可通过机械剪切将类器官破碎为较小片段。根据类器官的形态（囊状 图1C，出芽状 图1E），可使用塑料或玻璃移液管进行破碎处理（图1F）。类器官在悬浮液中被破碎（图2A），此过程应定期在显微镜下监测。需注意避免...

本文介绍了由人源类器官衍生的肠上皮单层细胞的制备方法，用于研究肠道屏障功能、通透性及物质转运。由于类器官能够再现原始上皮组织对外界刺激的反应，因此该模型兼具细胞系可扩增性的优势以及原代组织的相关性和复杂性。

过去，肠道上皮模型系统仅限于永生化细胞系和原代组织。这些模型系统存在固有的局限性……

类器官来源的单层细胞能够重现患者的肠道上皮屏障功能，并可用于测试旨在改善每位患者功能障碍的治疗手段，从而确定个体化的治疗策略。类器官单层培养使研究人员能够接触上皮的顶膜侧——即损伤发生的一侧，而在以三维结构生长的类器官中，该表面通常处于封闭且不可及的状态。每个类器官均具有独特性，因此研究面临挑战。为形成紧密的单层，应使用处于增殖期的类器官，并快速消化以形成由两到四个细胞组成的细胞簇。针对每种模型均需进行细胞接种量的优化。本实验操作将由HUB的高级研究助理Wies Van Dooremalen进行示范。首先用细胞外基质（ECM）包被膜插件。在生物安全柜中操作，将膜插件放入支撑板中。用预冷的含钙和镁的DPBS将ECM稀释40倍，然后吸取150微升稀释后的ECM加入每个插件的顶室中。将培养板在37摄氏度下孵育至少一小时。为准备细胞接种，将一份细胞解离试剂在37摄氏度水浴中预热。每六孔板的每个孔使用2毫升试剂。将含有类器官的培养板从培养箱转移至生物安全柜中。按照文本稿件中所述方法处理类器官，但不要将多个管中的样品合并至同一管中。收集类器官后，加入基础培养基或BM至12毫升，以85 × g离心，然后吸除上清液。向含有类器官的离心管中加入最多12毫升的DPBS，使用10毫升移液器上下吹打10次。在8°C条件下以85 × g离心5分钟，并在不扰动类器官沉淀的前提下吸除上清液。向类器官中加入预热的细胞解离试剂并重悬，然后将离心管倾斜或水平放置，在37°C水浴中孵育5分钟。孵育结束后，使用5毫升无菌塑料移液管或P1000移液器轻轻吹打10次。在显微镜下观察类器官悬浮液，检查是否已形成由单个细胞和部分由2至4个细胞组成的细胞团混合的悬浮状态。向细胞悬浮液中加入最多12毫升含ROCK抑制剂的BM培养基，以终止细胞解离。离心细胞，然后吸走上清液，注意不要扰动细胞沉淀。当在多个试管中处理相同的类器官培养物时，先将细胞沉淀汇集，再重悬于12毫升BM中。将细胞悬液通过预先用BM润湿的40微米滤网过滤，收集滤过液至50毫升锥形管中，然后用10毫升BM洗涤滤网，并将洗涤后的滤过液收集至同一管中。将过滤后的细胞悬液转移至两个新的15毫升锥形管中，重复离心步骤。吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀，然后将细胞重悬于4毫升IEM培养基中，每份用作起始材料的完整培养板需添加10 µM ROCK抑制剂。取少量细胞悬液与台盼蓝按1:1比例混合进行细胞计数，计数活细胞总数，对小细胞团中的每个单个细胞均需计数。制备细胞悬液，使其浓度为每毫升含3×10⁶个活细胞，悬液使用含10 µM ROCK抑制剂的IEM培养基。 接种细胞时，小心吸除ECM包被的插入式培养小室中的DPBS，保持培养板水平。用移液器将800微升添加了ROCK抑制剂的IEM培养基加入每个基底外侧室，再将150微升已制备的细胞悬液逐滴加入上皮室中ECM包被的膜表面。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育。待细胞沉降至膜上后，每天测定跨上皮电阻（TEER），并使用显微镜观察膜插件。为更新单层细胞，移除含有膜插件的培养板中基底外侧区室的培养基，然后小心抽吸顶侧区室的培养基。向每个顶侧区室逐滴加入150微升新鲜IEM，向每个基底外侧区室加入800微升新鲜IEM。若使用手动TEER仪，先用70%乙醇清洁电极，并在生物安全柜内晾干，然后将电极放入含有基础培养基（BM）的试管中。将电极连接至手动TEER仪，将功能开关调至欧姆（ohms）测量档位，并打开电源开关。将短电极置于插入式培养小室的顶端室（apical compartment），长电极置于基底外侧室（basolateral compartment），注意避免接触单层细胞。先测量空白孔的电阻，再依次测量其余样品。在不同条件的样品之间，用 BM 清洗电极。实验结束后，依次用去离子水和70%乙醇清洁电极，然后使其自然风干。本方案用于获取肠道类器官并制备上皮细胞单层。此处展示的是在 IEM 中培养八天的单层细胞。当单层细胞暴露于肠上皮细胞分化培养基（EDM）时，可观察到某种结构；而暴露于组合培养基（CDM）的单层细胞则显示出更平滑的结构。通过测量跨上皮电阻（TEER）可对单层细胞的形成进行定量监测。完全融合的单层细胞经测量其跨上皮电阻（TEER）值约为100 ohms·cm²，当暴露于任一分化培养基时，该值会升高。所有培养条件下的单层细胞对荧光黄的表观通透性均较低。在IEM中培养的回肠单层细胞产生的溶菌酶分泌量高于在IEM中培养至融合后，再于EDM或CDM中继续培养4天的单层细胞。在IEM、IEM加后续EDM或IEM加后续CDM中培养的单层细胞表现出形态学差异，这通过H&E、Ki67、MUC2和阿尔新蓝染色观察到。分化后，与IEM条件下相比，增殖细胞减少，而杯状细胞和肠上皮细胞标志物基因表达增加，如LGR5、MUC2和碱性磷酸酶基因表达所示。在制备单层细胞时，重要的是在消化类器官后防止其发生失巢凋亡。此外，细胞外基质应在Transwell膜上均匀分布。类器官来源的单层细胞可用于以患者特异性的方式，利用不同的荧光底物评估分子转运。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

类器官来源的上皮单层:临床相关的肠道屏障功能体外模型

来源：In, J. G.,等. 利用人类结肠类器官单层培养研究病原体、共生菌与宿主肠上皮之间的相互作用. J. Vis. Exp.

生成具有屏障功能的人类结肠类器官单层以研究宿主-病原体相互作用

本方案描述了在对人肠道类器官进行药物处理后，利用荧光显微镜和活细胞显微镜实时测量上皮屏障通透性的方法。...

人肠道类器官上皮屏障通透性的实时测量

本文介绍一种培养具有完整屏障功能的人类肠类器官或结肠类器官单层细胞的实验方案，用于在细胞和生化水平上研究宿主上皮细胞与微生物群之间的相互作用。...

用于研究病原体、共生菌与宿主肠上皮相互作用的人类结肠类器官单层培养模型

本文介绍一种用于量化小肠类器官屏障完整性的技术。该方法基于活体类器官，能够以时间分辨的方式连续检测不同屏障完整性调节物质或其组合的影响。...

研究活体类器官中肠道屏障的破坏

在本实验方案中，我们描述了如何直接从肠隐窝分离并培养小鼠原代结肠上皮单层细胞。我们提供了在可渗透滤膜上生成汇合单层细胞的实验方法，用于划痕伤口愈合及生物化学研究的汇合单层细胞培养方法，以及用于免疫荧光分析的稀疏和汇合单层细胞培养方法。...

从小鼠肠道隐窝生成原代结肠上皮单层细胞

本文介绍了两种可用于模拟肠道顶膜特异性相互作用的实验方案。类器官来源的肠道单层细胞培养和气液界面（ALI）培养可形成高度分化的上皮层，且可同时从管腔侧和基底侧进行操作；而极性翻转的肠道类器官则将其顶膜暴露在外，适用于高通量检测。...

利用肠道类器官模型研究顶端特异性相互作用的培养方法

本文介绍了一种构建基础的三维（3D）肠道细胞系模型系统的方法，以及对固定后的肠道类似物进行石蜡包埋以用于光学显微镜观察的实验方案。通过对特定蛋白进行染色，可从单次实验中分析多个可视化参数，有望应用于临床前药物筛选研究。...

含免疫组分的基础三维（3D）肠道模型系统

类肠体作为一种新型模型，正在被用于研究组织生理学与病理生理学、药物开发以及再生医学。本文中，我们描述了一种牛源原代细胞二维类肠体衍生培养系统，该系统允许与相关组织细胞类型进行共培养。该模型为胃肠道研究的建模提供了转化应用优势。...

用于转化医学研究的牛原代肠类器官二维单层培养体系的建立

本研究介绍了一种从类器官生成牛肠道二维单层细胞的实验方案，为研究宿主与病原体相互作用提供了更便捷的途径。方案包括评估膜完整性和功能性的方法，推动了 体外...

利用小肠和大肠单层界面技术推动牛类类器官的发展

该研究提出了一种方法 体外 细菌感染的研究 利用组织干细胞来源的肠道类器官。该方案描述了如何在二维条件下培养和分化类器官，并用黏附侵袭性...

利用侵袭素或基底膜提取物进行二维类器官培养以研究宿主-细菌相互作用

了解如何利用肠道类器官来源的上皮单层建立体外屏障功能模型。该方法通过TEER测量和渗透性实验评估上皮完整性，为个性化药物开发和胃肠道疾病研究提供患者特异性的生理相关平台。

类器官来源的上皮单层：一种用于肠道屏障功能研究的临床相关体外模型

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