Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
ייצור תאי CAR-T מהונדסים על-ידי CRISPR האנושי
Chapters
Summary March 15th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לעריכת גנים בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות טכנולוגיית CRISPR Cas לשינוי תאי CAR-T.
Transcript
פרוטוקול המעבדה שלנו מאפשר שילוב של עריכת גנום אנושי עם טיפול בתאי CAR T. הליך המעבדה הוא הגישה עם CRISPR-Cas9 למיקוד של עד שלושה גנים ביעילות גבוהה. ולבסוף, הגישה שלנו יכולה להיות מתורגמת לניסויים קליניים בבני אדם.
ניתן להחיל את השיטות המתוארות על מבנים אחרים של CAR ועל גנים ממוקדים. הבסיס של הטכניקות חזק מספיק כדי להיות מתורגם בקנה מידה גדול יותר למשתפי פעולה אקדמיים ותעשייה לפיתוח נוסף. בעת ניסיון לפרוטוקול זה בפעם הראשונה, הגבל את מספר הקבוצות במסך ה- RNA של המדריך כדי לאפשר זמני דגירה מדויקים.
דבקות בתנאי התרבות וצפיפות הזריעה כמתואר הוכיחו את עצמם כקריטיים מניסיוננו. כדי להתחיל, להשיג תאים חד-גרעיניים אוטומטיים של דם היקפי, או מחשבים אישיים, מתורמים מתנדבים בריאים ולבודד תאי T חיוביים CD4 ו- CD8 באמצעות ערכות בחירה CD4 ו- CD8 זמינות מסחרית. שלבו תאי T חיוביים CD4 ו-CD8 חיוביים ביחס של אחד לאחד ודגרו 3 מיליון תאים למיליליטר ב-R10, בתוספת 5 ננוגרם למיליליטר של כל IL7 אנושי ו-IL15 אדם בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס.
למחרת, לספור את תאי T וצנטריפוגה 5 עד 10 מיליון תאים ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. יש להשליך את כל כדורי העל ולשטוף את גלולה התא בסרום מופחת. להשעות מחדש את הכדור ב 100 microliters של פתרון חיבה גרעינית על פי הוראות היצרן.
בעת שטיפת התאים, להכין ריבונוקליאופרוטאין, או קומפלקס RNP, על ידי דגירה 10 מיקרוגרם של נוקלאז Cas9 עם 5 מיקרוגרם של RNA מדריך יחיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כלול פקד מדומה ללא RNA של מדריך יחיד. שלב את התאים המושעים מחדש עם קומפלקס RNP והוסף 4.2 מיקרוליטרים של ארבעה משפרי אלקטרופורציה מיקרומולריים.
מערבבים היטב ומעבירים לקובטות אלקטרופורציה. אלקטרופורציה התאים באמצעות קוד דופק EH111, ולאחר מכן לדגור 5 מיליון תאים למיליליטר ב R10, בתוספת 5 ננוגרם למיליליטר אדם IL7 ו IL15 אנושי ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות ב 12 לוחות היטב. לאחר הדגירה, המשך עם הפעלה והרחבה של תאי T.
עצב את פריימרי הרצף על-ידי הזנת הרצף של אמפליסון PCR לתוכנת עיצוב פריימר סטנדרטית. תוכנת העיצוב תציע רצפי פריימר מרובים המתאימים לרצף סנגר. בחר פריימרים קדמיים והופכים שנקשרים עם האמפליקון לפחות 150 זוגות בסיס במעלה הזרם או במורד הזרם של אתר חיתוך gRNA כדי להבטיח איכות רצף טובה סביב indels.
השתמש בניתוח TIDE כדי לזהות יעילות נוקאאוט ברמה הגנומית. האלגוריתם משחזר במדויק את הספקטרום של indels מן עקבות הרצף ומחשב ערכי R ריבועי. לאחר ההפעלה, תאי T מורחבים בתרבית והקפאה שמורה למחקרים עתידיים.
במהלך ההרחבה, מתבצע מעקב אחר הכפלת האוכלוסייה ושינויי אמצעי האחסון לאורך הפרוטוקול עבור תאי CAR T מדומים וערוכים כאחד. במהלך ההתפשטות לא התגלו שינויים משמעותיים בהתפשטות ובהפעלה. לאחר התאים היו cryopreserved, רמות של ביטוי CAR נקבעו למחקרים פונקציונליים נוספים עבור שני ערוך מדומה ותאי CAR T knockout.
לא נצפו שינויים משמעותיים. יעילות נוקאאוט ניתן לקבוע באמצעות טכניקות מרובות. בחלקות ציטומטריית זרימה מייצגות אלה, ה- PDCD1 וה- TRAC loci היו ממוקדים באמצעות RNA מדריך יחיד, המציג יעילות של 90% עבור RNA מדריך יחיד PDCD1 ו - 98% עבור RNA מדריך יחיד TRAC על פני תורמים בריאים מרובים.
חשוב לוודא שיחסי הטוחנת של Cas9 ו- RNAs המדריך מדויקים. במהלך ההליך, התאים תמיד צריך להישמר בארבע מעלות צלזיוס ולא להישאר בתמיסת אלקטרופורציה לתקופות ממושכות של זמן. לאחר שימור CAR, תאי ה- CAR T המהונדסים CRISPR יכולים לשמש לבדיקות פונקציונליות במבחנה וב- in-vivo, כגון בדיקות ציטוטוקסיות, ייצור ציטוקינים ומודלים של עכבר גידול סינגנטי או קסנוגרף.
הגישה שלנו באמצעות טכנולוגיית CRISPR Cas9 מיושמת כעת בניסויים קליניים. הגישה יכולה לשמש הן לסרטן, כמו גם הפרעות גנטיות לא ממאירות, כגון hemoglobinophaties, אשר משפיעים על מיליוני ילדים ומבוגרים ברחבי העולם.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
