Name: Effizientes Fragment-Screening in der XChem-Anlage an der Diamond Light Source (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Erfahren Sie das XChem-Verfahren für kristallbasiertes Fragment-Screening mit Röntgenkristallographie. Diese Methode unterstützt die Arzneimittelforschung durch effiziente Identifizierung schwacher Bindungen.

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Diese Arbeit stellt eine große gemeinsame Anstrengung zwischen der Diamond Light Source und dem Structure Genomic Consortium dar. Die Autoren möchten den verschiedenen Unterstützungsgruppen und der MX-Gruppe von Diamond für ihren Beitrag zur Automatisierung der i04-1-Beamline und für die Bereitstellung optimierter Datenerfassungs- und Auto-Processing-Pipelines danken, die üblicherweise über alle MX-Beamlines hinweg ausgeführt werden. Sie möchten sich auch bei der SGC PX-Gruppe für ihre Widerstandsfähigkeit bedanken, die ersten Anwender zu sein, die das Setup getestet haben, und bei Evotec dafür, dass sie der erste ernsthafte industrielle Anwender waren. Diese Arbeit wurde durch iNEXT-Discovery (Grant 871037) gefördert, gefördert durch das Horizon 2020 Programm der Europäischen Kommission.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Der in diesem Dokument beschriebene Prozess wurde von der Benutzergemeinschaft ausgiebig getestet, und die Anpassungsfähigkeit der hier beschriebenen Protokolle ist der Schlüssel für die Handhabung der Vielzahl von Projekten, die typischerweise auf der Plattform auftreten. Es sind jedoch einige Voraussetzungen für das Kristallsystem notwendig.
Für jede Fragment-Screening-Kampagne, die mittels Röntgenkristallographie durchgeführt wird, ist ein reproduzierbares und robustes Kristallsystem von entscheidender Bedeutung. Da das Standard-XChem-Protokoll die Zugabe des Fragments direkt zum Kristalltropfen vorsieht, sollte sich die Optimierung auf die Anzahl der Tropfen konzentrieren, die hochwertige Kristalle enthalten, und nicht auf die Gesamtzahl der Kristalle. Wenn Tropfen mehrere Kristalle enthalten, sind sie effektiv überflüssig, obwohl sie den Ernteprozess erleichtern können. Darüber hinaus kann die Übertragung des Kristallisationsprotokolls vom Heimatinstitut auf die Einrichtungen vor Ort eine Herausforderung darstellen. Dies wird im Allgemeinen am besten durch Kristallaussaat erreicht, um eine reproduzierbare Keimbildung zu fördern54, und daher ist es eine gute Praxis für die Anwender, Saatgut zusammen mit ihren Protein- und Kristallisationslösungen bereitzustellen.
Um eine gute Löslichkeit und Unterstützung der Verbindung zu gewährleisten, werden die hohen Einweichkonzentrationen, die die Bindung schwacher Fragmente vorantreiben sollen, Fragmentbibliotheken in organischen Lösungsmitteln, insbesondere DMSO und Ethylenglykol, bereitgestellt. Die Bereitstellung von zwei verschiedenen Lösungsmitteln bietet Anwendern eine Alternative für Kristalle, die DMSO überhaupt nicht vertragen oder bei denen es die Bindung von Fragmenten an einer interessierenden Stelle verhindert. Anwender können alternative Bibliotheken in wässrigem Puffer liefern: Verbindungen lassen sich gut dosieren, sofern sie vollständig aufgelöst und in Platten formatiert sind, die mit dem Flüssigkeitsdosierroboter kompatibel sind.
Für Projekte, bei denen es nicht möglich ist, ein geeignetes organisches Lösungsmittel zu finden, das sowohl die Bibliothek auflöst als auch vom Kristallsystem toleriert wird, besteht ein alternatives Verfahren darin, getrocknete Verbindungen zu verwenden, wie sie an BESSY55 etabliert sind.
In der Gemeinschaft gibt es seit langem die Frage, ob Verbindungen in Kristalle eingeweicht werden können, die unter Kristallisationsbedingungen mit hohen Salzkonzentrationen gezüchtet wurden. In der Praxis wird eine stärkere Ausfällung der Verbindungen und eine schnelle Bildung von Salzkristallen in der Erntephase beobachtet, die durch die Anwendung einer feuchten Umgebung um den Erntebereich herum reduziert wird. Im Allgemeinen liefern Screening-Kampagnen in Kristallsystemen unter Bedingungen mit hoher Salzkristallisation eine vergleichbare Trefferquote wie unter Bedingungen mit niedrigem Salzgehalt.
Die Anfangsphasen des XChem-Prozesses (Lösungsmitteltoleranzprüfung und Pre-Screening) sind relativ kleine und schnelle Experimente, ermöglichen aber eine klare Go/No-Go-Entscheidung für das Projekt. Am schmerzhaftesten ist, dass alternative Kristallsysteme gefunden werden müssen, wenn keines der beiden Lösungsmittel vertragen wird oder das Pre-Screening zu einer sehr niedrigen Trefferquote führt. Im Gegensatz dazu geben die Ergebnisse, wenn sie erfolgreich sind, direkt Aufschluss über die Einweichbedingung, die für das Screening-Experiment verwendet werden soll, und über die beste Strategie für die Datenerfassung. Da die Qualität der Daten, insbesondere die Auflösung, die Qualität der Elektronendichte für die Trefferidentifikation und -analyse beeinflusst, ist es das Ziel, bei der höchstmöglichen Verbindungskonzentration zu tränken, die sich nicht nachteilig auf die Beugungsqualität auswirkt (wobei die Mehrheit der Datensätze (~80%) mit einer Auflösung von 2,8 Å oder besser beugt).
Der Datenanalyseprozess wird im XChemExplorer optimiert, der sich auf die PanDDA-Software zur Erkennung schwacher Bindemittel stützt und es den Benutzern ermöglicht, die Ergebnisse der Screening-Kampagne schnell zu visualisieren und zu überprüfen. XChemExplorer importiert Datenverarbeitungsergebnisse aus den bei Diamond verfügbaren Paketen (DIALS 16, autoPROC 30, STARANISO31 und Xia214) mit Auflösungsgrenzen, die durch die Standardmethode für jedes Paket bestimmt werden (d. h. CC1/2 = 0,3). Standardmäßig basiert die Datensatzauswahl auf einem Score, der aus I/sigI, Vollständigkeit und einer Anzahl eindeutiger Reflexionen berechnet wird, aber spezifische Verarbeitungsergebnisse können sowohl global als auch für einzelne Stichproben ausgewählt werden25. Die Daten werden auch von der Analyse durch PanDDA ausgeschlossen, basierend auf Kriterien wie Auflösung,R-frei und Unterschied im Einheitszellvolumen zwischen Referenz- und Zieldaten (Standardwerte sind 3,5 Å, 0,4 bzw. 12 %), so dass schlecht beugende, falsch zentrierte oder falsch indizierte Kristalle die Analyse nicht beeinträchtigen.
Der PanDDA-Algorithmus nutzt die beträchtliche Anzahl von Datensätzen, die während einer Fragmentkampagne gesammelt werden, um Liganden der Teilbelegung zu erkennen, die in kristallographischen Standardkarten nicht sichtbar sind. Anfänglich verwendet PanDDA Daten, die während der Lösungsmitteltoleranztests und der Pre-Screening-Schritte gesammelt wurden, um eine Karte der durchschnittlichen Dichte zu erstellen, die dann zur Erstellung eines Grundzustandsmodells verwendet wird. Da dieses Modell für alle nachfolgenden Analyseschritte verwendet wird, ist es wichtig, dass es das unligandierte Protein unter den für das Fragment-Screening verwendeten Bedingungen genau repräsentiert. PanDDA verwendet dann eine statistische Analyse, um gebundene Liganden zu identifizieren und eine Ereigniskarte für den gebundenen Zustand des Kristalls zu erstellen. Eine Ereigniskarte wird generiert, indem der ungebundene Anteil des Kristalls aus dem Teilbelegungsdatensatz subtrahiert wird, und stellt dar, was beobachtet würde, wenn der Ligand bei voller Belegung gebunden wäre. Selbst Fragmente, die in herkömmlichen 2mFo-DF c-Karten klar erscheinen, können falsch modelliert werden, wenn die Ereigniskarten nicht konsultiert werden32. Während PanDDA eine leistungsfähige Methode zur Identifizierung von Datensätzen ist, die sich von den durchschnittlichen Karten unterscheiden (was in der Regel auf die Fragmentbindung hinweist) und Metriken wie RSCC, RSZD, B-Faktor-Verhältnis und RMSD während der Verfeinerung zum Nutzen des Benutzers bereitgestellt werden, ist der Benutzer letztendlich dafür verantwortlich, zu entscheiden, ob die beobachtete Dichte den erwarteten Liganden und die am besten geeignete Konformation genau abbildet.
Nach der Datenanalyse und -verfeinerung ist es allen Anwendern möglich, mit dem XChemExplorer gleichzeitig mehrere Strukturen in der Proteindatenbank (PDB) zu hinterlegen. Für jedes Fragment-Screening werden zwei Gruppenablagerungen vorgenommen. Die erste Ablagerung enthält alle fragmentgebundenen Modelle mit Koeffizienten für die Berechnung von PanDDA-Ereigniszuordnungen, die in MMCIF-Dateien enthalten sind. Die zweite Ablagerung liefert das begleitende Grundzustandsmodell, zusammen mit den gemessenen Strukturfaktoren aller Datensätze des Experiments: Diese Daten können zur Reproduktion der PanDDA-Analyse und zur Entwicklung zukünftiger Algorithmen verwendet werden. Was die Strukturen der Treffer betrifft, so ist die Verfeinerung bei geringer Fragmentbelegung besser, wenn die Modelle eine Zusammensetzung der ligandengebundenen und verwirrenden Grundzustandsstrukturensind 32; Nichtsdestotrotz ist es üblich, nur die Bruchteile des gebundenen Zustands zu hinterlegen, da die vollständigen zusammengesetzten Modelle im Allgemeinen komplex und schwer zu interpretieren sind. Infolgedessen sind einige Qualitätsindikatoren, die von der HVE neu berechnet werden (insbesondere R/Rfree), manchmal leicht erhöht. Es ist auch möglich, alle Rohdaten über Plattformen wie Zenodo56 bereitzustellen, obwohl dies derzeit nicht von der XChem-Pipeline unterstützt wird.
Insgesamt konnten seit dem Betrieb im Jahr 2016 in über 95 % der Targets mit diesem Verfahren Fragmentliganden identifiziert werden. Die Erfahrungen aus den vielen Projekten, die XChem unterstützt hat, wurden zu Best Practices für die Kristallpräparation33 destilliert, während eine Fragmentbibliothek entwickelt wurde, die das Konzept zur Unterstützung der Fragmentprogression29 implementierte und auch dazu beitrug, die Praxis der Veröffentlichung der Bibliothekskomposition zu etablieren. Die Plattform hat gezeigt, wie wichtig eine gut gewartete Infrastruktur und dokumentierte Prozesse sind, die hier detailliert beschrieben werden, und hat es ermöglicht, andere Fragmentbibliotheken57,58 zu evaluieren, Bibliotheken48 zu vergleichen und das Design der kollaborativen EUOpenscreen-DRIVE-Bibliothek 59,60 zu informieren.

Fragment-Based Drug Discovery (FBDD) ist eine weit verbreitete Strategie für die Entdeckung von Leitstrukturen, und seit ihrer Entstehung vor 25 Jahren hat sie vier Medikamente für den klinischen Einsatz geliefert und mehr als 40 Moleküle wurden in klinische Studien überführt 1,2,3. Fragmente sind kleine chemische Einheiten, die in der Regel ein Molekulargewicht von 300 Da oder weniger haben. Sie werden aufgrund ihrer geringen chemischen Komplexität ausgewählt, die gute Ausgangspunkte für die Entwicklung von hochligandeneffizienten Inhibitoren mit hervorragenden physikalisch-chemischen Eigenschaften bietet. Aufgrund ihrer Größe beproben sie die Bindungslandschaft von Proteinen gründlicher als Bibliotheken größerer wirkstoff- oder bleiähnlicher Verbindungen und decken so auch Hot Spots und vermeintliche allosterische Stellen auf. In Kombination mit strukturellen Informationen liefern die Fragmente eine detaillierte Karte der möglichen molekularen Wechselwirkungen zwischen Protein und Ligand. Der zuverlässige Nachweis und die Validierung dieser Entitäten, die dazu neigen, schwach an das Zielprotein zu binden, erfordert jedoch eine Reihe robuster und empfindlicher biophysikalischer Screening-Methoden wie die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), die Kernspinresonanz (NMR) oder die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)4,5.
Die Röntgenkristallographie ist ein wesentlicher Bestandteil des FBDD-Toolkits: Sie ist empfindlich genug, um schwache Bindemittel zu identifizieren, und liefert direkt strukturelle Informationen über die Wechselwirkungen auf molekularer Ebene. Es ist komplementär zu anderen biophysikalischen Screenings und in der Regel unerlässlich für das Fortschreiten von Fragmenttreffern zu Bleiverbindungen. Es erfordert qualitativ hochwertige Kristallsysteme, was bedeutet, dass die Kristallisation hochgradig reproduzierbar ist und die Kristalle idealerweise mit einer Auflösung von mehr als 2,8 Å gebeugt werden.
In der Vergangenheit war es sehr schwierig, die Kristallographie als primäres Fragmentsieb zu verwenden 6,7,8, sei es in der Wissenschaft oder in der Industrie. Im Gegensatz dazu erzielten Synchrotrons Verbesserungen um Größenordnungen in der Robotik, Automatisierung 9,10,11 und Detektortechnologie 12,13, und in Kombination mit ebenso beschleunigter Rechenleistung und Algorithmen der Datenverarbeitung14,15,16 können vollständige Beugungsdatensätze in Sekundenschnelle und eine große Anzahl von ihnen völlig unbeaufsichtigt gemessen werden, wie es bei LillyCAT7 der Fall war und später MASSIF17,18 (European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)). Dies führte dazu, dass Synchrotrons hochgradig optimierte Plattformen entwickelten, um das kristallbasierte Fragment-Screening als primären Bildschirm für eine breite Benutzergemeinschaft zugänglich zu machen (XChem bei Diamond; CrystalDirect auf der EMBL/ESRF19; BESSY am Helmholtz-Zentrum Berlin20; FragMax bei MaxIV21).
Dieser Artikel dokumentiert die Protokolle, die die XChem-Plattform für das Fragment-Screening durch Röntgenkristallographie ausmachen, von der Probenvorbereitung bis zu den endgültigen strukturellen Ergebnissen von 3D-modellierten Treffern. Die Pipeline (Abbildung 1) erforderte die Entwicklung neuer Ansätze für die Kristallidentifikation 22, das Einweichen23 und die Ernte24 sowie eine Datenmanagementsoftware 25 und einen algorithmischen Ansatz zur Identifizierung von Fragmenten 26, der heute in der Community weit verbreitet ist. Die Technologie zur Kristallernte wird jetzt von einem Anbieter verkauft (siehe Materialtabelle), und die offene Verfügbarkeit der Werkzeuge hat es anderen Synchrotrons ermöglicht, sie anzupassen, um gleichwertige Plattformen einzurichten21. Laufende Projekte befassen sich mit der Datenanalyse, Modellvervollständigung und Datenverbreitung über die Fragalysis-Plattform27. Das Probenvorbereitungslabor befindet sich neben der Beamline I04-1, was die Logistik für die Übertragung von Hunderten von gefrorenen Proben an die Beamline vereinfacht, und die dedizierte Strahlzeit auf I04-1 ermöglicht eine schnelle Röntgenrückkopplung zur Steuerung der Kampagne.
XChem ist ein integraler Bestandteil des Anwenderprogramms von Diamond, mit zwei Aufrufen pro Jahr (Anfang April und Oktober). Der Peer-Review-Prozess wurde in Absprache mit Experten für Arzneimittelforschung aus Wissenschaft und Industrie verfeinert. Neben einem überzeugenden wissenschaftlichen Argument verlangt das Antragsverfahren28 von den Antragstellern, dass sie nicht nur die Bereitschaft des Kristallsystems selbst bewerten, sondern auch ihr Fachwissen in biochemischen und orthogonalen biophysikalischen Methoden und ihre Fähigkeit, Screening-Treffer durch Follow-up-Chemie voranzutreiben. Auch die Zugriffsarten haben sich weiterentwickelt, um der multidisziplinären Nutzergemeinschaft gerecht zu werden:
Stufe 1 (Einzelprojekt ) ist für Projekte in der Sondierungsphase vorgesehen, und Hit-Validierungsinstrumente (biophysikalische oder biochemische Instrumente) und Follow-up-Strategien müssen nicht vorhanden sein. Wenn das Projekt angenommen wird, wird eine reduzierte Anzahl von Strahlzeitverschiebungen gewährt, die für den Proof of Concept ausreicht.
Stufe 2 (Einzelprojekt) ist für gut validierte Projekte gedacht und erfordert nachgelagerte Tools und Follow-up-Strategien. Wenn das Projekt angenommen wird, erhält es genügend Strahlzeit für eine vollständige Fragment-Screening-Kampagne. Einzelne Projekte (Tier 1 oder Tier 2) müssen innerhalb von 6 Monaten des Zuteilungszeitraums (entweder April bis September oder Oktober bis März) abgeschlossen werden.
Die Block Allocation Group (BAG) ist für Konsortien von Gruppen und Projekten gedacht, bei denen ein robuster Zielauswahl- und Priorisierungsprozess innerhalb des BAG sowie eine klare Follow-up-Pipeline vorhanden sind. BAGs müssen über mindestens einen vollständig XChem-geschulten Experten (Superuser) verfügen, der ihre Aktivitäten mit den Diamond-Mitarbeitern koordiniert und die BAG-Mitglieder schult. Die zugeteilte Anzahl der Strahlzeitverschiebungen wird durch die Anzahl der wissenschaftlich starken Projekte im BAG definiert und pro Vergabezeitraum auf Basis des Berichts des BAG neu bewertet. Der Zugang ist für 2 Jahre verfügbar.
Das XChem-Experiment ist in drei Phasen unterteilt, für die jeweils ein Entscheidungspunkt festgelegt ist: Lösungsmitteltoleranztest, Vorsieb und Hauptbildschirm (Abbildung 2). Der Lösungsmitteltoleranztest hilft dabei, die Einweichparameter, die Menge des Lösungsmittels (DMSO, Ethylenglykol oder andere Kryoprotektoren, falls erforderlich) zu definieren, die das Kristallsystem tolerieren kann und wie lange. Lösungsmittelkonzentrationen liegen in der Regel zwischen 5 % und 30 % über mindestens zwei Zeitpunkte. Beugungsdaten werden gesammelt und mit der Basisbeugung des Kristallsystems verglichen; Dadurch werden die Einweichparameter für die folgende Phase bestimmt. Für das Vorsieb werden 100-150 Verbindungen unter den im Lösungsmitteltest festgelegten Bedingungen eingeweicht, um zu bestätigen, dass die Kristalle die Verbindungen unter diesen Bedingungen vertragen können. Bei Bedarf wird das Kryoprotektivum anschließend zu den Tropfen gegeben, die bereits die Fragmente enthalten. Das Erfolgskriterium ist, dass 80 % oder mehr der Kristalle gut genug überleben, um Beugungsdaten von guter und gleichbleibender Qualität zu liefern. Wenn dies fehlschlägt, werden die Einweichbedingungen in der Regel durch Änderung der Einweichzeit oder der Lösungsmittelkonzentration überarbeitet. Nach einem erfolgreichen Pre-Screening können die restlichen für das Experiment ausgewählten Verbindungen anhand der finalen Parameter eingestellt werden.
Die DSI-Bibliothek (siehe Materialtabelle) wurde speziell entwickelt, um eine schnelle Nachverfolgung mit Hilfe der Chemie29 zu ermöglichen, und war das Arbeitspferd der Einrichtung. Es steht Anwendern in einer Konzentration von 500 mM in DMSO zur Verfügung. Akademische Nutzer können auch auf andere Bibliotheken zugreifen, die von Kooperationspartnern bereitgestellt werden (insgesamt über 2.000 Verbindungen) in Konzentrationen von 100-500 mM in DMSO (eine vollständige Liste finden Sie auf der Website28). Ein Großteil der Gesamtkollektion ist auch in Ethylenglykol erhältlich, für Kristallsysteme, die DMSO nicht vertragen. Benutzer können auch ihre eigenen Bibliotheken mitbringen, sofern sie sich in Platten befinden, die mit dem akustischen Liquid-Handling-System kompatibel sind (siehe Materialtabelle).
Für alle drei Schritte des Experiments (Lösungsmittelcharakterisierung, Pre-Screen oder Vollbild) sind die folgenden Probenvorbereitungsverfahren identisch (Abbildung 3): Auswahl des Abgabeortes der Verbindung durch Bildgebung und Targeting der Kristallisationstropfen mit TeXRank22; Abgabe in Tropfen unter Verwendung des akustischen Flüssigkeitsabgabesystems sowohl für Lösungsmittel als auch für Verbindungen23; effizientes Ernten der Kristalle mit dem Crystal Shifter24; und Hochladen von Probeninformationen in die Beamline-Datenbank (ISPyB). Die derzeitige Schnittstelle für die Versuchsplanung und -durchführung ist eine Excel-basierte Anwendung (SoakDB), die die notwendigen Eingabedateien für die verschiedenen Geräte der Plattform generiert und alle Ergebnisse in einer SQLite-Datenbank verfolgt und aufzeichnet. Barcode-Scanner werden in verschiedenen Phasen des Prozesses verwendet, um die Nachverfolgung von Proben zu unterstützen, und diese Daten werden der Datenbank hinzugefügt.
Die Beugungsdaten werden im unbeaufsichtigten Modus mit dedizierter Strahlzeit auf der Beamline I04-1 erfasst. Es stehen zwei Zentriermodi zur Verfügung, nämlich optisch und röntgenbasiert17. Für nadel- und stäbchenförmige Kristalle wird eine Röntgenzentrierung empfohlen, während klobigere Kristalle im Allgemeinen den optischen Modus unterstützen, der schneller ist und es daher ermöglicht, mehr Proben in der zugewiesenen Strahlzeit zu sammeln. Abhängig von der Auflösung der Kristalle (die vor dem Betreten der Plattform festgelegt wurde) kann die Datenerfassung entweder 60 s oder 15 s Gesamtbelichtung betragen. Die Datenerfassung während der Lösungsmitteltestphase gibt in der Regel Aufschluss darüber, welche Kombination am besten zur Leistung der Beamline I04-1 passt.
Das große Volumen der Datenanalyse wird über den XChemExplorer (XCE)25 verwaltet, der auch zum Starten des Trefferidentifikationsschritts mit PanDDA26 verwendet werden kann. XCE ist ein Datenmanagement- und Workflow-Tool, das die groß angelegte Analyse von Protein-Liganden-Strukturen unterstützt (Abbildung 4). Es liest alle Ergebnisse der automatischen Verarbeitung aus Daten, die an der Diamond Light Source (DIALS16, Xia214, AutoPROC30 und STARANISO31) gesammelt wurden, und wählt automatisch eines der Ergebnisse basierend auf der Datenqualität und der Ähnlichkeit mit einem Referenzmodell aus. Es ist wichtig, dass das Modell repräsentativ für das Kristallsystem ist, das für das XChem-Screening verwendet wird, und alle Wässer oder andere Lösungsmittelmoleküle sowie alle Cofaktoren, Liganden und alternativen Konformationen enthalten muss, die in Kristallen sichtbar sind, die nur mit Lösungsmittel getränkt sind. Die Qualität dieses Referenzmodells wirkt sich direkt auf den Arbeitsaufwand aus, der während der Modellerstellungs- und -verfeinerungsphase erforderlich ist. PanDDA wird verwendet, um alle Daten zu analysieren und Bindungsstellen zu identifizieren. Es richtet Strukturen an einer Referenzstruktur aus, berechnet die statistischen Karten, identifiziert Ereignisse und berechnet Ereigniskarten26,32. Im PanDDA-Paradigma ist es weder notwendig noch wünschenswert, ein vollständiges kristallographisches Modell zu erstellen. Was modelliert werden muss, ist nur die Ansicht des Proteins, an das ein Fragment gebunden ist (das Bound-State-Modell), so dass der Fokus nur auf dem Aufbau des Liganden und der umgebenden Reste/Lösungsmittelmoleküle gemäß der Ereigniskarte32 liegen muss.

<table><tbody><tr><td>DSI-poised library</td><td>Enamine</td><td>DSI-896</td><td>Fragmentbibliothek</td></tr><tr><td>Echo 550 und 650 Serien</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td>akustisches Dosiersystem</td></tr><tr><td>Echo Mikrotiterplatten</td><td>Beckman-Coulter</td><td>001-12380; 001-8768; 001-6025</td><td>1536-Well- und 384-Well-Mikrotiterplatten</td></tr><tr><td>Shifter</td> Oxford <td>Lab Technology</td><td></td><td>Entnahmegerät</td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten Zentrifuge mit Ausschwingrotor</td><td>Sigma</td><td>Modell 11121</td><td>Mikrotiterplatten-Zentrifuge</td></tr><tr><td>3-Tropfen-Kristallisationsplatten</td><td>Swissci</td><td>3W96T-UVP</td><td>Kristallisationsplatten</td></tr><tr><td>Formulatrix Plate Imager und Rockmaker Software</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>Crystallisation Plates Imaging Device</td></tr></tbody></table>

effizientes fragment-screening in der xchem-anlage an der diamond light source

Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source

Bei der fragmentbasierten Wirkstoffforschung werden Hunderte oder oft Tausende von Verbindungen, die kleiner als ~300 Da sind, gegen das interessierende Protein getestet, um chemische Einheiten zu identifizieren, die zu potenten Wirkstoffkandidaten entwickelt werden können. Da die Verbindungen klein sind, sind die Wechselwirkungen schwach, und die Screening-Methode muss daher hochempfindlich sein. Darüber hinaus sind strukturelle Informationen in der Regel entscheidend, um diese Treffer in bleiähnliche Verbindungen umzuwandeln. Daher war die Proteinkristallographie schon immer ein Goldstandard, aber historisch gesehen zu schwierig, um eine breite Anwendung als primäres Screening zu finden.
Erste XChem-Experimente wurden 2014 demonstriert und dann mit akademischen und industriellen Mitarbeitern getestet, um den Prozess zu validieren. Seitdem haben ein großer Forschungsaufwand und eine beträchtliche Strahlzeit die Probenvorbereitung rationalisiert, eine Fragmentbibliothek mit schnellen Follow-up-Möglichkeiten entwickelt, die Fähigkeit der I04-1-Beamline für die unbeaufsichtigte Datenerfassung automatisiert und verbessert und neue Werkzeuge für das Datenmanagement, die Analyse und die Identifizierung von Treffern implementiert.
XChem ist jetzt eine Anlage für das Screening von kristallographischen Fragmenten in großem Maßstab, die den gesamten Prozess von der Kristallerzeugung bis zur Abscheidung unterstützt und für akademische und industrielle Anwender weltweit zugänglich ist. Das von Experten begutachtete akademische Nutzerprogramm wird seit 2016 aktiv weiterentwickelt, um Projekte mit einem möglichst breiten wissenschaftlichen Spektrum zu unterstützen, einschließlich gut validierter und explorativer Projekte. Der akademische Zugang wird durch halbjährliche Aufrufe zur Einreichung von Peer-Review-Vorschlägen vergeben, und proprietäre Arbeiten werden von der Industrial Liaison Group von Diamond arrangiert. Dieser Workflow wurde bereits routinemäßig auf über hundert Targets aus verschiedenen therapeutischen Bereichen angewendet und identifiziert effektiv schwache Bindemittel (1%-30% Trefferrate), die sowohl als hochwertige Ausgangspunkte für das Compound-Design dienen als auch umfangreiche strukturelle Informationen über Bindungsstellen liefern. Die Widerstandsfähigkeit des Prozesses wurde durch ein kontinuierliches Screening von SARS-CoV-2-Zielen während der COVID-19-Pandemie demonstriert, einschließlich einer 3-wöchigen Bearbeitungszeit für die Hauptprotease.

Die XChem-Pipeline für das Fragment-Screening durch Röntgenkristallographie wurde umfassend gestrafft, so dass sie von der wissenschaftlichen Gemeinschaft übernommen werden kann (Abbildung 5). Dieser Prozess wurde bei über 150 Screening-Kampagnen mit einer Trefferquote zwischen 1 % und 30 % validiert47,48,49,50,51,52 und von vielen Wiederholungsnutzern. Kristallsysteme, die nicht geeignet sind (geringe Auflösung, inkonsistent in der Kristallisation oder in der Beugungsqualität) oder weder DMSO noch Ethylenglykol vertragen, werden frühzeitig im Prozess eliminiert, was Zeit, Aufwand und Ressourcen spart. Erfolgreiche Kampagnen liefern eine dreidimensionale Karte potenzieller Interaktionsstellen auf dem Zielprotein; Ein typisches Ergebnis ist das XChem-Screening der Hauptprotease von SARS-CoV-2 (Abbildung 6). Typischerweise werden Fragmenttreffer gefunden in: (a) bekannten Stellen von Interesse, wie z. B. enzymaktiven Zentren und Untertaschen48; (b) mutmaßliche allosterische Stellen, z. B. bei Protein-Protein-Wechselwirkungen53; (c) Kristallpackungsschnittstellen, die im Allgemeinen als falsch positiv angesehen werden (Abbildung 6). Diese Strukturdaten bilden im Allgemeinen die Grundlage für die Verschmelzung, Verknüpfung oder Vergrößerung von Fragmenttreffern zu bleiartigen kleinen Molekülen 1,3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig01.jpg"> Abbildung 1: Die XChem-Pipeline. Die Plattform wird schematisch vom Projektvorschlag über die Probenvorbereitung und Datenerfassung bis hin zur Trefferidentifikation dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig02.jpg"> Abbildung 2: Screening-Strategie. Der Workflow gibt den Zweck jedes Meilensteins, die Anforderungen des Experiments und die Entscheidungspunkte an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig03.jpg"> Abbildung 3: Arbeitsablauf bei der Probenvorbereitung. Kritische Schritte für die Probenvorbereitung werden dargestellt, wobei Informationen aus jedem Schritt in einer SQLite-Datenbank aufgezeichnet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig04.jpg"> Abbildung 4: Datenanalyse mit XCE. Kritische Schritte in der Datenanalyse werden durch ein Workflow-Diagramm mit den entsprechenden Softwarepaketen dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig05.jpg"> Abbildung 5: Entwicklung des XChem-Benutzerprogramms: Die Grafik zeigt die Akzeptanz und Konsolidierung des Benutzerprogramms von 2015 bis 2019 mit der Schaffung von BAGs im Jahr 2019 und die Widerstandsfähigkeit der Plattform während der COVID-19-Pandemie im Jahr 2020. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig06.jpg"> Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse des XChem-Fragment-Screenings. Das Dimer der SARS-CoV2-Hauptprotease (Mpro) ist in der Oberfläche dargestellt, wobei die Treffer des aktiven Zentrums gelb, die mutmaßlichen allosterischen Treffer in Magenta und die Oberflächen-/Kristallpackungsartefakte grün dargestellt sind. Die Abbildung wurde unter Verwendung von Chimera- undM-pro-PDB-Einträgen aus der Gruppenablagerung G_1002156 erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieser Artikel beschreibt den kompletten XChem-Prozess für kristallbasiertes Fragment-Screening, beginnend mit der Beantragung des Zugangs und allen nachfolgenden Schritten bis hin zur Datenverbreitung.

Effizientes Fragment-Screening in der XChem-Anlage an der Diamond Light Source

In fragment-based drug discovery, hundreds or often thousands of compounds smaller than ~300 Da are tested against the protein of interest to identify ...

Die XChem-Anlage an der Diamond Light Source bietet ein routinemäßiges, großflächiges Kristall-Grafik-Fragment-Screening, das den gesamten Prozess der Kristallabscheidung unterstützt. Die Röntgenkristallographie ist ein wesentlicher Bestandteil des FBDD-Toolkits. Es ist empfindlich genug, um schwache Bindemittel zu identifizieren und liefert direkt strukturelle Informationen über die Wechselwirkungen auf molekularer Ebene.Die fragmentbasierte Wirkstoffforschung ist eine weit verbreitete Strategie für die Entdeckung von Leitstrukturen. Das Unternehmen hat sechs Medikamente für den klinischen Einsatz geliefert und mehr als 50 Moleküle wurden in klinische Studien überführt. Die Auswirkungen der Fortschritte und der Effizienz, die die XChem-Plattform im Vergleich zu herkömmlichen Einweichmethoden, Datenerfassungs- und Analysemethoden bietet, lassen sich am besten visuell veranschaulichen.Beginnen Sie mit der Auswahl der Kristalle und der Position der Verbindung. Öffnen Sie TextRank auf einem PC und wählen Sie das Kristallfach aus, entweder aus der Liste unten rechts oder indem Sie den Barcode in das Feld oben links eingeben. Wählen Sie das richtige Bildformat und die einzelne Well-Ansicht aus.Um Lösungsmittel oder Verbindungen zu einem Tropfen hinzuzufügen, ohne den Kristall zu treffen, klicken Sie mit der rechten Maustaste innerhalb des Tropfens, aber weg vom Kristall, wenn ein geeigneter Kristall für ein Experiment gefunden wird, während Sie sich durch die Tropfenbilder bewegen. Öffnen Sie die Echo-Software und wählen Sie Neu aus, um Lösungen mit dem akustischen Spender zu dosieren. Wählen Sie die richtige Quellwellenplatte und die richtige Flüssigkeitsklasse.Stellen Sie sicher, dass der richtige Plattentyp als Zielplatte ausgewählt ist. Aktivieren Sie dann das benutzerdefinierte Kontrollkästchen und fahren Sie fort. Wählen Sie Importieren aus, und wählen Sie die entsprechende Batchdatei aus.Führen Sie dann die Importschritte aus, wie von der Software gefordert. Verwenden Sie die Plattenkarten, um die zu dosierende Lösung und die Bestimmungsorte zu überprüfen. Führen Sie dann das Protokoll aus, indem Sie den Eingabeaufforderungen folgen, sobald sie angezeigt werden.Die Lösungen von der Ausgangsplatte werden in die ausgewählten Kristalltropfen abgegeben. Bewahren Sie die Platte für die erforderliche Zeit im Inkubator auf. Um die Kristalle mit dem halbautomatischen Kristallerntegerät zu ernten, drücken Sie die Schaltfläche "Arbeitsablauf starten", um zur ersten ausgewählten Well-Position zu gelangen.Wenn der Kristall überlebt hat, montieren Sie ihn in der Schleife und tauchen Sie ihn in den flüssigen Stickstoff, um ihn auf Position eins im ersten Puck in der Liste zu platzieren. Wählen Sie in der Benutzeroberfläche die entsprechende Beschreibung für den Kristall aus. Wenn es sich bei dem Tropfen um ein zusammengesetztes Einweichen handelt, notieren Sie die Beschreibung des zusammengesetzten Zustands.Wenn der Quarz erfolgreich gemountet wurde, wählen Sie mounted aus, andernfalls wählen Sie fail. Sobald die Kristalle geerntet sind, bringen Sie die Pucks zum Barcode-Scanner und legen Sie sie einzeln in den Halter, um den Puck zu scannen und die Barcodes anzuheften. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, legen Sie die Deckel auf die Pucks und lagern Sie sie in einem Flüssigstickstoff-Lagerdewar.Um die falsch zentrierten Samples zu erfassen, sehen Sie sich die Sample-Wechsler-Ansicht in ISPyB an und wählen Sie Ranking by AP Resolution, um die Samples nach automatisch verarbeiteter Auflösung in einer Farbabstufung von Grün bis Rot zu bewerten. Klicken Sie auf die Proben, um zu prüfen, ob rote oder gelbe Proben vorhanden sind. Überprüfen Sie dann die Kristall-Schnappschüsse, um zu sehen, ob der Kristall zentriert wurde.Um die Ergebnisse der automatischen Verarbeitung von Diamond über XChem Explorer oder XCE abzurufen und zu analysieren, gehen Sie in einem Terminal in den Unterordner processing und verwenden Sie den Alias XCE, um XChem Explorer zu öffnen. Wählen Sie auf der Registerkarte "Übersicht" die Schaltfläche "Tabellen aus Datenquelle aktualisieren" aus, um die Zusammenfassung der experimentellen Daten zu aktualisieren. Wählen Sie auf der Registerkarte "Einstellungen" das Datenerfassungsverzeichnis aus, und öffnen Sie die Registerkarte "Datasets".Wählen Sie das Ziel aus dem Dropdown-Menü "Ziel auswählen" aus, wählen Sie im Dropdown-Menü "Datensätze" die Option "Neue Ergebnisse aus der automatischen Verarbeitung abrufen" aus und klicken Sie auf "Ausführen". Um die ersten Karten mit Dimple zu berechnen, öffnen Sie die Registerkarte Karten, wählen Sie das Referenzmodell aus dem Dropdown-Menü aus und wählen Sie die gewünschten Datensätze aus, gefolgt von der Ausführung von Dimple für ausgewählte MTZ-Dateien. Um Ligandenbeschränkungen zu generieren, wählen Sie die gewünschten Datensätze aus und erstellen Sie dann eine SCF-, PDB- oder PNG-Datei ausgewählter Verbindungen aus der Dropdown-Liste Karten und Beschränkungen.Um Treffer mit Panda zu identifizieren, wählen Sie die Registerkarte Pandas, stellen Sie sicher, dass das Ausgabeverzeichnis korrekt definiert ist, und führen Sie panda aus. Analysieren Sie aus dem Dropdown-Menü zur Trefferidentifikation. Um die von Panda identifizierten Treffer zu analysieren, führen Sie panda aus.Inspizieren aus dem Dropdown-Menü Trefferidentifikation. So öffnen Sie Blässhuhn mit dem Panda-Bedienfeld. Lastdurchschnitt und 2mFo-DFc-Karten von Dimple zum Vergleich mit der Ereigniskarte und dem Modell.Sobald ein Ligand angepasst wurde, klicken Sie auf Ligand mit Modell zusammenführen und Modell speichern, bevor Sie zu einem anderen Ereignis navigieren, um zu vermeiden, dass Änderungen am gebundenen Zustandsmodell verloren gehen. Kommentieren Sie das Bindungsereignis mithilfe des Ereigniskommentarfelds, und kommentieren Sie die Bindungswebsites mithilfe von Datensatzwebsiteinformationen. Nachdem alle lebensfähigen Liganden modelliert, zusammengeführt und basierend auf der Ereigniskarte gespeichert wurden, schließen Sie panda.inspect.Exportieren Sie die Panda-Inspektionsmodelle zurück in das Projektverzeichnis und starten Sie eine erste Runde der Verfeinerung für die ausgewählten Datensätze, und die Verfeinerung wird jetzt auf der Registerkarte Verfeinerung angezeigt. Die XChem-Pipeline für das Fragment-Screening durch Röntgenkristallographie wurde umfassend gestrafft, so dass sie von der wissenschaftlichen Gemeinschaft übernommen werden kann. Dieses Diagramm zeigt die Akzeptanz und Konsolidierung des Benutzerprogramms von 2015 bis 2019 mit der Schaffung von Blockzuweisungsgruppen im Jahr 2019 und die Widerstandsfähigkeit der Plattform während der COVID-19-Pandemie im Jahr 2020.Erfolgreiche Kampagnen liefern eine dreidimensionale Karte potenzieller Interaktionsstellen auf dem Zielprotein. Ein typisches Ergebnis ist das XChem-Screening der Hauptprotease von SARS-CoV-2. Die bekannten Sites of Interest, wie z.B. Enzymaktivstellen und Subtaschen, sind gelb dargestellt.Die mutmaßlichen allosterischen Stellen, wie sie an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind, sind in Magenta dargestellt, und Kristallpackungsgrenzflächen, die im Allgemeinen als falsch positiv angesehen werden, sind grün dargestellt. In der Vergangenheit war es schwierig, die Kristallographie als primäres Fragmentsieb zu verwenden. Diese Studie dokumentierte die XChem-Pipeline-Protokolle von der Probenvorbereitung bis zu den endgültigen Strukturen.Das kristallographische Fragment-Screening ergänzt andere biophysikalische Techniken und ist in der Regel unerlässlich, um Fragmenttreffer zu Bleiverbindungen zu entwickeln. Es kann auf jede Zielklasse in der Wirkstoffforschung angewendet werden.

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Research

Forschung

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Chemistry

Chemie

13-BM-C-Strahlrohr an der Einkristall-Röntgenbeugungsexperimente mit einer Diamantstempelzelle aus GSECARS an der Advanced Photon Source In diesem Bericht beschreiben wir detaillierte Verfahren für die Durchführung. ATREX und RSV-Programme werden verwendet, um die Daten zu analysieren.

High Pressure Einkristalldiffraktometrie bei PX ^ 2

Eine optimierte Protokoll für die Durchführung einer umfangreichen biochemischen und strukturelle Charakterisierung von ein Kohlenhydrat-Substrat-Bindeprotein von Streptococcus Pneumoniae wird vorgestellt.

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Wir beschreiben eine Strahlrohr Setup soll schnelle zweidimensionale Röntgen Fluoreszenz und x-ray Microdiffraction Zuordnung von Einzelproben Kristall oder Pulver mit Laue (polychromatische Strahlung) oder Pulver (monochromatische Strahlung) Beugung durchzuführen. Die resultierenden Karten geben Auskunft über die Belastung, Orientierung und Phasenverteilung plastische Verformung.

Synchrotron Röntgenstrahl Microdiffraction und Fluoreszenz-Bildgebung von Mineral- und Gesteinsproben

Wir bieten einen allgemeinen Überblick über quantitative Mikroanalysemethoden zur Schätzung der Standortbelegung von Verunreinigungen und deren chemischen Zuständen, indem wir Elektronenkanalisierungsphänomene unter einfallenden Elektronenstrahl-Gesteinsbedingungen nutzen, die zuverlässig Informationen von Minderheitenarten, Lichtelementen, Sauerstoffleerständen und anderen Punkt-/Linien-/Planardefekten extrahieren.

Quantitative Atom-Standortanalyse von funktionellen Dopants/Punktdefekten in kristallinen Materialien durch Elektronenkanaling-verstärkte Mikroanalyse

Wir präsentieren einen umfassenden Leitfaden für die Vorbereitung, Datenerfassung und Datenverarbeitung von Festnetzproben für die serielle Synchrotronkristallographie an der Diamond Beamline I24.

Feste serielle Zieldatenerfassung an der Diamond Light Source

Das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin erfolgt über einen Workflow mit dedizierten Compound-Bibliotheken, Kristall-Handling-Tools, schnellen Datenerfassungsmöglichkeiten und weitgehend automatisierter Datenanalyse. Das vorgestellte Protokoll zielt darauf ab, den Output solcher Experimente zu maximieren, um vielversprechende Ansatzpunkte für das nachgelagerte strukturbasierte Ligandendesign zu schaffen.

Workflow und Tools für das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin

Das Signal-Rausch-Verhältnis von Daten ist eine der wichtigsten Überlegungen bei der Durchführung von Röntgenbeugungsmessungen an Mikrokristallen. Die VMXm-Beamline bietet eine geräuscharme Umgebung und mikrostrahlend für solche Experimente. Hier beschreiben wir Probenvorbereitungsmethoden zur Montage und Kühlung von Mikrokristallen für VMXm und andere makromolekulare Kristallographie-Beamlines mit Mikrofokus.

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

Hier stellen wir ein Protokoll für die kryogene Probenvorbereitung und den Transfer von Kristallen in die Vakuumendstation auf der Beamline I23 an der Diamond Light Source für langwellige makromolekulare Röntgenkristallographie-Experimente vor.

Probenvorbereitungs- und Übertragungsprotokoll für die In-Vakuum-Langwellenkristallographie auf der Beamline I23 an der Diamantlichtquelle

Die Überwachung von Änderungen der Schmelztemperatur eines Zielproteins(z. B.Thermal Shift Assay, TSA) ist eine effiziente Methode zum Screening von Fragmentbibliotheken von einigen hundert Verbindungen. Wir präsentieren ein TSA-Protokoll, das eine robotergestützte Nano-Differential Scanning Fluorimetry (Nano-DSF) zur Überwachung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz und der Lichtrückstreuung für das Fragmentscreening implementiert.

Nano-Differential-Scanning-Fluorimetrie für das Screening in der fragmentbasierten Lead-Discovery

Hier beschreiben wir, wie die automatisierten makromolekularen Kristallographie-Pipelines für Protein-zu-Struktur, schnelle Liganden-Protein-Komplex-Analyse und großflächiges Fragment-Screening basierend auf der CrystalDirect-Technologie im HTX-Labor in EMBL Grenoble verwendet werden können.

Die automatisierten Kristallographie-Pipelines in der EMBL HTX-Anlage in Grenoble

Wir präsentieren ein Protokoll für die Kristallisation von Proteinen unter Verwendung der Kristallisationsanlage im Forschungskomplex in Harwell und die anschließende in-situ-Röntgenkristallographie-Datenerfassung von Kristallen innerhalb der Platten an der Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) Beamline von Diamond.  Wir beschreiben Probenanforderungen, Kristallisationsprotokolle und Richtlinien für die Datenerfassung.

Kristallisations- und In-situ-Raumtemperatur-Datenerfassung mit der Kristallisationsanlage in Harwell und der Beamline VMXi, Diamantlichtquelle

Erfahren Sie das XChem-Verfahren für kristallbasiertes Fragment-Screening mit Röntgenkristallographie. Diese Methode unterstützt die Arzneimittelforschung durch effiziente Identifizierung schwacher Bindungen.

Effizientes Fragment-Screening in der XChem-Anlage an der Diamond Light Source

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