Name: 使用沉降机进行冷冻电镜和单颗粒分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 了解如何使用Scipion框架进行冷冻电镜单颗粒分析，通过整合多种图像处理软件包实现高分辨率三维重建。该工作流程支持光学流对齐、自动颗粒挑选和局部分辨率计算，显著提升结构生物学研究的准确性与效率。

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作者感谢以下机构提供的经费支持：西班牙科学与创新部通过以下项目资助：PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033 &#34;马德里自治区&#34; 通过以下项目资助：S2017/BMD-3817、Carlos III 健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）、PT17/0009/0010（ISCIII-SGEFI/ERDF）、欧盟（European Union）以及“地平线2020”计划（Horizon 2020）资助项目：INSTRUCT - ULTRA（INFRADEV-03-2016-2017，提案编号：731005）、EOSC Life（INFRAEOSC-04-2018，提案编号：824087）、iNEXT - Discovery（提案编号：871037）和 HighResCells（ERC - 2018 - SyG，提案编号：810057）。产生这些成果的项目获得了以下 fellowship 的支持： &#34;la Caixa&#34; 基础基金会（ID 100010434）。博士后项目编号为 LCF/BQ/DI18/11660021。本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议 No. 713673 下的资金支持。作者感谢Instruct（欧洲科学基础设施路线图ESFRI标志性项目）提供的支持及其资源的使用。

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作者无任何利益冲突需要披露。

目前，冷冻电镜（cryo-EM）是解析生物样品三维结构的关键工具。当显微镜采集到高质量数据时，现有的处理工具即可用于获得所研究大分子的三维重构。冷冻电镜数据处理能够达到近原子分辨率，这对于理解大分子的功能行为至关重要，同时在药物发现中也具有关键作用。
Scipion 是一款软件，能够以整合方式结合最相关的图像处理软件包，构建完整的流程，从而有助于整个图像处理流程的可追溯性和可重复性。Scipion 提供了一套非常完整的工具用于执行处理操作；然而，获得高分辨率重构结果完全取决于所获取数据的质量以及数据的处理方式。
要获得高分辨率的三维重构，首要条件是从显微镜获取高质量的电影数据，以在高分辨率下保留结构信息。如果无法满足这一条件，后续流程将无法从数据中提取出高分辨率信息。随后，一个成功的处理流程应能够准确提取出真实对应于目标结构的颗粒，并确定这些颗粒在三维空间中的取向。如果流程中的任何步骤失败，重构体积的质量将会下降。Scipion 允许在各个处理步骤中使用不同的软件包，有助于找到最适合数据处理的方法。此外，由于可选用的软件包众多，还可以使用共识工具，通过整合不同方法所得估计结果的一致性来提高准确性。同时，在代表性结果部分已详细讨论了多种验证工具，以及如何在流程的每一步识别准确与不准确的结果，以发现潜在问题并尝试解决。在整个实验方案中设有多个检查点，有助于判断流程是否正常运行，其中最关键的包括颗粒挑选、二维分类、初始体积估计和三维比对。检查输入数据、使用不同方法重复步骤或采用共识策略，都是 Scipion 提供给用户在遇到问题时可选择的解决方案。
在冷冻电镜领域，关于以往的软件包集成方法，Appion31 是唯一能够实现不同软件包真正集成的平台。然而，Appion 与 Leginon32（一种用于从电子显微镜自动采集图像的系统）紧密关联。Scipion 与 Appion 的主要区别在于，其数据模型与存储之间的耦合度更低。因此，在 Scipion 中创建新协议时，仅需开发一个 Python 脚本即可；而在 Appion 中，开发者不仅需要编写脚本，还必须修改底层数据库。总之，Scipion 的设计旨在简化系统的维护与扩展。
本文介绍了一套完整的冷冻电镜（Cryo-EM）处理工作流程，采用的是恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）80S核糖体的真实数据集（EMPIAR编号：10028，EMDB编号：2660）。文中涵盖并讨论的步骤包括：电影堆栈的图像校正、CTF估计、颗粒挑选、二维分类、初始三维图谱构建、三维分类、三维精修、结果评估以及后期处理。在多个步骤中使用了不同的软件包，并应用了共识性工具。最终获得的三维重构体积图分辨率达到3 Å，在经过后期处理的体积图中，可分辨出一些二级结构，如α-螺旋，有助于描述原子在空间中的排布方式。
本文所示的工作流程展示了如何以直接且集成的方式使用 Scipion 结合不同的冷冻电镜（Cryo-EM）软件包，从而简化数据处理过程，同时获得更可靠的结果。
未来，新方法和软件包的开发将持续增长，而像 Scipion 这样能够轻松整合所有工具的软件对研究人员而言将变得更加重要。当大量基于不同原理的方法可供使用时，共识性方法将变得更加重要，有助于在冷冻电镜三维重构过程中获得更准确的各类参数估计。研究过程中的追踪性和可重复性至关重要，而 Scipion 通过提供统一的完整工作流执行框架，使这两项目标更容易实现。

在冷冻电子显微镜（cryo-EM）中，对玻璃态冷冻水合样品进行单颗粒分析（SPA）是生物大分子成像中最广泛使用且最成功的方法之一，因为它能够揭示分子间的相互作用以及生物复合物的功能1。这得益于该成像技术的近期进展，引发了所谓的“分辨率革命”2，并成功解析出接近原子分辨率的生物三维结构。目前，单颗粒分析冷冻电镜达到的最高分辨率为1.15 Å，针对脱铁铁蛋白3（EMDB编号：11668）。这些技术进步包括样品制备4、图像采集5和图像处理方法6的改进。本文重点讨论最后这一方面。
简而言之，图像处理方法的目标是确定所有采集参数，以逆向解析显微镜的成像过程，从而重建所研究生物样本的三维结构。这些参数包括相机的增益、电子束诱导的运动、显微镜的像差（主要是离焦）、每个颗粒的三维角度取向和位移，以及在样本存在构象变化情况下的构象状态。然而，参数数量极多，且冷冻电镜（cryo-EM）需采用低剂量成像以避免辐射损伤，这显著降低了所获取图像的信噪比（SNR）。因此，该问题无法被唯一求解，所有待计算的参数仅能通过估计获得。在整个图像处理流程中，应识别出正确的参数，并剔除其余不准确的参数，最终获得高分辨率的三维重构结果。
显微镜生成的数据以帧的形式收集。简化来说，当使用电子计数探测器时，每一帧包含到达图像中特定位置（像素）的电子数量。在特定视野范围内会收集多帧图像，这称为一段电影。由于采用低电子剂量以避免辐射损伤破坏样品，信噪比（SNR）非常低，因此需要对同一段电影中的各帧进行平均，以获得能够揭示样品结构信息的图像。然而，所采用的并非简单的平均方法，因为在成像过程中，样品可能因电子束诱导的运动而发生漂移或其他类型的移动，这些运动需要被校正。经过漂移校正并平均后的帧最终生成一幅显微图像。
获得显微照片后，我们需要估计每张图像中由显微镜引入的像差，称为对比度传递函数（Contrast Transfer Function, CTF），它表示显微照片对比度随频率变化的情况。随后可以进行颗粒的选择与提取，这一过程称为颗粒挑选（particle picking）。每个颗粒应为仅包含一份待研究样品的小图像。目前有三类颗粒挑选算法：1）仅利用颗粒外观的一些基本参数化特征（如颗粒大小）在整套显微照片中寻找颗粒；2）通过用户输入或预训练数据集学习颗粒外观特征的算法；3）使用图像模板的算法。这三类算法具有不同的特性，将在后续展示。
显微照片中提取的颗粒集合将用于二维分类过程，该过程有两个目标：1）通过剔除包含纯噪声图像、重叠颗粒或其他伪影的子集来净化颗粒集合；2）每个类别的平均颗粒可作为初始信息用于计算三维初始体积。
三维初始体积的计算是接下来的关键步骤。获得三维结构的问题可以被视为一个多维解空间中的优化问题，其中全局最小值即为能够最好地代表原始结构的三维体积，但该空间中还存在多个代表次优解的局部最小值，很容易陷入其中。初始体积是搜索过程的起点，因此初始体积估计不佳可能会导致我们无法找到全局最小值。从初始体积出发，通过三维分类步骤有助于发现不同的构象状态，并再次对粒子集进行清理；其目标是获得结构上均一的粒子群体。随后，三维精修步骤将负责优化每个粒子的角度和位移参数，以获得尽可能最佳的三维体积。
最后，在最后的步骤中，可对获得的三维重构结果进行锐化和优化。锐化是指增强重构体积中高频信息的过程，而优化则是指在颗粒水平上进一步调整一些参数，如CTF或电子束诱导运动校正。此外，还可以采用一些验证方法，以更好地理解整个工作流程结束时所达到的分辨率。
经过上述所有步骤后，通过从头构建原子模型或拟合现有模型，示踪和对接过程7将有助于为获得的三维重构赋予生物学意义。如果达到高分辨率，这些过程将揭示结构中生物大分子的精确位置，甚至包括各个原子的位置。
Scipion8 能够以整合的方式结合最相关的图像处理软件包，创建完整的 workflow。Xmipp9、Relion10、CryoSPARC11、Eman12、Spider13、Cryolo14、Ctffind15、CCP416、Phenix17 以及许多其他软件包均可集成到 Scipion 中。此外，它还集成了所有必要的工具，以提升整合性、互操作性、可追溯性和可重复性，从而实现对整个图像处理 workflow 的全面追踪8。
Scipion 允许我们使用的最强大工具之一是共识（consensus）方法，即在处理流程的某一步骤中，将多种方法获得的结果进行比较，整合不同方法所传递的信息，从而生成更精确的输出。这种方法有助于提升性能，并改善所估计参数的达到质量。需要注意的是，可以构建不使用共识方法的更简单工作流程；然而，我们已经认识到该工具的强大作用22,25，本文所呈现的工作流程将在多个步骤中使用这一方法。
前文所述的所有步骤将在下一节中详细说明，并结合使用 Scipion 软件进行完整的流程演示。同时，还将展示如何利用一致性分析工具，提高生成结果之间的吻合度。为此，本研究选用Plasmodium falciparum 80S 核糖体的示例数据集（EMPIAR 编号：10028，EMDB 编号：2660）。该数据集包含 600 段电影图像，每段包含 16 帧，图像尺寸为 4096×4096 像素，像素大小为 1.34Å，数据采集于 FEI POLARA 300 电镜，配备 FEI FALCON II 相机，EMDB 报道的分辨率为 3.2Å18。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;本文未使用任何材料&lt;/em&gt;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

冷冻电镜与scipion单颗粒分析

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

冷冻电子显微镜已成为生物研究中揭示大分子近原子分辨率结构信息的最重要工具之一。在单颗粒分析中，通过电子束对玻璃态冰冻样品进行成像，显微镜柱末端的探测器生成该样品的电影图像。这些电影包含数千张相同颗粒在随机取向下的图像。这些数据需要经过包含多个步骤的图像处理流程，以获得最终的三维重构体积。图像处理流程的目标是确定采集参数，从而能够重构所研究的样品。Scipion 提供了使用多种图像处理软件包在集成框架中构建该流程的全部工具，同时支持结果的可追溯性。本文以一个真实测试案例的数据为例，全面介绍并讨论了 Scipion 中的整个图像处理流程，详细说明了从显微镜获取的电影图像到高分辨率最终三维重构的全过程。此外，还探讨了使用共识性工具的强大功能，这些工具可整合不同方法，并在流程的每一步验证结果，从而提高最终结果的准确性。

冷冻电子显微镜中的单颗粒分析是用于高分辨率解析生物大分子复合物结构的主要技术之一。Scipion 提供了完整的工具链，可用于处理显微镜获取的数据，并实现生物样本的三维重构。

冷冻电镜与Scipion单颗粒分析

冷冻电子显微镜已成为揭示大分子结构信息的最重要工具之一，在生物研究中发挥着关键作用。

Scipion 提供了一整套工具，能够以整合的方式为冷冻电镜中的单颗粒分析创建完整的处理流程，从而实现对生物样本的高分辨率三维重构。该框架支持利用多种图像处理软件包来构建处理流程，有利于不同方法之间的互操作性、可追溯性、可重复性，并能够整合不同方法所提供的信息，以生成更精确的结果。Scipion 持续不断发展，不断纳入新的方法和软件包。此外，该方法已扩展至冷冻电子断层扫描和原子建模，也可用于创建处理此类数据的工作流程。在 Scipion 中创建项目，请点击“创建项目”以建立新项目。如需导入显微镜电影文件，请选择“导入电影”。将出现一个新窗口。在此窗口中，输入数据的路径，并将显微镜电压设置为 300 千伏，球差设置为 2 毫米，振幅对比度设置为 0.1，放大倍数设置为 50,000，采样率模式设置为“来自图像”，像素尺寸设置为 1.34 埃。当所有参数设置完成后，点击执行。当方法运行结束后，打开“摘要”选项卡，点击“分析结果”。此时将弹出一个新窗口，显示该方法生成的所有输出结果列表。要运行用于电影对齐的光流法，请打开 xmipp3 光学对齐方法，选择已导入的电影作为输入电影，并将“对齐帧范围”设置为第 2 至第 13 帧。在“附加参数”中，将“使用先前的电影对齐以 SUM 帧”选项设置为“否”。其余所有选项均保持默认设置，然后执行程序。单击“分析结果”以检查获得的显微图像以及估计位移的轨迹。对于每幅显微图像，均可查看其功率谱密度、用于在直角坐标和极坐标下对齐电影的轨迹，以及所获得显微图像的文件名。与视频的单帧图像相比，显微照片中样品的颗粒明显更清晰可见。进行颗粒挑选时，打开 xmipp3 手动挑选方法，并选择先前获得的显微照片作为输入显微照片。点击执行。将出现一个新的交互窗口。在此窗口中，将像素大小更改为 150。所选的显微照片将在更大的窗口中显示。手动选取一个区域内的所有可见颗粒。当所有颗粒均被手动选取后，点击“激活训练”以开始学习过程。显微照片的其余区域将被自动选取。检查已选取的颗粒。如需添加额外颗粒，请点击感兴趣的颗粒。如需删除错误的颗粒，可按住 Shift 键并根据需要点击相应颗粒。当所有颗粒被自动选取后，依次选择接下来的四张显微照片，以创建一个具有代表性的训练集。每张选定的显微照片中的颗粒将被自动选取，需逐张检查并根据需要添加或删除颗粒。获得训练集后，点击“Coordinates”以保存所有已选取颗粒的坐标。获取训练集后，打开 Xmipp3 自动选颗粒工具，指定之前在 Xmipp 粒子选区运行中完成的手动选区结果，并将“待选显微照片”设置为“与监督一致”。点击执行，生成约 100,000 个坐标。为应用一致性方法，打开 SPHIRE-CryoLO 选颗粒工具，将预处理后的显微照片设为输入显微照片，并将选颗粒模型设为默认值。将置信度阈值设为 0.3，框大小设为 150，然后点击执行。该方法应生成约 100,000 个坐标。接下来，打开 xmipp3 深度共识挑选，将输入坐标设置为包含 sphire cryolo 和 xmipp3 自动挑选的输出结果，选择模型类型为预训练模型，并将“跳过训练并直接使用预训练模型评分”设为“是”，然后点击执行。执行结束后，点击“分析结果”。在新窗口中，点击眼睛图标。此时将打开第二个新窗口，其中列出所有颗粒。该列中的 Z 分数值可反映每个颗粒的质量，低值表示质量较差。要按 Z 分数从高到低排序颗粒，请点击 Xmipp Z 分数深度学习，并选择 Z 分数高于 0.75 的颗粒。然后点击坐标，以创建包含约 50,000 个坐标的新的子集。要局部计算分辨率，请打开 xmipp3 局部 MonoRes，将输入体积设为上一步精修的输出结果，将“是否使用半体积”设为“是”，分辨率范围设为 1 到 10 埃。参数设置完成后，点击执行。分辨率计算完成后，点击分析结果，然后选择显示分辨率直方图和显示彩色切片。将展示体积中不同区域的分辨率。结构中心区域的大部分体素分辨率应接近3埃，而最差的分辨率将出现在结构的外周区域。还将显示每个体素分辨率的直方图，其峰值位于3埃或低于3埃处。要应用锐化，请打开 xmipp3 局部去模糊锐化工具，并选择上一步精修的输出作为输入图谱，将分辨率图谱设置为获得的 MonoRes 图谱。命令执行完毕后，双击“摘要”选项卡中生成的输出体积集合，即可查看每次迭代生成的体积。建议使用其他工具（如 UCSF Chimera）打开该体积数据，以更清晰地在三维空间中观察其特征。在本图中，可观察到傅里叶壳层相关性达到三埃，已非常接近奈奎斯特极限。如图所示，重建的三维体积切片展现出高度的细节和清晰定义的结构。经过局部分析，大部分中心体素的分辨率达到三埃以下。然而，局部分辨率切片的外围区域显示出较低的分辨率，这与这些区域内观察到的模糊现象一致。经过后期处理后，三维图谱体积的高频信息得以显现，揭示出更多细节，并改善了结构的呈现效果。当达到的分辨率足够高时，甚至可以观察到结构中的一些生物化学组分。如果获得的结构分辨率较低，且无法进一步优化至更高分辨率，则可观察到一个模糊的体积图，其傅里叶壳层相关系数较低，分辨率曲线和局部估计的直方图均不理想。完成颗粒挑选后，可通过二维分类来检查以评估颗粒质量。例如，在此分类中，颗粒存在噪声、未居中或相互耦合，表明颗粒挑选不正确。另一个检查点可在初始体积估计期间进行。在此示例中，由于该方法的设置不正确，导致生成了错误的估计结果。当获得分辨率足够高的三维图谱后，下一步便是为该图谱构建原子模型。此过程可在 Scipion 中利用建模插件完成。该技术可用于成功重构生物大分子，以评估其分子相互作用及生物复合物功能，从而为药物设计提供基础。

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了解如何使用Scipion框架进行冷冻电镜单颗粒分析，通过整合多种图像处理软件包实现高分辨率三维重建。该工作流程支持光学流对齐、自动颗粒挑选和局部分辨率计算，显著提升结构生物学研究的准确性与效率。

冷冻电镜与Scipion单颗粒分析

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