Name: 小鼠肝细胞类器官的建立与遗传操作 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: 了解小鼠肝细胞类器官的建立与遗传操作方法，包括肝脏灌注消化、细胞培养传代及CRISPR-Cas9基因编辑技术。该方法为肝脏疾病研究和药物开发提供可靠的体外模型。

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我们感谢Hans Clevers教授慷慨提供用于生产重组R-spondin1的细胞系。本工作得到了国家重点研发计划项目、国家自然科学基金&amp;中国国家重点研发计划（2019YFA0111400）、国家自然科学基金（31970779）和山东大学青年交叉创新研究群体基金（2020QNQT003）资助，资助对象为 H.H.

所有小鼠实验均经山东大学基础医学院动物护理与使用委员会批准，并依照英国国内事务部指南和法规许可（编号：ECSBMSSDU2019-2-079）进行。
注意：本方案主要用于培养自分离的原代肝细胞形成的三维类器官。
1. 小鼠肝细胞类器官培养的建立
注意：使用基底膜基质（如 Matrigel 或 BME）作为类器官培养的基底基质。将细胞外基质在 -20 °C 下保存，并在 4 °C 或冰上预先解冻。实验过程中须将细胞外基质置于冰上保存。洗涤培养基为添加 GlutaMAX、HEPES 和青霉素/链霉素的 Advanced DMEM/F12。类器官培养使用标准培养箱（37 °C，加湿环境，5% CO2）。
<ol>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>准备实验所需仪器：小鼠固定枕、无菌手术器械（如镊子、剪刀）、离心管以及流速为 2–10 mL/min 的泵。</li>
		<li>准备灌注缓冲液和消化缓冲液，并进行无菌处理以用于肝细胞分离。加入新鲜的 IV 型胶原酶（0.10 mg/mL）和 CaCl2（0.50 M），并在水浴中预热至 37 °C。</li>
		<li>根据制造商说明书制备含 R-spondin 1 的条件培养基以及所有化学试剂和生长因子储备液。 
		注意：避免反复冻融条件培养基和储备液。培养基应新鲜配制，并在一个月内使用完毕，这对类器官形成效率至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过肝脏灌注与消化分离小鼠肝细胞 
	注意：用于类器官培养的小鼠年龄范围为 12 周至 6 个月，雌雄均可。在此年龄段内，供体小鼠年龄对类器官形成效率无明显影响。
	<ol>
		<li>采用符合伦理批准的方法处死小鼠。</li>
		<li>将小鼠固定于小鼠枕上，用 70% 酒精清洁腹部毛发和皮肤。暴露腹腔，提起肝脏使其高于其他组织，沿中线切开以暴露肝脏。</li>
		<li>将连接泵的导管中充满灌注缓冲液。在门静脉上做一切口（约为静脉直径的 1/3），小心插入导管。提起消化器官以协助插管。可选择使用手术线结扎固定，以防导管滑脱或破裂。</li>
		<li>启动泵，以 5–7 mL/min 的流速用灌注缓冲液进行灌注。若肝脏迅速变苍白，剪开下腔静脉，使灌注液流经整个肝脏并排出血液。</li>
		<li>当流出液变得澄清时，移除导管。此过程约需 5–10 分钟。</li>
		<li>以 5 mL/min 的流速更换为预热的消化缓冲液。在肝脏变软并开始肿胀前不要停止泵送。当肝脏停止肿胀时，移除导管。 
		注意：严格控制消化时间至关重要，以避免过度消化，从而获得单个肝细胞。</li>
		<li>切除肝脏并置于盛有 15 mL 冷洗涤液的 100 mm 培养皿中。用小剪刀剪断韧带，用移液枪头或镊子将肝脏撕成小块。</li>
		<li>轻柔吹打 12–15 次，使细胞充分释放，直至缓冲液中细胞饱和。将细胞悬液经 70 µm 滤网过滤后收集至 50 mL 离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 50 × g 离心 1–3 分钟，弃去上清液。可选步骤：用洗涤液重悬细胞，或直接用培养基重悬。使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
		<li>经活细胞染料染色后，使用细胞计数仪区分活细胞与死细胞。 
		注意：最好使用冷的 40% Percoll 溶液纯化肝细胞。此步骤后，活肝细胞将沉淀于离心管底部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官培养与传代
	<ol>
		<li>弃去上清液，将肝细胞用细胞外基质与培养基按 3:1 比例混合的溶液重悬。 
		注意：建议每孔加入 50–60 µL 混合液，含 10,000–20,000 个细胞，适用于 24 孔板。操作过程应迅速，并始终保持混合液处于冰上。在此浓度下可形成 200–500 个类器官。</li>
		<li>将细胞混合液以小液滴形式加入培养板，避免液滴相互连接。将培养板置于 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中孵育 5–10 分钟，然后取出静置 20–25 分钟，直至细胞外基质凝固。</li>
		<li>向各孔中加入培养基（24 孔板每孔 500 µL），将培养板放回培养箱继续培养类器官。每 3–4 天更换一次培养基。观察类器官生长，直至其达到可传代的大小。 
		注意：肝细胞类器官直径达到约 400–500 µm 时适合传代。</li>
		<li>按照以下详细步骤从细胞外基质中分离类器官。将玻璃巴斯德吸管在火焰上加热，使其尖端口径缩小约一半。传代过程中，通过机械吹打 5–10 次，将类器官解离为更小的类器官。 
		注意：传代时应提前准备好经预清洗的微量移液枪头和离心管，并在其中加入枪头清洗缓冲液，以防止类器官黏附于管壁或枪头造成损失。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠肝细胞类器官的遗传学操作
<ol>
	<li>肝细胞类器官的单细胞制备
	<ol>
		<li>向每孔中加入 500 µL 冷的洗涤培养基/细胞回收溶液。使用移液器反复吹打，破坏细胞与细胞外基质的混合物，然后将类器官悬液转移至预冷的 15 mL 离心管中。可选：不时颠倒离心管，以充分解冻混合物。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 500–800 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。向沉淀中加入 1 mL 胰蛋白酶溶液，并吹打混匀。在 37 °C 下孵育 5–10 分钟，然后加入 2 倍体积的洗涤培养基终止消化。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 800 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。用培养基重悬细胞沉淀，并使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>siRNA 或质粒转染 
	&#8203;注意：直径小于 50 µm 的小型类器官或肝细胞类器官来源的单细胞，可根据制造商说明书，使用 Lipofectamine 转染 siRNA，或使用转染试剂转染质粒。
	<ol>
		<li>将 siRNA 或质粒与转染试剂混合。将类器官来源的单细胞以及 Lipofectamine-RNA/Lipo-质粒混合物（例如 RNAiMAX）加入 24 孔板的 1–2 个孔中，在 32 °C、500 × g 条件下离心 1 小时。离心后，将培养板置于 37 °C 培养箱中继续孵育 4–5 小时。</li>
		<li>收集细胞，并以每孔 10,000 个细胞的浓度接种于含细胞外基质的培养基中。转染两天后更换为筛选培养基。10 天后评估类器官形成效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>慢病毒转导 
	&#8203;注意：直径小于 50 µm 的小型类器官或肝细胞类器官来源的单细胞，可根据制造商说明书，使用感染试剂培养基进行慢病毒感染。
	<ol>
		<li>在 1.5 mL 离心管中，混合 250 µL 来自类器官的单细胞悬液与 250 µL 病毒颗粒。</li>
		<li>将混合液接种至培养板，并在 32 °C、500 × g 条件下离心 1 小时，随后在 37 °C 下孵育 4–5 小时。</li>
		<li>收集细胞，并将其接种于含细胞外基质的培养基中。转导两天后更换为筛选培养基。10 天后评估类器官形成效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CRISPR/Cas9 基因编辑 
	注意：本操作的视频已提供于补充材料中。类器官来源的单细胞可通过携带 sgRNA 和 Cas9 的慢病毒进行感染，或通过质粒转染实现基因工程改造。
	<ol>
		<li>按照上述方法消化、培养并传代肝细胞类器官来源的单细胞。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用 Opti-MEM 培养基和感染试剂对单细胞进行 sgRNA 感染。</li>
		<li>在 1.5 mL 离心管中，混合 250 µL 单细胞悬液与 250 µL 病毒颗粒。</li>
		<li>将 500 µL 混合液在 32 °C、500 × g 条件下离心 1 小时，随后在 37 °C 下孵育 4–5 小时。</li>
		<li>收集细胞悬液，并接种于细胞外基质中。10 天后评估类器官形成效率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li>
<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regenerative+medicine%3A+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li>
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<li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li>
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<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li>
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<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li>
<li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

长期培养成熟肝细胞的能力对于研究肝脏基础科学、药物毒理学以及嗜肝性宿主-微生物感染（如疟疾和肝炎病毒）至关重要。本方案基于明确的微环境，建立了一套肝细胞培养体系。该方案可驱动成熟肝细胞在三维培养中扩增，其异质性能够模拟细胞间相互作用、多数肝细胞功能及遗传修饰，从而支持基因功能研究的设计，并为再生治疗探索新的治疗途径。
高质量的肝细胞对于肝细胞类器官的建立和遗传操作至关重要。胶原酶消化处理的时间非常关键。尽管如此，该方法仍存在一些局限性：首先，建议在实验中加入更多微环境因子，以促进类器官更长时间地扩增；其次，类器官不适宜连续且频繁地被处理为单细胞状态。肝细胞来源的类器官似乎能够模拟成年肝脏在部分肝切除后的再生反应，但它们仍与静息状态的成熟肝细胞存在差异。
值得注意的是，利用肝细胞类器官扩增肝细胞为肝脏基因功能研究开辟了新的途径。将类器官与血管细胞、免疫细胞及肝炎病毒共培养，有望进一步研究血管生成、微环境以及感染性肝病。此外，也建议将这些类器官用于建立标准化的高通量筛选系统，以开展体外解毒研究。

类器官是自组织的三维（3D）结构 体外 包含自我更新的干细胞和多谱系分化细胞的类群1,2许多器官的类器官已通过明确的微环境因子，从多能干细胞或成体干细胞成功建立，这些器官包括肠道、脑、结肠、肾脏、肝脏、胰腺、甲状腺、胃、皮肤和肺3,4,5,6,7类器官通过模拟发育过程（源自胚胎干细胞或诱导性多能干细胞，PSCs）或稳态/再生进程（源自成体干细胞，ASCs），重现了细胞的生理功能，为疾病研究和治疗开辟了新的途径。8,9.
作为哺乳动物体内最大的器官，肝脏主要负责物质的储存、代谢和解毒。两种上皮细胞类型——肝细胞和胆管细胞——构成了肝小叶的基本单位。其中，肝细胞承担了肝脏约70-80%的功能10。尽管肝脏具有显著的再生能力，但在传统的单层培养条件下，由于细胞极性失调和去分化现象，肝细胞特征会迅速丧失，这促使研究人员和临床医生迫切需要构建“填补空白”的体外肝脏模型。然而，直到最近，从原代肝细胞建立有效的ex vivo扩增模型仍未能得到良好实现11,12,13,14,15。肝脏类器官可来源于胚胎干细胞/诱导性多能干细胞、成纤维细胞转分化为类肝细胞，以及组织来源的细胞。肝脏类器官的发展推动了体外模型在药物筛选和肝毒性检测中的应用16,17。
在此，我们介绍一种从 小鼠 原代肝细胞建立肝类器官的详细方案。通过使用该方案，我们建立了 体外 采用两次胶原酶灌注法建立肝细胞类器官培养体系。这些类器官可长期传代扩增，持续数月。其生理功能与肝细胞高度一致。此外，我们还详细介绍了如何利用类器官进行遗传操作，包括慢病毒转染、siRNA转导以及CRISPR-Cas9基因编辑。肝细胞类器官的扩增为利用类器官研究肝脏生物学以及开发个体化和转化医学策略提供了新的可能。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;灌流缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sangon Bitech</td><td>A600077-0100</td><td>3.50 g/L</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100188-0500</td><td>9.00 g/L</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100395-0500</td><td>4.00 g/L</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501727-0500</td><td>1.51 g/L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501218-0001</td><td>80.0 g/L</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A610404-0500</td><td>0.78 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sangon Bitech</td><td>A500873-0500</td><td>3.50 g/L</td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100882-0025</td><td>0.06 g/L</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;消化缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501330-0005</td><td>0.50 M</td></tr><tr><td>胶原酶IV</td><td>Sigma</td><td>C1639</td><td>0.10 mg/mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sangon Bitech</td><td>C621110-0010</td><td>23.80 g/L</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100395-0500</td><td>4.00 g/L</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501727-0500</td><td>1.51 g/L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A501218-0001</td><td>80.0 g/L</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A610404-0500</td><td>0.78 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sangon Bitech</td><td>A500873-0500</td><td>3.50 g/L</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tip-wash 缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10091148</td><td>4℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C14190500BT0</td><td>4 ℃下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;洗涤液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高级DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>4 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100 X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>100 X</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sangon Bitech</td><td>&amp;nbsp;A600135-0025</td><td>100 X</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>储存浓度 500 &amp;micro;M，终浓度&lt;br/&gt; 浓度 2 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>高级DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>4℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>B-27 培养基添加剂 50 倍浓度，不含维生素 A</td><td>Gibco</td><td>1704-044</td><td>50 X</td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>储备浓度 30 mM，终浓度&lt;br/&gt; 浓度 3 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>4 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胃泌素 I</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td>储存浓度 100 mM，终浓度&lt;br/&gt; 浓度 10 nM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100 X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Matrigel 基质</td><td>BD</td><td>356231</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>储存浓度 500 mM，终浓度&lt;br/&gt; 浓度 1 mM</td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>储备浓度 1 M，终浓度 3 mM</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sangon Bitech</td><td>&amp;nbsp;A600135-0025</td><td>100 X</td></tr><tr><td>重组人 EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>储存浓度 100 &amp;micro;g/ml，终浓度 50 ng/ml</td></tr><tr><td>重组人 FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 储存浓度 &amp;micro;g/ml，终浓度 100 ng/ml</td></tr><tr><td>重组人HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>储存浓度 100 &amp;micro;g/ml，终浓度 25 ng/ml</td></tr><tr><td>重组人 TGF-&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>100-16A</td><td>储存浓度 100 &amp;micro;g/ml，终浓度为100 ng/ml</td></tr><tr><td>重组人TNF-&amp;alpha;</td><td>OriGene</td><td>TP750007-1000</td><td>储存浓度 100 &amp;micro;g/ml，终浓度为100 ng/ml</td></tr><tr><td>Rho 激酶抑制剂 Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>储备浓度 10 mM，终浓度 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Rspondin-1 条件培养基</td><td></td><td></td><td>胡实验室构建的稳定细胞系。终浓度为15%。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>16号硅胶管</td><td>LangerPump</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24孔，悬浮</td><td>Greiner bio-one</td><td>GN662102-100EA</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 水浴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 滤膜</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>干细胞</td><td>AT-104</td><td>4 ℃下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>抗-CTNNB1</td><td>BD</td><td>610154</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>抗GAPDH</td><td>CST</td><td>5174S</td><td>兔子</td></tr><tr><td>抗HDAC7</td><td>Abcam</td><td>ab50212</td><td>小鼠</td></tr><tr><td>抗KI67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>兔子</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>细胞回收溶液</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>4 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>542700097</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>ESCO</td><td>AC2-4S1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sangon Bitech</td><td>&amp;nbsp;A100231</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>EVOS FL 彩色成像系统</td><td>Invitrogen</td><td>AME4300</td><td></td></tr><tr><td>Hdac3 siRNA</td><td>广州锐博生物有限公司</td><td>siG2003180909192555</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Hdac7 慢病毒</td><td>上海吉凯基因化学技术有限公司</td><td>LV2020-2364</td><td>储存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Hitrans G A</td><td>上海吉凯基因化学有限公司</td><td>REVG004</td><td>提高病毒转染效率</td></tr><tr><td>Image Pro Plus 软件</td><td>Media Cybernetics，美国马里兰州贝塞斯达</td><td>版本 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX 转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td>提高病毒转染效率</td></tr><tr><td>活细胞染料</td><td>Luna</td><td>F23001</td><td>4 ℃下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>低速台式离心机</td><td>细胞</td><td>TD5A-WS/TD5AWS</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofactor-&amp;alpha; 2b 装置</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>4 ℃下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Sangon Bitech</td><td>F621006-0001</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>LangerPump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>PVDF膜</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>用甲醇活化</td></tr><tr><td>PX458</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>储存于 -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>冷藏离心机</td><td>Thermo Scientific Heraeus</td><td>Labofuge 400</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>MCE</td><td>HY-100218A</td><td>储备浓度 10 mM，终浓度 4 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gibico</td><td>25200072</td><td>4 ℃下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Wee1 siRNA</td><td>广州锐博生物有限公司</td><td>siG2003180909205971</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

小鼠肝细胞类器官的建立与遗传操作

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

肝脏是哺乳动物中最大的器官，它在葡萄糖储存、蛋白质分泌、代谢和解毒过程中发挥着重要作用。作为肝脏大部分功能的执行者，原代肝细胞的增殖能力有限。因此，需要建立体外肝细胞扩增模型，以支持肝脏生理学与病理学研究。 体外 用于肝脏生理学与病理学研究的肝细胞扩增模型。在此，我们通过两步胶原酶灌注法分离小鼠肝细胞，并建立三维类器官培养体系作为“迷你肝脏”，以模拟细胞间相互作用和生理功能。这些类器官包含异质性的细胞群体，其中包括前体细胞和成熟肝细胞。我们详细介绍了分离和培养小鼠肝细胞或胎肝细胞、在2–3周内形成类器官的过程，并展示了如何通过反复吹打进行传代。此外，我们还将介绍如何将类器官消化为单细胞，用于慢病毒介导的shRNA/异位表达载体感染、siRNA转染以及CRISPR-Cas9基因编辑。该类器官可用于药物筛选、疾病建模以及通过模拟肝脏生物学与病理生物学开展基础肝脏研究。

接种5天后，观察来自雌性Alb-Cre; Rosa26-GFP小鼠（8周龄）的肝细胞类器官（图1A）。类器官呈增殖状态，并显示Ki67阳性染色（图1B）。通过siRNA转染或慢病毒感染干扰肝细胞类器官中代表性基因的表达，采用qRT-PCR和蛋白质印迹法进行检测，结果如图2A和2B所示。图2C显示了经RSL-3处理14天后，利用CRISPR/Cas9基因组文库筛选获得的肝类器官筛选结果。结果表明，这些类器官可在体外扩增并进行遗传操作。
<img alt="小鼠肝细胞类器官培养，明场，荧光，CTNNB1，Ki67，细胞生长示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62438/62438...

长期 体外 从小鼠肝细胞建立了3D类器官培养系统。这些类器官可通过慢病毒感染shRNA/过表达载体、siRNA转染以及CRISPR-Cas9基因编辑技术进行传代和遗传操作。

肝脏是哺乳动物中最大的器官，它在葡萄糖储存、蛋白质分泌、代谢和解毒过程中发挥着重要作用。作为肝脏大部分功能的执行者，原代肝细胞的增殖能力有限。这要求建立体外肝细胞扩增模型，以用于肝脏生理与病理研究。本研究通过两步胶原酶灌注法分离小鼠肝细胞，并建立三维类器官培养体系，作为“迷你肝脏”以模拟细胞间相互作用和生理功能。该类器官包含异质性细胞群体，如前体细胞和成熟肝细胞。我们详细介绍了分离和培养小鼠肝细胞或胎肝细胞以在2-3周内形成类器官的过程，并展示了如何通过反复吹打进行传代。此外，我们还将介绍如何将类器官消化为单细胞，用于慢病毒介导的shRNA/异位表达载体感染、siRNA转染以及CRISPR-Cas9基因编辑。该类器官可用于药物筛选、疾病建模以及通过模拟肝脏生物学与病理过程开展基础肝脏研究。

肝脏是哺乳动物体内最大的器官，它在代谢和解毒过程中发挥着极为重要的作用。尽管肝脏在体外具有显著的再生能力，但长期体外培养肝细胞仍然是一项巨大的挑战。在此，我们利用成熟肝细胞建立肝细胞类器官，其在形态和功能上保持了肝细胞的主要特征。在本视频中，我们将详细介绍如何培养和传代这些类器官，以及如何对这些类器官进行遗传学改造。首先，进行肝脏灌注和消化。准备好所有区域和器械，并确保其无菌。清洗小鼠，切开表皮和皮肤，然后尝试找到肝脏的囊状结构。将针头插入其中，然后固定住。以每分钟5毫升的速度进行灌注，直到肝脏变为苍白。更换为灌注缓冲液，小心放置，观察肝脏，直至其变软。通常需要三到五分钟，然后将肝脏剪下并放入培养皿中，用剪刀将其剪成小块。频繁地上下吹打。通常需要10到15分钟使其成为单细胞悬液。然后上下吹打10到15分钟，使其通过滤器，制成单细胞悬液。将所有细胞收集到50毫升离心管中，离心后按每孔量收集细胞。尽量始终将其置于冰冷的冰上。制备单细胞悬液，并使用细胞计数器进行计数。通常情况下，状态良好的肝细胞会呈现明亮的荧光。第二部分，我们尝试让细胞沉降并进行类器官培养。收集所有细胞悬液，用特定的浓度-融合度计数细胞，然后将细胞与基质胶和培养基混合。通常，我们将培养基与Matrigel按1:2或1:3的比例混合。充分混匀后，将其接种至梯度培养板中。我们通常在24孔板的每个孔中加入100 µL。将它们放入37摄氏度的培养箱中。20分钟后，我们将培养物倒置，使底部朝下，然后加入培养基。经过两到三天的培养，我们通常可以看到类器官形成。这是我们的类器官的典型图像。如果需要传代或进行某些遗传学改造操作，我们通常需要从类器官中获得单细胞。我们用包被洗涤缓冲液收集培养板中所有的类器官，弃去上清液，然后向板中加入包被洗涤缓冲液，混匀，并反复吹打。然后，我们通常用洗涤缓冲液预先清洗所有枪头，以避免类器官黏附在枪头上。接着，使用新的一批预冷或未预冷的枪头，通过离心收集所有类器官。我们对其进行处理，通过离心去除所有的基质胶。在冰上孵育20至30分钟后，所有基质胶均被去除。收集全部纯净的类器官，并加入胰蛋白酶将其消化为单细胞。加入胰蛋白酶后，将类器官放入培养箱中进行处理。肝类器官变为单细胞需要5到10分钟。我们加入更多洗涤缓冲液以终止胰蛋白酶的消化作用。然后将它们轻轻吹打混匀。对于后续操作，可再洗涤一次以彻底去除胰蛋白酶。经离心洗涤后，可在细胞计数仪下进行计数。然后我们将展示如何对这些肝细胞类器官进行转导或转染。首先，标记好您将要使用的试管，然后根据试剂说明书进行瞬时转染。您需要使用脂质体转染试剂 Lipofectamine INI MaX。我们加入对照和特异性基因的 siRNA，并根据制造商说明书将其与最适转染试剂共同孵育。然后根据细胞浓度加入 RAN max，并充分混匀。然后，我们分别加入最适量的

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

本方案描述了小鼠肝外胆管三维类器官系统的构建方法。这些胆管类器官可在体外培养中维持生长，用于研究胆管上皮细胞的生物学特性。胆管类器官表达胆管前体细胞和成熟胆管细胞的标志物，并由具有极性的上皮细胞组成。...

从小鼠肝外胆管生成类器官

本方案提供了建立小鼠小肠类器官、从小鼠小肠固有层中分离1型固有淋巴细胞，以及在两种细胞类型之间建立三维（3D）共培养体系的详细操作步骤，用于研究肠上皮细胞与1型固有淋巴细胞之间的双向相互作用。...

小鼠小肠上皮类器官与固有淋巴细胞的共培养

本方案描述了快速且可重复地生成内胚层肝类器官（eHEPOs）的方法。通过本方案，可在2周内生成eHEPOs，并能够长期扩增（超过1年）而不丧失其分化能力与功能特性。...

功能性内胚层肝类器官的生成

本方案描述了如何建立、维持、基因改造、分化、功能表征以及移植源自小鼠和人类原代组织的泪腺类器官。...

小鼠与人泪腺类器官的建立、维持、分化、遗传操作及移植

类器官技术革新了器官发育、药物发现和疾病研究中的个性化组织建模。类器官工程正朝着构建复杂合成组织的方向发展。其目标是整合形态发生、类组装体技术与生物基质，以推动组织工程的进步。本实验方案有助于模拟肝脏器官发生过程，并为合成组织的构建建立指导性规范。...

利用人类细胞系进行肝脏器官发生建模、类组装体构建及合成组织设计的体外培养技术

将源自患者肿瘤的类器官正位注射到小鼠肝脏中。切除非肿瘤性肝组织后，可使肿瘤所在肝组织形成再生微环境。...

一种源自肝细胞癌患者的类器官异种移植模型，用于研究肝脏再生对肿瘤生长的影响

本方案介绍了一种在大鼠模型中优化的两步胶原酶肝脏灌注技术，并展示了分离肝细胞的应用 体外...

大鼠肝脏灌注与原代肝细胞分离：一种对前沿3D类器官培养至关重要的传统方法

我们描述了应用于两种报告策略的共聚焦成像与追踪流程：用于解析单个细胞行为和命运的嵌合类器官，以及用于监测人和小鼠肠道类器官中细胞类型转变的命运报告类器官。...

活细胞成像与单细胞追踪用于监测人和小鼠肠道类器官中的克隆动态与命运转变

体外培养早期鸡胚的方法（新培养法）

本视频展示了双色整体原位杂交技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化两种不同基因的空间和时间表达模式。该方法最初由 David Wilkinson、Domingos Henrique、Phil Ingham 和 David Ish-Horowicz...

早期鸡胚双重整体原位杂交

了解小鼠肝细胞类器官的建立与遗传操作方法，包括肝脏灌注消化、细胞培养传代及CRISPR-Cas9基因编辑技术。该方法为肝脏疾病研究和药物开发提供可靠的体外模型。

小鼠肝细胞类器官的建立与遗传操作

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