Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Nøytronspinn ekkospektroskopi som en unik sonde for lipidmembrandynamikk og membranproteininteraksjoner
Chapters
Summary May 27th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dette dokumentet beskriver protokollene for prøvepreparering, datareduksjon og dataanalyse i NSE-studier (neutron spin echo) av lipidmembraner. Fornuftig deuteriummerking av lipider gir tilgang til forskjellige membrandynamikker på mesoskopisk lengde og tidsskalaer, over hvilke vitale biologiske prosesser oppstår.
Transcript
Denne protokollen beskriver prøvepreparering og datareduksjon som kreves for vellykkede nøytronspinnekkostudier av kollektive membransvingninger av relevans for biologiske funksjoner og praktiske anvendelser av lipidmembraner. NSE får direkte tilgang til membrandynamikk på nanosekund-tidsskalaene til viktige membranfunksjoner med den unike fordelen med isotopfølsomhet for å undersøke selektive membranfunksjoner utilgjengelige med andre teknikker. Studier av membrandynamikk på nanoskala er avgjørende for å forstå molekylmekanismens underliggende membranegenskaper og membranproteininteraksjoner involvert i ulike cellepatologier.
Metoden gir forskere nye i NSE med detaljerte retningslinjer for utforming, forberedelse og karakterisering av lipid vesicles for vellykkede eksperimenter og påfølgende datareduksjonsanalyse og tolkning. Å demonstrere prosedyren vil være Teshani Kumarage og Julie Nguyen, en avgangsstudent og en bachelorstudent fra laboratoriet. Arbeid inne i en hette, forbered lipidfjæringen ved å oppløse nøyaktig veide lipider i en milliliter løsningsmiddel med manuell blanding.
Tørk lipidløsningen ved å forsiktig strømme en inert gass i hetteglasset mens du sakte roterer det i en vinkel. For å fjerne gjenværende løsningsmiddel grundig, plasser hetteglassene over natten i en vakuumovn ved 35 grader Celsius. Neste dag hydrerer du lipidfilmen med to milliliter tungtvann for å oppnå en lipidkonsentrasjon på 50 milligram per milliliter og virvel den hydrerte lipidfjæringen til lipidfilmen er fullstendig oppløst.
Deretter utfører du fem fryse-tine sykluser ved å lagre hetteglasset med hydrert lipid suspensjon ved minus 80 grader Celsius til frossen. Og deretter overføre den til et 35 grader Celsius vannbad for å tine lipidfjæringen. Virvel den tinte suspensjonen til homogen før du går videre til neste syklus.
Før du starter eksperimentet, monterer du ekstruderoppsettet ved hjelp av en polybikarbonatmembran mellom to membranstøtter og legger til to papirfiltre på hver side for å gi ekstra støtte. Bruk lufttette glasssprøyter for å hydrere polykarbonatmembranen ved å passere 0,3 milliliter tungtvann gjennom membranenheten flere ganger. Etter å ha hydrert membranen, sett inn en en milliliter gasstett sprøyte med en tilberedt melkeaktig hvit farge lipidoppløsning i den ene enden og en tom sprøyte i motsatt ende av ekstruderapparatet.
Når sprøytene er koblet til, plasserer du enheten i ekstruderblokken. Programmer pumpen ved å holde nede Hastighet-knappen for å gå inn i ekstruderingshastigheten og trykk på Diameter-knappen for å angi sprøytediameteren. Trykk deretter på Trekk tilbake til lyset slås på.
Trykk på start og vent til prøven begynner å dispensere i den tomme sprøyten. Trykk på Stopp-knappen rett før prøvesprøyten er helt tom. Registrer det dispenserte volumet, og hold deretter inne Hastighet-knappen til fase én vises på skjermen.
Hold uttrekkslampen av, trykk på volumknappen for å gå inn i det dispenserte volumet som er registrert tidligere. Trykk på Rate-knappen igjen og bruk pil høyre mest opp for å få tilgang til fase to. Trykk på volumet for å angi samme verdi for det dispenserte volumet som ble registrert tidligere.
I denne fasen trykker du på Trekk ut-knappen til uttrekkslyset er på. Gjenta syklusen for fase tre ved å trykke på volumknappen til LP:SE vises på skjermen og sett den til 20. Til slutt trykker du på Hastighet-knappen, får tilgang til fase fire og trykker på volumknappen for å komme til Stopp-funksjonen for å fullføre pumpeoppsettet.
Når pumpen er programmert, trykker du på Start for å starte ekstruderingssyklusen. Utfør 15 til 20 ekstruderingssykluser før du samler den gjennomsiktige opalblå ekstruderte lipidfjæringen i et rent hetteglass for målinger. Åpne DAVE-programvaren og velg reduser NSE-data fra DataReduksjon-menyen.
Last opp datafilene over forskjellige Q-verdier ved hjelp av Åpne echo-filer fra filmenyen. De opplastede filene vises under de tilgjengelige datasettene. Høyreklikk på den valgte filen og merk den i henhold til målingen den tilsvarer som Eksempel, Celle eller Oppløsning.
Bruk datasettfanen til å gruppere detektorpikslene i 2 X 2 for å forbedre signal-til-støy-forholdet. Bruk den samme binning på alle filer med oppløsning, celle og eksempel. Inspiser dataene over alle pikselgrupper og masker dem med dårlige signaler ved å trykke end-tasten på tastaturet.
Trykk ENTER for å få tilgang til et popup-vindu for å bruke den samme masken på alle fire gangene dine. Maskerte bildepunkter blir grønne. Forsikre deg om at de innsamlede dataene er i form av et ekkosignal.
Begynn å tilpasse oppløsningsfilen fra den opplastede fillisten ved å høyreklikke på ønsket fil og velge Tilpass operasjoner, Tilpass ekkooppløsning fra hurtigmenyen. Kontroller at signalene gir rimelige tilpasningsparametere. Hvis du vil undersøke feilen som er knyttet til hver tilpasningsparameter over hele detektoren, velger du Bildealternativer, og deretter velger du interesseparameteren for tilpasning.
Høyreklikk deretter på detektorbildet for å få tilgang til et popup-vindu som viser et feilfeltkart. Hvis tilpasningen over en bestemt piksel er utilfredsstillende, kan du sette signalet over den pikselen på nytt ved å merke det, trykke kategorien Tilpassing og deretter trykke tilpass piksel. Angi nye startparametere for fasen og perioden i kategorien Tilpassing .
Reduser eksempelfilen ved å velge den tilsvarende filen fra listen over opplastede og merkede filer. Inspiser alle piksler og masker de fattige som beskrevet ovenfor. Høyreklikk deretter på filen og velg Tilpass operasjoner, Importfaser.
For oppløsningsfilen tilpasser du ekkosignaler som beskrevet tidligere, med verdiene i perioden uendret og ekkofasepunktet importert fra oppløsningen passer. Angi strålesenteret for alle datafiler ved å gå til kategorien Generelt og angi X- og Y-strålesenterverdier som er registrert fra eksperimentet. Når anfallene er fullført, beregner du den normaliserte mellomliggende spredningsfunksjonen ved å klikke rett på ønsket eksempelfil fra listen over monterte filer og velge Beregn I av Q fra hurtigmenyen.
Skriv inn den nødvendige informasjonen for oppløsningen og cellefilene og antall Q-buer i popup-vinduet, og trykk deretter OK for å vise resultatene. Legg merke til at dataene i cyan viser et dårlig signal på grunn av detektorkanteffekter og bør elimineres når du kompilerer forskjellige Q-datasett. Til slutt lagrer du de reduserte datasettene som ASCII-filer og lagrer hele økten som et DAVE-prosjekt i ønsket mappe.
I denne studien ble NSE-målingene av liposomale prøver utarbeidet med ulike deuteringsordninger utført. NSE-målinger av membranbøyingssvingninger utføres på fullt kontrasterte liposomer. Denne deuteringsordningen resulterer i en stor spredningslengdeforskjell mellom membrankjernen og detutererte væskemiljøet, noe som forbedrer spredningssignalet fra liposomale membraner betydelig og forbedrer målestatistikken for bøyedynamikk.
På den annen side viser NSE-målinger av membrantykkelsessvingninger i liposomer avvik i forhold til Q til den tredje avhengigheten av bøyesvingninger. For å isolere tykkelsesvariasjonssignalet, er det oppnådde signalet delt på Q til den tredje og overflødig dynamikk er montert på en Lorentzian-funksjon i Q.Denne metoden er betinget av data av god kvalitet, noe som er mer oppnåelig med prøver av høye konsentrasjoner og sterke spredningssignaler. Dynamikken i NSE kan utforskes synergistisk av deuterium NMR relaxometry og molekylær-dynamiske simuleringer for å illustrere hvordan molekylære lipidstrukturer og pakkemotiver påvirker membranfunksjoner.
NSE-studier på lipidmembraner kaster nytt lys over membranbiofysikk, de intrikate relasjonene mellom membranstruktur og dynamikk, og hvordan de påvirker membranfunksjoner og membranproteininteraksjoner.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
