Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Celle dissociation fra Tongue Epithelium og Mesenchyme / Bindevæv af Embryonale-Day 12,5 og 8-uger gamle mus
Chapters
Summary January 21st, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi har udviklet en generaliseret protokol til at adskille en stor mængde af høj kvalitet enkeltceller fra epitel og mesenchyme / bindevæv af embryonale og voksne mus tunger.
Transcript
Højt udbytte og kvalitet af celler fra komplekse væv er afgørende for almindeligt anvendte eksperimentelle analyser, såsom enkeltcelle RNA sekventering og primære stamcellekulturer. Denne protokol genererer sunde celler med højt udbytte og kvalitet fra forskellige regioner og vævsrum i pattedyrets tunge, herunder tungeepitelet og bindevæv. For at adskille epitel fra mesenchymet af en E 12,5 musetunge, overføre den aflivede gravide kvindelige mus til det kirurgiske område og våd musens mave med 70% ethanol for at forhindre pels i at komme ind på operationsstedet.
Åbn maven ved hjælp af dissekerende saks for at eksponere livmoderhornene, der bærer embryonerne, dissekere livmoderhornene og overføre dem til en 15 milliliter frisk Tyrodes opløsning i en 100 millimeter kulturret. Under et dissekerende mikroskop skal du bruge minisaks og fine pincet til at dissekere embryonerne fra livmoderhornene. Åbn mundhulen med de fine pincet og disseker tungen fra underkæbe ved hjælp af mini saks.
Vask tungerne med 15 milliliter frisk steril Tyrodes opløsning i en 100 millimeter kulturret. Overfør derefter vævene til to milliliter af en enzymblanding af dispase og kollagen i en 35 millimeter kulturret og inkuberes i 20 minutter ved 37 grader Celsius. Overfør tungerne til 15 milliliter frisk steril Tyrodes opløsning og adskil forsigtigt mesenchymet og epitelet fra ventralsiden ved hjælp af fine pincet.
Den separerede epithelia og mesenchym vaskes to gange i 15 milliliter frisk steril Tyrodes opløsning. For at adskille tungeepitelet fra det underliggende bindevæv fra en voksen mus, skal du overføre den aflivede mus til det kirurgiske område og vådt musehovedet ved hjælp af 70% ethanol for at forhindre pels i at komme ind i mundhulen. Brug dissekerende saks til at skære hjørnerne af munden langs kinden for at åbne mundhulen.
Disseker tungen med en mandible, vask den og læg den i en plastikskål med et lag plastfolie. Brug kirurgisk tang til at holde tungen, injicere enzym blandingen af dispase og kollagen i subepithelial rum af tungen gennem forkanten af den bageste tungen. Injicere en milliliter enzym blanding jævnt til hele tungen til vævsindsamling, derefter injicere 0,5 milliliter enzym blanding lokalt til den forreste tungen til vævsindsamling fra tungen spidsen eller til den bageste tungen for circumvallate papilla vævsindsamling.
Wrap tungen med plastfolie og inkubere det i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Brug mini saks til at dissekere circumvallate papilla og tunge spids. Derefter overføres et væv til 15 milliliter frisk steril Tyrodes opløsning.
Adskil epitelet fra det underliggende bindevæv i det enzym fordøjede subepithelialrum ved hjælp af mini saks og trim vævene til en passende størrelse i henhold til kravene i downstream-eksperimenter. Vask det adskilte epitel og underliggende bindevæv to gange i 15 milliliter frisk steril Tyrodes opløsning i en 100 millimeter kulturret. Overfør vævene til tre milliliter på 0,25% trypsin EDTA i en ny 35 millimeter kulturret.
Inkubat skålen i 30 minutter ved 37 grader Celsius, forsigtigt agiterende vævene hvert femte minut med en milliliter pipette tips. Tilsæt 500 mikroliter på 5%FBS i DMEM F12 for at stoppe reaktionen og overføre mediet til et fem milliliter lavt bindende centrifugerør. Centrifuge celleaffjedringen ved 200 gange G i otte minutter ved stuetemperatur og fjern supernatanten.
Resuspend cellerne forsigtigt i tre milliliter DMEM F12, der indeholder 10%FBS og 1%BSA, og filtrere cellerne med en 70 mikrometer celle si, efterfulgt af en 35 mikrometer celle si. Centrifuge celleaffjedringen ved 200 gange G i otte minutter ved stuetemperatur, og fjern derefter det meste af mediet, hvilket efterlader 50 til 300 mikroliter som det endelige volumen for at genbruge cellerne. I den embryonale musetunge er et hul i det subepitheliale rum synligt efter korrekt enzym fordøjelse.
I voksenmusetungen indikeres en vellykket enzymindsprøjtning ved hævelse i de injicerede områder, hvilket tyder på, at enzymet kan holdes af tungen. Efter at have samlet E12.5 tongues' epitelplader og tynde lag mesenchym, viste manuel celletælling, at protokollen gav 63.917 celler i alt med en levedygtighed på 95,2% fra epitelpladerne og 294 333 celler i alt med en levedygtighed på 96,3% fra mesenchymet. Når der blev brugt 10 voksne tunger ved otte ugers alderen, protokollen gav 187.333 celler med en levedygtighed på 95,4% fra epitelplader af tungespidsen, 544.000 celler med en levedygtighed på 96,3% fra epitelplader af circumvallate papillae og 150.500 celler med en levedygtighed på 93% fra bindevæv.
Efter denne protokol kan de dissociated celler bruges til enkeltcellet RNA-sekventering og 3D-testorganoidkultur til at definere ikke-rekonstruerede testgenitorceller under det lingualepitele epitel.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
