Name: 使用FlashPack方法进行简单的内部超高性能毛细管柱制造 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 了解FlashPack方法用于快速制备UHPLC毛细管柱，适用于LC-MS蛋白质组学分析。该方法可在100 bar压力下将50 cm色谱柱的填充时间缩短至1小时内，效率提升10倍，且色谱性能与商用柱相当。

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本工作由俄罗斯科学基金会（RSF）项目 20-14-00121 资助。作者感谢纪念斯隆-凯特琳癌症中心 P. V. Shliaha 的有益讨论。

装填流程包括五个步骤（图1）：1）装填工作站准备，2）毛细管准备，3）吸附剂浆液制备，4）在压力罐中进行毛细管装填，以及5）在高效液相色谱（HPLC）系统中完成色谱柱装填、切割至所需尺寸并安装超高效液相色谱（UHPLC）连接件。与常规流程相比，FlashPack 优化需要对第3和第4部分进行调整。
1. 包装站组装
<ol>
	<li>准备一个充满氮气、氦气或氩气的气瓶，配备单级气体减压阀，出口压力&#62;50 bar。最大压力受限于压力釜的耐压能力。</li>
	<li>将减压阀连接至压力釜的排气阀。</li>
	<li>若压力釜未配备内置磁力搅拌器，则将压力釜置于磁力搅拌器上。</li>
	<li>将内径较小的塑料管（例如 0.13 mm）连接至压力釜的排气口，并将其末端插入盛有水的容器中。</li>
</ol>
2. 毛细管制备
<ol>
	<li>准备一根带有集成玻璃烧结滤片的烧结毛细管，该滤片由Kasil和甲酰胺制成15，或使用激光拉制仪制备的拉制式喷嘴毛细管16。毛细管的长度应比目标柱长多出10–15 cm。 
	注意：有关不同毛细管尺寸和烧结滤片类型可能引发问题的讨论，请参见表1。表2列出了使用P2000激光拉制仪制备拉制式喷嘴毛细管的一个程序示例。</li>
	<li>使用剪裁过的凝胶上样枪头尖端保护拉制式喷嘴末端。
	<ol>
		<li>剪裁枪头尖端，使其紧密套在360 μm外径的毛细管上（可沿毛细管滑动，但需稍用力才能移动）。</li>
		<li>从毛细管前端方向将剪裁后的枪头尖端套入，并滑动至喷嘴端。</li>
		<li>当色谱柱处于喷雾状态时，将保护尖端向后滑开；当色谱柱不喷雾时（即使系统仍在流液但未喷雾），将尖端向前滑动，使喷嘴端位于枪头尖端内部。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 吸附剂浆液的制备
<ol>
	<li>准备一份储备吸附剂小瓶：将约 50 mg 干燥吸附剂放入一个 1.5 mL 离心管中。此处以 Reprosil Pur C18 为例。</li>
	<li>向吸附剂管中加入 1 mL 甲醇。</li>
	<li>为充分混匀，使用涡旋振荡器涡旋振荡管子 10 秒。</li>
	<li>在超声浴中进行超声处理 10 秒。</li>
	<li>让吸附剂充分浸泡 20–30 分钟，然后再次进行涡旋振荡和超声处理。</li>
	<li>准备一个工作用吸附剂小瓶。使用适合放入压力弹的锥底小瓶。 
	注意：可以是另一个 1.5 mL 离心管，也可以是其他类型的小瓶，具体取决于特定压力弹的设计。本实验中使用的是将锥底螺口管裁剪至与压力弹高度一致的小瓶。</li>
	<li>重悬储备吸附剂管中的吸附剂，并用 2 × 3 mm 的磁力搅拌子将 500 µL 转移至工作用吸附剂小瓶中。</li>
	<li>向工作用小瓶中加入甲醇至总体积约 1 mL。</li>
	<li>将工作用小瓶静置于实验台 10 分钟，使吸附剂依靠重力自然沉降。</li>
	<li>若沉降后吸附剂层高度低于 4 mm，需加入更多储备吸附剂悬液，并再次静置沉降 10 分钟。 
	&#8203;注意：制备好的工作用小瓶可用于数月内多次制备色谱柱。若工作用吸附剂小瓶静置未搅拌超过 2 小时，则必须再次涡旋振荡 10 秒、超声处理 10 秒，并依靠重力沉降。通常在装柱前早晨进行重悬操作，若连续装柱过程中无长时间中断，则当天均可使用。若工作用小瓶中的吸附剂干涸，应加入甲醇，并按照储备吸附剂小瓶的制备流程（步骤 3.2–3.5）重新进行完整制备。</li>
</ol>
4. 压力弹中毛细管的装填
警告：使用压力室时务必佩戴护目镜。请勿戴手套，因为手套会显著降低操作细径毛细管所需的手感，从而导致操作失误。
<ol>
	<li>将吸附剂小瓶放入压力罐中，并拧紧所有螺母。</li>
	<li>启动旋转，转速设为 60–100 rpm。</li>
	<li>将带有烧结滤片或拉制尖端的发射毛细管插入压力罐：将其推至小瓶底部，然后向上提起 2–3 mm，并拧紧螺母。 
	注意：固定毛细管时应施加最小必要力度，以避免损坏毛细管和卡套。最佳方式为手动拧紧。若使用六角扳手，仅需施加足以固定的最小力度。</li>
	<li>检查毛细管是否已牢固固定——用手向外拉时，毛细管应无法移动。</li>
	<li>缓慢打开压力罐阀门，同时确保毛细管开口端远离面部。</li>
	<li>观察装填过程的初始阶段。 
	注意：一旦加压，吸附剂即刻充满毛细管，整段毛细管变为不透明。当吸附剂开始在远端压实，背压上升，流速减慢，毛细管内均匀的吸附剂悬浊液重新分布为多个被无吸附剂间隙分隔的吸附剂段。已装填的吸附剂表现为颜色较深、连续增长的致密区域。</li>
	<li>在整个装填过程中，应保持吸附剂填充区域长度至少占毛细管总长的 70%，并允许存在少量无吸附剂间隙。</li>
	<li>装填过程中需注意若干常见问题，需实时调整装置以维持吸附剂向毛细管内的高效输送。 
	注意：有关吸附剂输送效率调整的更多细节见表 3。
	<ol>
		<li>问题 1：当新的吸附剂停止进入毛细管，而内部已有吸附剂仍在移动时，请按以下步骤操作。 
		注意：此为最常见问题。多数情况下，毛细管入口被自聚集的吸附剂团块堵塞。请依次执行以下步骤，直至吸附剂流动恢复，之后跳过其余与该问题相关的步骤。
		<ol>
			<li>将转速提高至 500 rpm，随即迅速恢复至 60–100 rpm。通常可恢复吸附剂流动。此后装填过程中，需确保转速至少维持在 60 rpm。&#160;</li>
			<li>若无效，短暂释放压力罐压力，随即重新加压。</li>
			<li>若仍无效或堵塞再次发生，需调整毛细管在吸附剂层中的位置。吸附剂缺失可能因毛细管开口端过高而未接触磁力搅拌子，或因毛细管插入瓶底所致。首先完全泄压，松开螺母，将毛细管推至底部，再回拉 2 mm，然后拧紧螺母。</li>
			<li>若堵塞持续，泄压后取出吸附剂小瓶，再次涡旋并超声处理。在显微镜下检查毛细管前端是否受损，必要时剪去前端约 5 mm。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>问题 2：当吸附剂仅填充毛细管一小部分，存在较长空段时，请按以下步骤操作。
		<ol>
			<li>检查转速。若转速过低，顶部涡流破裂效率不足。将转速提高至约 150 rpm。</li>
			<li>若转速过高，吸附剂会重新悬浮于较大体积的液体中，导致柱入口周围局部吸附剂浓度降低。将转速降低至 60–100 rpm。</li>
			<li>检查吸附剂量。当小瓶内吸附剂不足时，也会出现毛细管内吸附剂较少的情况。当吸附剂消耗后，应补充新吸附剂，确保重力沉降后吸附剂层高度不低于 4 mm。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>继续装填，直至达到目标柱长加 5–7 cm 的长度。</li>
	<li>停止旋转，并缓慢释放压力罐压力。
	<ol>
		<li>略微打开压力罐阀门，等待水瓶内气泡释放减缓。随后稍增大开度，再次等待气泡释放减慢。</li>
		<li>分步释放压力，直至无气体从阀门排出。 
		注意：切勿一次性完全打开阀门——这将导致毛细管内产生气泡，吸附剂回流至小瓶。若发生此情况，需重新加压并等待柱体再次装填完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当排气阀不再有气体排出时，将已装填的毛细管从压力罐中取出。 
	注意：切勿让色谱柱干燥。若无法立即连接至高效液相色谱（HPLC）系统进行后续装填，应将整根毛细管浸入 10% 乙醇溶液中保存。可使用密封的聚丙烯食品储存容器存放毛细管。未连接的 HPLC 色谱柱亦以相同方式保存。</li>
	<li>若不再计划进行后续装填，从压力罐中取出吸附剂小瓶并 tightly 密封。留待后续色谱柱装填使用。</li>
</ol>
5. 高效液相色谱柱的填装
<ol>
	<li>将填充毛细管连接至高效液相色谱系统 通过 高效液相色谱连接</li>
	<li>以95%的流动相B（80%或100%乙腈，0.1%甲酸（FA））开始，目标压力为250–300 bar。对于40 cm长的填充毛细管柱，使用200–300 nL/min的流速。 
	注意：使用2 µm填料、内径为100 µm、长度为40–50 cm的色谱柱时，装柱流速为200 nL/min。其他一些色谱柱规格列于 表4. 其他柱长和内径的流速可根据背压与柱长及横截面积之间的正比关系进行估算。实际流速需根据装填后的实际柱长进行调整，该长度默认情况下长于目标柱长。还需注意，300 bar 的压力接近高效液相色谱连接件的物理压力极限。对于耐压更高的连接件，应使用更高流速，最高可达连接件的压力上限，以实现更快的装柱。</li>
	<li>注意观察毛细管内松散的吸附剂是否被压紧，并计入总填充长度。</li>
	<li>不停止流动，将柱体浸入超声波清洗仪中处理两次。 
	注意：切勿将色谱柱末端及毛细管连接处浸入——仅浸入色谱柱柱体部分。超声步骤有助于提高色谱柱的重现性，尤其适用于极长的色谱柱 &#62;50 cm长（未发表数据）；然而，这会随机增加拉制毛细管发射端内部自组装吸附剂烧结物断裂的风险，从而完全堵塞色谱柱。尽管超声处理可普遍应用于任何玻璃烧结柱，但我们建议仅针对拉制毛细管发射柱在特定柱长范围内进行超声处理 &#62; 50 cm</li>
	<li>当吸附床停止收缩后，将层析柱体在超声浴中再浸入两次，同时保持液体持续流动。</li>
	<li>以300 bar压力继续运行色谱柱10分钟。</li>
	<li>停止流速，待压力降至3 bar以下后，拆下色谱柱。</li>
	<li>目视检查柱体是否存在缝隙或变色现象。若发现上述情况，可在流动状态下重复超声处理。对于关键实验，建议制备新的层析柱。</li>
	<li>将色谱柱切割至所需长度。 
	注意：正确的切割是保证色谱柱效率的前提。用刻划工具在聚酰亚胺涂层上刻出凹痕，部分折断毛细管，然后将两段拉开。</li>
	<li>使用陶瓷片或研磨膜对色谱柱前端进行抛光。</li>
	<li>使用UHPLC连接件将色谱柱重新连接至液相色谱系统。</li>
	<li>根据色谱柱内径，以2% B的流速开始工作流程 表4等待压力平衡，并检查色谱柱反压。 
	注意：工作流速需根据色谱柱参数进行调整。例如，一根长度为30 cm、内径为100 µm的色谱柱，其流速为500 nL/min。</li>
	<li>确保背压在预期值的5%范围内（参见 表5)，这表明色谱柱已正确装填，可随时使用。 
	注意：色谱柱反压是指将色谱柱连接至高效液相色谱系统时，梯度通道中的总压力减去色谱柱前毛细管反压后的数值。同时，以下数值中的 表5 是任意的（它们仅提供一个预期值的任意标度）。同一实验室中不同色谱柱之间背压的一致性才是表明系统运行正常的更重要的指标。实际的绝对背压取决于多种参数，例如填料粒径和特性、毛细管内径、生产商和批次、拉制电喷雾 emitter 尖端的形状、玻璃烧结体的密度与长度、溶剂性质以及室内环境温度等。如果背压过高，请参见 表1 以排查可能存在的问题。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

对于开展多个独立项目的大型实验室而言，自行填充毛细管色谱柱的方法非常流行。然而，从低浓度吸附剂悬浮液进行填充的常用方法在速度方面存在显著局限性，且无法制备较长的超高效液相色谱（UHPLC）色谱柱。
FlashPack 是对标准装柱方法的一种改进，使得能够从极高的吸附剂浓度进行装柱成为可能。该方法的理论基础在于，在整个装柱过程中持续破坏柱入口处的吸附剂拱形结构。这一过程在技术上通过持续用磁力搅拌子撞击柱入口来实现。拱形结构破坏方法的开发初衷是使装柱装置与常规装柱过程完全相同，但 FlashPack 的关键在于吸附剂悬浮液的制备、毛细管定位以及装柱过程中磁力搅拌子使用的具体细节。
吸附剂浆液在大量溶剂中制备成沉积态吸附剂层。值得注意的是，基于压力舱的填装方法不需要在不同色谱柱之间保持相同的填装条件。在FlashPack过程中，我们始终无法获知色谱柱入口周围吸附剂浆液的确切浓度。由于该浓度在填装过程中会发生变化，因此无法精确测量和控制。然而，无论填装过程如何实现，最终所得的色谱柱仍具有很高的重现性4。
快速填装的基础在于高效破坏吸附剂穹盖的稳定性。因此，在整个填装过程中，控制吸附剂进入毛细管并维持最佳的穹盖失稳条件至关重要。可能存在若干问题影响吸附剂的有效输送，例如磁力搅拌子转速过快导致吸附剂层重新悬浮，或因磁力搅拌子与毛细管相对位置不当、搅拌子转速过慢而导致穹盖失稳效率低下。这些问题及其解决方案将在实验方案部分详细讨论。
色谱柱填装完成后，需要检测的主要参数是色谱柱背压。表5中列出的压力值为常用亚2 µm粒径填料ReproSil PUR C18 AQ（1.9 µm）的预期压力提供了参考。同时，筛板或拉得过细的喷雾头可能会额外增加背压，需持续监测。若直接将填料填装至拉制好的喷雾头中，我们仍建议先使用带筛板的毛细管填装相同填料，测定其预期背压，再观察自组装筛板是否引入过高的压力。对于任何高压问题，可参考表1中的指南来定位故障原因。
根据我们的经验，一根无变色、无间隙且具有适当背压的填充柱在所有情况下均能正常工作，其分离效果接近于根据柱长和吸附剂特性所能预期的水平。存在变色的色谱柱不能保证正常工作，但仍可能获得满意的结果。
大多数情况下，如果分离效果出现问题，通常并非源于色谱柱本身，而是来自分离系统的其他部分，例如泵、溶剂或连接部件。尤其可能产生不利影响的是柱后连接。喷雾头与带烧结头的色谱柱之间连接不良，若存在死体积，会因毛细管色谱中极低的流速而导致显著的峰展宽和拖尾现象。
关于FlashPack方法，另一个需要特别注意的问题是：该方法在工作用的吸附剂悬浮液小瓶中使用了大量昂贵的吸附剂。请务必注意，FlashPack中的吸附剂悬浮液设计为可多次使用。请妥善保存吸附剂，避免不必要的磁力搅拌，以减少吸附剂磨损——在填装完成后请立即停止旋转。同时，切勿将敞口的吸附剂小瓶长时间留在加压装置中，以防吸附剂干燥。尽管干燥后的吸附剂仍可继续使用，但重新制备吸附剂悬浮液将耗费额外时间。
该方法对填充式毛细管和拉制喷嘴毛细管均具有良好的适用性。FlashPack 原理可将毛细管内径从 20 至 250 µm 范围内的填充速率提高（更小或更大的内径未进行测试）。该方法同样适用于我们所测试的所有固定相材料，包括全多孔和表面多孔型，表明在高浓度固定相浆液中形成固定相穹顶结构的现象并不局限于反相固定相。此外，溶剂参数会根据其物理和化学特性显著影响填充过程。例如，在相同填充压力下，黏度较低的丙酮比甲醇具有更高的填充速率。然而，丙酮的极性也低于甲醇，导致固定相颗粒之间的相互黏附作用减弱。这种效应本身会在填充初期流速仍较高时抑制固定相穹顶结构的形成。但固定相颗粒间相互作用的减弱也会导致自组装筛板结构的形成可靠性下降，并在填充过程中更频繁地引起拉制末端堵塞。因此，尽管丙酮更适用于填充式毛细管的装填，但对拉制喷嘴毛细管而言则不太合适；而以甲醇作为浆液溶剂虽然速度较慢，却适用于两种类型的末端结构。从正己烷或二氯甲烷（DCM）进行填充则是由甲醇转向丙酮的极端情况：它们的极性更低，完全抑制了固定相穹顶的形成，但完全不适用于拉制喷嘴毛细管的填充。此外，有观察发现，DCM 极低的极性会导致固定相颗粒黏附于毛细管内壁并形成较厚的沉积层。该沉积层厚度逐渐增加，并随机形成局部堵塞，导致色谱柱被分段填充，各段之间由无固定相区域隔开。此现象在 C18 Peptide Aeris 固定相中已被观察到。
另一个观察到的问题是，YMC Triart C18 填料在甲醇中未能充分悬浮，而是形成某种片状物。然而，这并不妨碍其使用 FlashPack 进行装柱，并获得相当理想的分离效率（未发表数据）。因此，尽管甲醇在某些情况下并非最优选择，但它是最适用于所有测试填料和色谱柱的通用溶剂。需要指出的是，我们尚未分析不同浆液溶剂对色谱柱分离效率的影响。同时，由甲醇制备的色谱柱，其效率已与相同填料的商用色谱柱完全相当4。
FlashPack 并不是提高超高效液相色谱柱装填效率的唯一现有方法。通过使用超高压力装填，也可实现从高浓度吸附剂浆液中快速装柱7。FlashPack 的优势在于其操作更为简便，无需特殊的超高压力泵、用于吸附剂输送的压力容器以及复杂的毛细管连接装置。同时已有研究表明，在极端压力下装填的色谱柱其分离效率可能高于低压装填的色谱柱17。尽管 FlashPack 制备的色谱柱与用于对比的商业色谱柱性能相同4（但这些商业柱所采用的装填方法未知），目前尚未验证 FlashPack 装填的色谱柱与超高压力装填色谱柱之间的性能差异。
总之，所述的 FlashPack 方法只需对现有实验室装柱方案进行一些调整即可轻松适配，而装置则完全保持不变。该方法将高效液相色谱毛细管柱的装填时间缩短至数分钟，并可实现超高压毛细管柱的长柱制备，而这是标准装柱方法完全无法实现的。采用 FlashPack 方法后，实验室在时间和经费上的总体节约每年可达数万欧元。此外，能够在本地制备超高压毛细管柱，为实验的定制化提供了现有商业产品无法实现的可能性。

现代蛋白质组学基于液相色谱-质谱联用技术，其中超高效纳流液相色谱（50–150 µm 柱内径（ID））分离可提供最佳的分析速度和灵敏度1。尽管市面上有多种商用超高效液相色谱毛细管柱可供选择，但其价格在耗材成本中占比较大，尤其是在实验室同时开展多个不同项目时，项目特异性柱污染问题频繁发生。此外，自行装填色谱柱可使用无法作为成品柱购买的定制化实验专用填料（例如 polyCAT-A 填料2）以及特定柱特性。
为应对这一问题，许多实验室选择自行填充毛细管柱。然而，常用的填充方法依赖于100 bar压力罐（压力注入池）3，由于亚2 µm的超高效液相色谱（UHPLC）吸附剂会产生很高的柱压，导致填充速度显著降低，因此该方法不适用于UHPLC色谱柱的填充，相比之下，较大粒径的HPLC吸附剂则无此问题。尽管较短的UHPLC色谱柱仍可极其缓慢地完成填充，但长UHPLC色谱柱的制备在物理上是不可能实现的4。
标准的毛细管柱填装通常在相对较低的压力下进行——最高达100 bar，并使用非常低浓度的吸附剂浆液。因此，加快填装过程有两种可能的途径。其一是提高填装压力5，但这需要特殊设备，且在实际操作中还需在实验室中建立新的方法。另一种方法是提高吸附剂浆液的浓度6。高浓度吸附剂浆液填装曾有文献报道，结合超高压条件进行填装7。然而，在目前大多数填装装置所采用的100 bar压力下，提高吸附剂浓度反而会导致填装速度减慢，甚至完全停止填装。最近的研究表明，该现象是由于吸附剂在柱入口处发生聚集所致，有研究提出一种简单的方法，即在吸附剂瓶内用磁棒敲击柱入口，破坏吸附剂拱状结构以消除聚集4。由此发展出的方法称为FlashPack，仍使用相同的100 bar压力填装装置。同时，通过对填装流程进行微小但关键的改进，可在不到一小时内从极高浓度的吸附剂浆液中完成极长UHPLC柱（50至70 cm甚至更长）的填装；而短柱则可在几分钟内完成，其分离性能与相同参数的商品化色谱柱相当4。FlashPack方法已成功应用于多个蛋白质组学项目，用于制备反相（RP）8,9,10,11,12,13,14和亲水相互作用（HILIC）2毛细管柱。
本文详细描述了将FlashPack方法适配于标准100-bar压力弹装填程序所需进行的修改。

<table><tbody><tr><td>含0.1% (v/v) 甲酸的乙腈</td><td>Merck</td><td>1.59002</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>陶瓷刻划片</td><td>Restek</td><td>20116</td><td>任何陶瓷片均适用于毛细管抛光</td></tr><tr><td>金刚石刀片刻划笔</td><td>NewObjective</td><td>Diamond-chip bladed scribe</td><td>推荐用于毛细管切割</td></tr><tr><td>熔融石英毛细管 100 µm 内径，375 µm 外径</td><td>CM Scientific</td><td>TSP100375</td><td></td></tr><tr><td>GELoader 吸头</td><td>Eppendorf</td><td>30001222</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱系统</td><td>ThermoScientific</td><td>Ultimate3000 RSLCnano</td><td></td></tr><tr><td>激光拉制仪</td><td>Sutter</td><td>P2000/F</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子 2×5 mm</td><td>Merck</td><td>Z283819</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（MeOH）</td><td>Merck</td><td>1.06018</td><td></td></tr><tr><td>微量药匙</td><td>Merck</td><td>Z193216</td><td></td></tr><tr><td>PEEK 卡套 360 µm</td><td>VICI</td><td>JR-C360NFPK</td><td>用于将色谱柱连接至UPLC接头</td></tr><tr><td>移液吸头，1000 µL</td><td>Merck</td><td>Z740095</td><td></td></tr><tr><td>移液器，1000 µL</td><td>Gilson</td><td>Pipetman L P1000L</td><td></td></tr><tr><td>压力灌注装置</td><td>NextAdvance</td><td>PC-77 MAG</td><td></td></tr><tr><td>调节器</td><td>GCE</td><td>Jetcontrol 600 200/103</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 µm</td><td>Dr. Maisch</td><td>r13.aq.0001</td><td></td></tr><tr><td>无盖螺口管，锥形底，自立式，0.5 mL</td><td>Merck</td><td>AXYST050SS</td><td></td></tr><tr><td>无盖螺口管，锥形底，自立式，1.5 mL</td><td>Merck</td><td>AXYST150SS</td><td></td></tr><tr><td>带O型圈的螺口盖</td><td>Merck</td><td>AXYSCOC</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Elma</td><td>Elmasonic S30 H</td><td></td></tr><tr><td>HPLC接头</td><td>VICI</td><td>JR-C360RU1PK6</td><td>用于将1/16英寸外径HPLC毛细管连接至360 µm毛细色谱柱</td></tr><tr><td>UPLC接头</td><td>VICI</td><td>JR-C360RU1FS6</td><td>用于将1/16英寸外径HPLC毛细管连接至360 µm毛细色谱柱</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>BioSan</td><td>V-1plus</td><td></td></tr><tr><td>含0.1% (v/v) 甲酸的水</td><td>Merck</td><td>1.59013</td><td></td></tr></tbody></table>

采用flashpack方法简易自制超高效毛细管色谱柱

Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach

毛细管超高效液相色谱（UHPLC）目前是基于液相色谱-质谱（LC-MS）的蛋白质组学中样品分离步骤的首选方法。然而，与高流速体系的色谱柱相比，毛细管柱的耐用性显著较低。由于容易发生污染和堵塞，这类色谱柱经常需要更换，从而成为整个LC-MS分析成本中明显昂贵的部分。自行填装UHPLC毛细管柱不仅可大幅节省费用，还能实现定制化。然而，传统的在100 bar压力罐中进行的填装方法仅适用于高效液相色谱（HPLC）色谱柱，对于UHPLC吸附剂而言填装速度过慢。本文介绍了一种优化的FlashPack方案，可在相同的100 bar压力罐装置上实施。该方法基于超高浓度吸附剂浆液进行填装，旨在以合理的时间在实验室内部制备任意长度的UHPLC毛细管柱。

FlashPack 方法基于标准的装柱装置，并遵循相同的装柱流程。装柱过程使用标准的带烧结端或拉制喷嘴的毛细管进行。其主要优化在于吸附剂悬浮液的浓度：标准方法无法兼容 FlashPack 中所使用的高浓度吸附剂悬浮液。该方法实现了超高效液相色谱长柱的快速制备，例如，在不到 1 小时内即可完成长度为 50 cm、填料粒径为 1.9 µm 的色谱柱装填（图 2）。
为展示 FlashPack 方法的应用，制备了一根 30 cm 长、内径为 100 µm 的毛细管色谱柱（表 6）。采用 P2000 激光拉制仪制备的 50 cm 长、内径为 100 µm 的拉制型电喷雾毛细管，在 60 bar 压力下填充 ReprosilPur C18 1.9 µm 填料。在 40 分钟内将填料填充至约 40 cm 长度，毛细管内仍残留少量未紧密填充的填料。将填充好的毛细管连接至 HPLC 系统，以 300 nL/min 的流速使用溶剂 B（80% 乙腈，0.1% 甲酸）进行冲洗。经过两轮各 5 秒的超声处理后，最终填充长度为 43 cm。随后将毛细管从系统中断开，切割至 30 cm，并使用 UHPLC 接头重新连接至 HPLC 系统。我们常规使用无套管的 360 µm PEEK 螺母-卡套和 360 µm 不锈钢接头。若拧紧得当，该组合可耐受至少 700 bar 的压力。所制备色谱柱在 500 nL/min 流速、2% 溶剂 B 条件下的背压为 520 bar，与预期值范围一致（表 5）。
为了展示色谱柱的分离效率，我们使用制备的30 cm色谱柱，在15分钟内从2%到50% B的梯度条件下分离了50 fmol细胞色素C蛋白的胰蛋白酶消化产物。提取的离子色谱图显示峰形高度对称，拖尾最小。平均半峰宽约为3 s（图3）。
表1：色谱柱工作背压过高问题的排查与处理。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table1_HighColPressurev2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：P2000/F激光拉制仪程序。在室温23–25 °C条件下，使用P2000/F激光拉制仪从外径360 µm、内径100 µm、聚酰亚胺涂层的熔融石英毛细管（无内涂层）制备拉制式发射极毛细管的程序。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table2_P2000F%20laser%20puller%20program.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：FlashPack 特有的包装问题及包装过程中需控制的检查点。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table3_sorbentDeliveryIssuesss.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4：不同柱内径和长度的典型装柱及工作流速。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table4%20Exemplary%20packing%20and%20working%20flow%20rates.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表5：使用2 µm球形填料填充的色谱柱在室温下以反相溶剂系统和工作流速（根据色谱柱内径）运行时的预期背压。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table5_Expected%20backpressure.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表6：30 cm UHPLC色谱柱的典型装填示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/Table6_Exemplary%20packing%20of%2030%20cm%20UHPLC%20columnv2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
<img alt="使用压力罐填充色谱柱；色谱装置示意图；HPLC、UPLC 连接步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：毛细管柱填充示意图。 第1至第3阶段为准备步骤，随后进行压力罐填充，最后完成HPLC装柱。第3和第4阶段针对超高效FlashPack方案进行了改进。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="色谱柱填装；图表；填装长度与时间关系；色谱系统分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：在甲醇中以 100 bar 压力，使用 ReprosilPur C18 AQ 1.9 µm 填料对内径为 100 µm 的带烧结筛板毛细管进行填装时的填装速率。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="色谱-质谱图，显示保留时间上的相对丰度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62522/62522fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：细胞色素C胰酶消化肽段的提取离子色谱图。将50 fmol细胞色素C在30 cm长、100 µm内径的拉制毛细管色谱柱（填充Reprosil-Pur C18 AQ 1.9 µm填料）上分离，采用梯度洗脱（流动相B为80%乙腈、0.1%甲酸，流动相A为2%乙腈、0.1%甲酸，15分钟内B相从2%线性升至40%），流速为500 nL/min，室温下进行。使用质谱仪进行检测。各肽段的绝对强度及提取的m/z范围在谱图右侧标出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62522/62522fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了一种优化的FlashPack毛细管色谱柱填装方案。将该优化方案应用于常见的100-bar压力罐装置，可使长效超高效毛细管色谱柱的填装和制备速度提高10倍。

采用FlashPack方法简易自制超高效毛细管色谱柱

毛细管超高效液相色谱（UHPLC）目前是基于液相色谱-质谱（LC-MS）的蛋白质组学中样品分离步骤的首选方法。

采用FlashPack方法简易自制超高效毛细管色谱柱。本实验方案旨在介绍一种优化的快速、简便的超高效毛细管色谱柱填柱方法，用于液相色谱-质谱联用蛋白质组学分析。现代蛋白质组学依赖于与超高效毛细管液相色谱联用的质谱技术。肽段分离通常在内径为75微米的毛细管柱中进行。与商业产品相当，毛细管柱也可在实验室自行制备。自制柱的分离性能与商业产品相似，同时可大幅节约成本，并允许对固定相材料和柱尺寸进行定制。本文演示了一种用于实验室自制毛细管色谱柱的优化填充方法，我们称之为 FlashPack。该优化方法的核心思想是：在仍使用常见的 100 bar 压力罐填充装置的前提下，采用极高浓度的固定相浆液进行填充。这需要持续打破在高浓度固定相条件下于色谱柱入口处形成的固定相团聚物，因为这些团聚物会阻碍新的固定相材料进入毛细管。从技术上讲，我们通过使用磁力搅拌子作为锤子，持续加热并在吸附剂填充的金属丝内部移动毛细管来实现这一目标。正确应用 FlashPack 可使填充速度提高至原来的 10 倍。这使其适用于填充粒径更小、更软的超高效吸附剂，并可在合理时间内制造长达一米的极长色谱柱。色谱柱制备过程包括五个步骤。三个准备步骤，包括装柱装置的组装以及毛细管和吸附剂浆液的制备。随后，在60至100 bar的压力下，首先在压力罐中对毛细管进行填装。接着将填充好的毛细管连接到高效液相色谱系统，通过高压将吸附剂装填并切割色谱柱至所需尺寸。FlashPack 操作步骤需要对常规方案中的第三步和第四 步进行修改。首先，我们准备一个装填装置。它由一个氮气罐组成，出口压力至少为50巴。该气罐连接至放置在磁力搅拌器中的压力罐的排气阀。排气阀的出口通过内径较小的PEEK毛细管插入水中，从而实现对减压过程的精确控制。接下来，我们准备一根毛细管。填料可装填至带有集成玻璃烧结片的烧结毛细管中，该烧结片由Kasil和甲酰胺制成；另一种选择是将填料装填至由Sutter激光拉制仪制备的拉制毛细管中。毛细管的长度必须比预期的色谱柱长度长10至15厘米。以下视频以拉制的喷雾毛细管填装为例进行演示。使用剪切的凝胶加样枪头保护拉制的喷雾毛细管末端。详细信息请参见稿件的文本版本。下一步是吸附剂悬浊液的制备。首先，将约50毫克干吸附剂放入1.5毫升离心管中。这将是一个储存吸附剂的小瓶。本视频使用了Dr.Maisch公司生产的Reprosil Pur C18 AQ 1.9微米吸附剂。向储存吸附剂的小瓶中加入1毫升甲醇。涡旋10秒，然后在超声浴中继续超声10秒。让吸附剂充分浸泡20至30分钟，再进行一次涡旋和超声处理。准备一个工作用的吸附剂小瓶。该小瓶必须为锥底小瓶，且能够放入压力室中。可以使用另一个1.5毫升离心管，或其他类型的小瓶，具体取决于特定压力室的设计。使用一个带裙边的锥形底螺口管，将其切割至与压力弹高度一致。将储存柱吸附剂中的吸附剂重新悬浮，并与一个尺寸为2×3毫米的磁力搅拌子一同转移500微升至工作柱吸附剂小瓶中。用甲醇将工作小瓶中的液体体积补至1毫升。将工作小瓶置于桌面上静置10分钟，使吸附剂通过重力沉降。此步骤的结果应为一个锥形底部小瓶，其底部松散吸附剂层高度约为4毫米。如果吸附剂层过低，可从储备小瓶中添加更多吸附剂。如此制备的工作用小瓶可用于在数月内多次制备多根色谱柱。若工作用填料小瓶静置未搅拌超过两小时，则在装柱前必须再次进行涡旋振荡、超声处理，并静置沉降。当所有准备工作完成后，进入第四步，即在加压装置中进行装柱。使用熔融石英毛细管和压力炸弹时，务必佩戴护目镜。同时，不建议佩戴防护手套。手套会显著降低操作小直径毛细管所需的手指触觉，从而导致操作失误。将吸附剂小瓶放入压力罐中，并将所有接头拧紧。以每分钟60至100转的速度开始旋转，将带有烧结滤片或拉制而成的喷雾毛细管插入压力罐中。将其推至小瓶最底部，然后上提2至3毫米，并固定接头。施加固定毛细管所需的最小作用力。检查毛细管是否已正确固定，必须确保用手无法将毛细管拔出。非常缓慢地打开压力炸弹阀门，同时确保毛细管的开口端远离您的面部。观察填充过程的初始步骤。一旦加压，填料立即充满毛细管，使其整体变得不透明。一旦吸附剂开始在毛细管远端填充，背压即会升高，流速减慢，毛细管内原本均匀的吸附剂悬浊液会重新形成多个吸附剂段，各段之间由不含吸附剂的间隙分隔。已填充的吸附剂表现为颜色较深、持续增长的连续区域。在整个填充过程中，应保持吸附剂填充区域至少占毛细管长度的70%，并保留少量不含吸附剂的间隙。在装填过程中需注意几个常见问题。这些问题需要在操作过程中及时调整设置，以确保填料能够高效地进入毛细管。最常见的问题是，当已装入毛细管内的填料仍在移动时，新的填料却停止进入毛细管。大多数情况下，毛细管入口会被自聚集的吸附剂颗粒堵塞。请逐一执行以下步骤，直至吸附剂流动恢复，然后跳过其余与问题相关的步骤。将转速提高至每分钟500转，随后立即调回至60 RPM。大多数情况下，这能恢复吸附剂的流动。在后续的装柱过程中，检查转速是否至少达到60 RPM。如果仍无改善，可短暂释放装柱罐的压力，然后立即重新加压。如果问题仍未解决，或阻塞再次发生，请重新调整毛细管在吸附剂层内的位置。吸附剂缺失可能是由于毛细管开口端过高，导致柱末端未接触到磁棒；或者毛细管位置过低，插入了离心管底部。首先完全释放反应弹内的压力，然后松开螺母，将毛细管推至底部，再回拉两毫米。固定螺母。打开阀门以对反应弹加压，并继续填充。有关装柱问题的更多细节在方法的文字版本中有详细描述。继续装柱，直至达到目标柱长度加5至7厘米为止。停止旋转，并非常缓慢地释放压力罐内的压力。稍微打开炸弹阀，等待水瓶内的气泡释放减缓。然后将阀门再开大一些，再次等待气泡释放速度减慢。通过这种逐步增加的方式释放压力，直至阀门不再有气体排出为止。切勿一次性完全打开阀门，否则会导致毛细管内产生气泡，并使吸附剂倒流回小瓶中。若发生此情况，需重新对反应罐加压，并等待色谱柱再次填装完毕。当排气阀不再有气体排出时，将装填好的毛细管从压力罐中取出。切勿让色谱柱干燥。若不能立即连接至高效液相色谱（HPLC）系统进行进一步装填，请将整根毛细管浸入10%乙醇溶液中保存。未连接的 HPLC 柱以相同方式保存。若今日不再进行填装，需将吸附剂小瓶从高压釜中取出并拧紧盖子，留待后续柱填装使用。第五步，高效液相色谱柱填装。通过高效液相色谱连接装置将填装好的毛细管连接至高效液相色谱系统。启动高比例有机溶剂的流动。根据填充长度调整流速，目标压力约为 300 bar。对于 40 厘米长的填充毛细管，使用 200–300 标准毫升/分钟的流速。注意观察毛细管内是否存在松散的吸附剂，这会增加总的填充长度。在不中断流动的情况下，将柱体部分浸入超声波清洗池中两次。注意仅需浸入柱体的一部分，切勿将柱体两端及毛细管连接处浸入。当吸附床不再收缩时，将柱体在超声浴中再浸入两次，同时保持流动不中断。在300 bar压力下继续运行柱子额外10分钟。停止流动，等待压力降至3 bar以下，然后拆下柱子。目视检查色谱柱是否存在间隙或变色现象。若发现上述情况，可在流动状态下重复超声处理。对于关键实验，建议制备新的色谱柱。将色谱柱切割至所需长度。正确的切割是保证色谱柱效率的前提。使用刻划工具在聚酰胺涂层上刻出切口。部分压裂毛细管，将两段分开。使用陶瓷片或研磨膜对色谱柱前端进行抛光。使用超高压连接件将色谱柱重新连接至液相色谱系统。起始工作流速为2%B。工作流速需根据色谱柱参数进行调整。例如，内径为100微米的色谱柱以每分钟500纳升的流速运行。等待压力平衡后，检查色谱柱的反压。制备良好的色谱柱，其反压应与其长度和填料特性成正比。例如，一根30厘米长、填充有2微米填料的毛细管柱，在2%溶剂B条件下，反压为450至500 bar。若所制备的色谱柱反压处于预期范围内，即可投入使用。如果背压远超出预期范围，则色谱柱或液相色谱系统存在问题。使用FlashPack进行填装可在100 bar的填装压力下，于一小时内完成50厘米长、填料粒径为1.9微米的毛细管柱填装。例如，我们制备了一根30厘米长、内径为100微米的超高压色谱柱，将其填装至拉制而成的喷雾毛细管中，填料为1.9微米的Reprosil-Pur C18 AQ吸附剂。在60 bar压力下，将填料装填至50厘米长的拉制毛细管发射器中。在40分钟内将毛细管填充至40厘米长度，毛细管内仍残留部分未填充的吸附剂。将填充好的毛细管连接至高效液相色谱系统，并以300纳升/分钟的流速使用溶剂B进行冲洗，本实验中溶剂B为80%乙腈、0.1%甲酸。最终装填长度为43厘米。色谱柱被截断至30厘米。在每分钟500纳升、99%溶剂B的工作流速下，色谱柱产生的背压为275巴，接近预期值。为测试色谱柱性能，我们使用2%-50%B的15分钟梯度分离了50 fmol细胞色素C蛋白的胰蛋白酶消化产物。色谱峰高度对称，拖尾最小，平均半峰宽约为三秒。所述方案能够在常见的100 bar装柱装置中，在合理的时间内制备出超高效液相色谱（UHPLC）柱。短型高效液相色谱（HPLC）或超高效液相色谱（UPLC）柱可在数分钟内完成装填，而30–50厘米长的色谱柱装填时间也少于一小时。该方法适用于将具有反相（RP）或其他任何化学性质的吸附剂高效地装填至任意内径的色谱柱中。所制备的色谱柱在相同尺寸和吸附剂参数下，其效果与任何其他商用色谱柱具有可重复性且相当。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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开发了一种集成式自动进样器和组分收集器（LC-mate），用于自动化重复的高效液相色谱分离。LC-mate...

使用LC-Mate实现高效液相色谱自动化分离：一种用于微量纯化的集成式重复自动进样器与组分收集系统

了解FlashPack方法用于快速制备UHPLC毛细管柱，适用于LC-MS蛋白质组学分析。该方法可在100 bar压力下将50 cm色谱柱的填充时间缩短至1小时内，效率提升10倍，且色谱性能与商用柱相当。

采用FlashPack方法简易自制超高效毛细管色谱柱

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