Name: UV Radyasyonu ve Kimyasallarının Primer ve Ölümsüzleştirilmiş İnsan Kornea Epitel Hücreleri Üzerindeki Toksisitesinin Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Öğrenin, UV radyasyonu ve kimyasal toksinlerin primer ile ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri üzerindeki toksisitesini değerlendirmek için bu in vitro yöntemi. Hayvan deneylerini minimize eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar bu çalışma için herhangi bir fon almadılar.

1. pHCEC'lerin ve iHCEC'lerin kültürü
<ol><li>İnsan oküler epitel besiyerinde (HOEM) pHCEC'leri ve iHCEC'leri aşağıdaki takviyelerle büyütün: 6 mM L-glutamin,% 0.002 hücre ortamı takviyesi O (Malzeme Tablosu), 1.0 μM epinefrin,% 0.4 hücre ortamı takviyesi P (Malzeme Tablosu), 5 μg / mL rh insülin, 5 μg / mL apo-transferrin ve kollajen-1 kaplı kültür şişelerinde 100 ng / mL hidrokortizon hemisuksinat (75cm2 kültür şişesinde 18 mL).</li>
	<li>Şişelerdeki ortamı her 2-3 günde bir, hücreler ~% 80 birleşmeye ulaştıktan sonra ortamı çıkararak değiştirin. Fenol kırmızısı olmadan ayrışma çözeltisi ekleyin ve hücreler tamamen ayrılana kadar şişeyi 37 ° C'de inkübe edin. DMEM / F12 ile ayrışma solüsyonunu serum ile nötralize edin ve ardından hücreleri 500 × g'da santrifüj edin. Süpernatant ortamı çıkarın ve hücreleri HOEM ortamında yeniden askıya alın.</li>
</ol>2. Konfokal mikroskopi kullanarak hücre büyüklüğünün belirlenmesi
<ol><li>Hem pHCEC'leri hem de iHCEC'leri, 1 mL HOEM ile 1 × 105 konsantrasyonunda cam tabanlı kapaklarla kollajen kaplı Petri kaplarına tohumlayın. pHCEC'leri ve iHCEC'leri, 24 saat boyunca bir kültür seti ve 48 saat boyunca başka bir kültür kümesini,% 5 CO2 ile 37 ° C'lik bir inkübatörde büyütün.</li>
	<li>Kuluçka döneminden sonra, hücreleri kalsein (4 μM), ethidyum homodimer-1 (8 μM) ve anneksin V (500 μL tampon-Alexa Fluor 647 konjugatında 5 μL) içeren 500 μL anneksin boyama tampon çözeltisi ile 37 ° C'de 20 dakika boyunca boyayın. Hücreleri boyadıktan sonra, mikroskobu kalsein-için 488/515 nm, ethidyum homodimer-1 için 543/600 nm ve ek V için 633/665 nm uyarma / emisyon dalga boylarını yakalamak için konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak ayarlayın.</li>
	<li>Görüntüleri elde edin ve hücre boyutunu üç boyutlu olarak değerlendirmek için Z yığınlarını alın.<ol><li>İki boyutlu (2B) ve üç boyutlu (3B) görüntüleri elde etmek için, bir apochromat 40x / 1.2 su hedefi ile görüntülenecek alanı bulun. Argon (488) (ilk tarama), HeNe1 (543) (ikinci tarama ve HeNe2 (633) (üçüncü tarama) lazerleriyle, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis ve NFT 545 LP560, LP505 ışın ayırıcılarını kullanarak üç ayrı kanalda tarayın.</li>
		<li>Karışmayı azaltmak için çok kanallı sıralı taramayı kullanın. NOT: LP505, kalsein boyasının emisyonunu yakalamak için 488 lazer ile kanal 2 için kullanılır. LP560, ethidyum homodimer 1'in emisyonunu yakalamak için 543 lazer ile kanal 3'te kullanılır. NFT 635, ek V'nin emisyonunu yakalamak için 633 lazerle birlikte kullanılır. HFT'nin amacı, uyarma ve emisyon ışığını ayırmaktır. NFT, belirtilen dalga boyundaki ışığı ayrı bir kanala yansıtarak ışığı böler < ışığın belirtilen dalga boyunu ikinci bir kanala > izin verir. LP filtreleri, belirtilen dalga boyundan daha kısa dalga boylarını bloke eder ve daha uzun dalga boylarının geçmesine izin verir.</li>
		<li>3B görüntü görüntülemek için, konfokali değeri Z-yığını olarak ayarlayın ve en az 20 kare tarayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Hücrelerin UV radyasyonuna maruz kalması
<ol><li>Hücreleri 24 delikli kollajen-1 kaplı bir kültür plakasının her bir kuyucuğuna 5 ×10 4 / mL HOEM tohumlayın ve 3 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. Kuluçka süresinden sonra, kuyucuklardaki ortamın hacmini 300 μL'ye düşürün. Daha sonra, hücreleri ayrı deneylerde 5 ve 20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde UV radyasyonuna (hem 6.48 W / m2'de UVA hem de UVB tüpleri inkübatörde aynı anda açıldığından, hem 6.48 W /m2'de UVA hem de 1.82 W /m2'de UVB) maruz bırakın.</li>
	<li>UV radyasyonundan sonra, her bir oyuğa 200 μL taze HOEM ekleyin ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de 20 saat inkübe edin.</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, hücre süpernatantını her bir kuyucukta toplayın ve steril 2 mL polipropilen tüplere aktarın. -80 °C'de dondurun. UV maruziyetinden sonra pHCEC'ler ve iHCEC'ler tarafından salınan sitokin seviyelerini belirlemek için, multipleks bir sitokin testi kullanın ve aşağıdaki dört sitokini ölçmek için kitin talimatlarını izleyin: IL-6, IL-8, IL-1β ve TNF-α.</li>
	<li>Kuyucuklardaki hücrelere metabolik tahlil reaktifi ekleyin.</li>
	<li>DMEM / F12'de% 10 metabolik tahlil reaktifi hazırlayın. Her bir kuyucuktaki kültür ortamını 1 mL% 10 metabolik tahlil çözeltisi ile değiştirin ve 37 ° C'de 4 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.</li>
	<li>Her çözeltinin floresansını 530/590 nm uyarma/emisyon dalga boylarında bir floresan plaka okuyucu kullanarak ölçün.</li>
</ol>4. Hücrelerin kimyasal toksinlere maruz kalması
<ol><li>24 delikli kollajen-1 kaplı bir kültür plakasının her bir kuyucuğunda 5 × 104/mL HOEM tohum hücreleri ve 3 saat boyunca %5 CO2 ile 37 °C'de inkübe edilir. Kuluçka döneminden sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri 5 ve 15 dakika boyunca 1 mL kimyasal toksine (BAK% 0.001, H2O2% 0.01 ve SDS% 0.0025) maruz bırakın.</li>
	<li>Kimyasal toksinlere maruz kaldıktan sonra, toksinleri kuyucuklardan çıkarın, 1 mL PBS ile durulayın ve her bir oyuğa 1 mL HOEM ekleyin. 20 saatlik inkübasyondan sonra, ortamı% 10'luk bir metabolik tahlil çözeltisinin 1 mL'si ile değiştirerek ve 37 ° C'de 4 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe ederek metabolik bir tahlil gerçekleştirin. 530/590 nm uyarma/emisyon dalga boylarında floresan çok kuyucuklu plakalı bir okuyucu kullanarak floresanı ölçün.</li>
	<li>20 saatlik inkübasyonu takiben hücre süpernatantlarını kuyucuklardan ayrı steril 2 mL polipropilen tüplere aktarın ve -80 ° C'de dondurun. Kimyasallara maruz kaldıktan sonra pHCEC'ler ve iHCEC'ler tarafından salınan sitokinleri sayısallaştırın. UV ile muamele edilmiş hücrelerden sitokinleri değerlendirmek için kullanılan aynı multipleks platformu kullanın. Aşağıdaki dört sitokini ölçmek için kitin talimatlarını izleyerek bir multipleks sitokin testi kullanın: IL-6, IL-8, IL-1β ve TNF-α.</li>
</ol>5. Çeşitli BAK konsantrasyonlarına maruz kalan hücrelerin incelenmesi
<ol><li>24 delikli kollajen-1 kaplı bir kültür plakasının her bir kuyucuğunda 1 × 10 5 / mL HOEM tohum hücreleri ve 24 saat boyunca%5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edilir. Kuluçka döneminden sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 1 mL kimyasal toksine (PBS'de BAK% 0.001, BAK% 0.005 ve BAK% 0.01) maruz bırakın.</li>
	<li>Maruz kaldıktan sonra, kimyasal toksinleri çıkarın, kuyucukları 1 mL PBS ile durulayın ve her bir oyuğa 1 mL HOEM ekleyin. 20 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri kalsein (4 μM), ethidyum homodimer-1 (8 μM) ve eksin V (500 μL tampon-Alexa Fluor 647 konjugatında 5 μL) içeren 500 μL ekin boyama tamponu çözeltisi ile 37 ° C'de 20 dakika boyunca boyayın. Mikroskobu, sırasıyla 630/675 nm, 495/515 nm ve 528/617 nm uyarma/emisyon dalga boylarında ek V, kalsein ve etidyum-1 boyama yoğunluklarını ölçmek için ayarlayın. Floresan mikroskobu kullanarak hücreleri görüntüleyin</li>
</ol>6. Veri analizi
<ol><li>Varyans analizi (ANOVA), Welch ANOVA veya Kruskal-Wallis testi yapmadan önce bir normallik testi ve eşit varyans testi yapın. Test edilen her grubu karşılaştırmak için uygun post-hoc testi kullanın. p<yi 0,05 olarak ayarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%26+Contact+Lens%22%5BJournal%5D)">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li>
<li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li>
<li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal%2C+lens%2C+and+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li>
<li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li>
<li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li>
<li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span%3A+in+vitro+model+for+ocular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li>
<li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li>
<li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li>
<li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+Valuable+tools+or+useless+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li>
<li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li>
<li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li>
<li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li>
<li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li>
<li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li>
<li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li>
<li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death & Disease. 6, 1640(2015).</li>
<li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li>
<li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase%3A+PP2A+structural+importance%2C+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li>
<li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation%2C+migration%2C+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+nvestigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li>
<li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li>
<li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li>
<li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li>
<li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotection%3A+a+review+of+the+current+and+future+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li>
<li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Dermatological+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li>
<li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132(2006).</li>
<li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li>
</ol>

Yazar Lyndon W. Jones, son 3 yılda, CORE aracılığıyla, aşağıdaki şirketlerden araştırma desteği veya öğretim üyeliği onursal olarak almıştır: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage ve Visioneering. Lyndon Jones ayrıca Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis ve Ophtecs için bir danışman ve/veya danışma kurulunda görev yapmaktadır. Diğer yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

İki tip HCEC'in kullanımındaki potansiyel farklılıklar değerlendirildi. Hücreler aynı ortama (HOEM) aynı hücre konsantrasyonlarında yerleştirildi ve daha sonra kısa ve uzun süreli UV radyasyonuna ve üç oküler toksine maruz bırakıldı. UV radyasyonu ve kimyasalların dozları, karşılaştırılabilecek ara tepkiler üretmek için hücrelere yeterince zarar veren fizyolojik etkilerine dayanarak seçildi. UV radyasyonu için 5 ve 20 dakika ve seçilen BAK (% 0.001), SDS (% 0.0025) ve H2O2(% 0.01) dozları için 5 ve 15 dakikalı...

Hücrelere zarar verebilecek kimyasalların ve diğer ajanların toksik etkilerini tahmin etmek için in vitro toksikoloji çalışmaları yapılmaktadır. Korneaya toksisitenin değerlendirilmesinde, insan kornea epitel hücreleri (HCEC'ler) bu etkilerin değerlendirilmesi için modellerde kullanılmıştır 1,2,3,4. Bu modeller tipik olarak hücrenin metabolik aktivitesindeki değişiklikler, hücre proliferasyonu ve enflamatuar sitokinlerin üretimi ve salınımı gibi diğer hücre fonksiyonları gibi fizyolojik etkileri değerlendirir. Bu toksikoloji çalışmaları için, kimyasalların ve UV radyasyonunun HCEC'ler üzerindeki zararlı etkilerini değerlendirmek için çeşitli kaynaklardan hücreler seçilmiştir 2,3. pHCEC hatları, bu hücreleri yetişkinlerin donör dokularından sağlayan şirketlerden temin edilebilir. Birincil hücreler dispaz ile tedavi edilebilir ve kültür5 için korneadan nazikçe kazınabilir. Hücreler daha sonra virüsler ve kontaminasyon açısından test edilir ve daha sonra% 10 dimetil sülfoksit içinde kriyokorunmuş olarak gönderilir.
Birincil hücre hatlarının avantajı, hücrelerin genetik olarak donörün hücreleriyle aynı olmasıdır. Bu idealdir, çünkü in vitro bir model in vivo dokuyu mümkün olduğunca taklit etmelidir. Birincil hücre hatlarının dezavantajı, sınırlı sayıda hücre bölünmesine veya pasajına sahip olmalarıdır6. Mevcut sınırlı sayıda hücre, tek bir birincil kültürle yapılabilecek deney sayısını kısıtlar ve deneylerin maliyetini artırır.
Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, hücre kültürü toksisite modellerinde de kullanılmıştır. Bununla birlikte, in vivo dokudan elde edilen birincil hücre hattının aksine, ölümsüzleştirilmiş hücre hattı genetik olarak değiştirilmiştir. Ölümsüzleştirilmiş hücreler, bir virüsün genlerinin birincil hücrelerin DNA'sına dahil edilmesiyle oluşturulur 6,7,8. Başarılı viral gen katılımına sahip hücreler, ölümsüzleştirilmiş hücre hattı için seçilir. Ölümsüzleştirmenin avantajı, sınırsız sayıda hücrenin aynı hücre hattını kullanarak birden fazla deney yapmasını sağlayarak sınırsız hızlı çoğalmaya izin vermesidir. Bu, deneyler arasında tutarlılık sağlar ve maliyeti azaltır.
Hücre proliferasyonunu sınırlayan genlerdeki değişikliklere ek olarak, kritik işlevselliğe sahip genlerin ekspresyonunda da değişiklikler meydana gelebilir9. Bu nedenle, ölümsüzleştirilmiş hücrelerin kullanılmasının dezavantajı, çeşitli dış uyaranlara tepkileri açısından orijinal in vivo hücreleri artık temsil edememeleridir10. Karşılaştırmalar, kimyasalların primer ve ölümsüzleştirilmiş insan kornea keratositleri11, ayrıca ölümsüzleştirilmiş HCEC'ler ve tavşan kornea epitelyal primer hücreleri12 üzerindeki toksik etkilerini gözlemlemeyi içermektedir. Toksinlerin primer insan keratositleri ile ölümsüzleştirilmiş keratositler üzerindeki etkileri arasındaki karşılaştırmada anlamlı bir fark görülmemiştir11. Bu makalede detaylandırılan yöntemler kullanılarak, UV radyasyonunun ve oküler toksinlerin pHCEC'ler ve iHCEC'ler üzerindeki toksisitesini değerlendirmek için bu testlerin etkinliği belirlenecektir.
İn vitro testlerde yaygın olarak kullanılan üç oküler toksin seçildi: BAK, H2,O2ve SDS. BAK, oftalmik çözeltilerde yaygın olarak kullanılan katyonik bir koruyucudur13,14, H2O2, kontakt lensleri dezenfekte etmek için yaygın olarak kullanılır15 ve SDS, deterjanlarda ve şampuanlarda bulunan anyonik bir yüzey aktif maddedir 14. Oküler toksinlere benzer şekilde, UV radyasyonu da HCEC'lerde önemli hasara neden olabilir3. Ek olarak, UV'ye aşırı maruz kalmak, yırtılma, ışık hassasiyeti ve kumluluk hissi belirtileri ile karakterize fotokeratit olarak bilinen bir oküler duruma neden olabilir16.
Kullanılabilecek sınırsız sayıda birincil hücre kültürü ve geliştirilmiş çeşitli ölümsüzleştirilmiş hücre hatları vardır. Bu nedenle, bu tip hücreleri içeren modeller arasındaki benzerlikleri ve farklılıkları belirlemek için birincil HCEC'leri ölümsüzleştirilmiş bir HCEC çizgisiyle karşılaştırmak için bir araştırma yapılmıştır.
Bu çalışmada, pHCEC'ler ve iHCEC'ler arasındaki UV ve toksinlere hücre fizyolojik yanıtı üzerindeki olası farklılıkları değerlendirmek için mikroskopi kullanılmıştır. UV radyasyonu ve kimyasallarının hücre metabolik aktivitesi ve iki hücre hattı için inflamatuar sitokin salınımı üzerindeki etkileri de değerlendirildi. İki hücre hattı arasındaki farklılıkları belirlemenin önemi, bu hücre hatlarının değerlendirmek için en uygun kullanımını anlamaktır: 1) UV radyasyonunun hücreler üzerindeki etkisi, 2) toksinlerin hücreler üzerindeki etkileri ve 3) gelecekteki çalışmalar için metabolizma, hücre canlılığı ve hücre sitokin salınımında ortaya çıkan değişiklikler.

<table><tbody><tr><td>75 cm2 Bacalı Şişe</td><td>Corning</td><td>354485</td><td>Bu BioCoat marka, kollajen kaplı</td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>dal 1025</td><td></td></tr><tr><td>Annexin Boyama tampon çözeltisi</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Annexin V</td><td>Invitrogen, Burlington, AÇIK, Zeiss</td> konfokal lazer tarama mikroskobu 510 sistemli Kanada <td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 mikroskobu Carl</td><td>Zeiss Inc., Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning 48 Kuyu plakaları</td><td>Corning</td><td>354505</td><td>Bu BioCoat marka, kollajen kaplı</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>CYT5MPV</td><td>280 - 700 nm arasında floresan okuyabilir (540/590 tahlil için)</td></tr> <tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Hycone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>cam alt lameller</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan Kornea Epitel Hücreleri</td><td>Ottawa Üniversitesi</td><td>N/A</td><td>Dr. M. Griffith'ten (Ottawa Göz Araştırma Enstitüsü, Ottawa, Kanada) SV40 ile ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri ve Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Hücre hatlarından oluşturulan fonksiyonel insan kornea eşdeğerleri. Bilim. 1999;286:2169-72.</td></tr><tr><td>Aşağıdaki takviyeleri içeren İnsan Oküler Epitel Ortamı (HOEM):</td> <td>Millipore, Billerica, MA, ABD</td><td>SCMC001</td><td>6 mM L-Glutamin, %0.002 EpiFactor O (makalede hücre ortamı takviyesi O) ile desteklenmiş Epigro baz ortamı, 1.0 & mu; M Epinefrin,% 0.4 EpiFactor P (makalede hücre ortamı takviyesi P), 5 & mu; g/mL rh İnsülin, 5 & mu; g/mL Apo-Transferrin ve 100 ng/mL Hidrokortizon Hemisüksinat Kollajen-1 kaplı kültür şişelerinde (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, ABD).</td></tr><tr><td>Canlı Ölü kalsien ve etidyum homodimer</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Kanada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 cihazı</td><td>Rockville, MD, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSD İnsan Proinflamatuar Panel II (4-Plex) V-Plex testi</td><td>Rockville, MD, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100x konsantrasyon, bu nedenle her 99 mL ortama 1 mL ekleyin</td></tr><tr><td>Primer Kornea Epitel Hücreleri</td><td>Millipore, Billerica, MA, ABD</td><td>SCCE016</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax floresan çok kuyulu plaka okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (hücre ayrışma çözümü)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12605036</td><td></td></tr></tbody></table>

uv radyasyonu ve kimyasallarının primer ve Ölümsüzleştirilmiş İnsan kornea epitel hücreleri Üzerindeki toksisitesinin belirlenmesi

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

Bu makalede, primer (pHCEC) ve ölümsüzleştirilmiş (iHCEC) insan kornea epitel hücre kültürleri üzerinde ultraviyole (UV) radyasyon ve oküler toksinlerin toksisitesini ölçme yöntemleri açıklanmaktadır. Hücreler UV radyasyonuna ve toksik dozlarda benzalkonyum klorür (BAK), hidrojen peroksit (H2O2) ve sodyum dodesil sülfat (SDS) dozlarına maruz bırakıldı. Metabolik aktivite metabolik bir tahlil kullanılarak ölçüldü. İnflamatuar sitokinlerin salınımı multipleks interlökin (IL)-1β, IL-6, IL-8 ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) testi kullanılarak ölçüldü ve hücreler floresan boyalar kullanılarak canlılık açısından değerlendirildi.
UV'nin hücre metabolik aktivitesi ve sitokin salınımı üzerindeki zararlı etkileri, iHCEC için 5 dakika UV maruziyetinde ve pHCEC için 20 dakika UV maruziyetinde meydana gelmiştir. İHCEC ve pHCEC'in metabolik aktivitesindeki benzer yüzde düşüşleri, BAK, H2O2veya SDS'ye maruz kaldıktan sonra meydana geldi ve sitokin salınımındaki en önemli değişiklikler IL-6 ve IL-8 için meydana geldi. Floresan olarak boyanmış iHCEC ve pHCEC BAK'a maruz kalan hücrelerin mikroskopisi,% 0.005 BAK maruziyetinde hücre ölümü gösterdi, ancak iHCEC'lerde etidyum boyama derecesi pHCEC'lerden daha büyüktü. Mikroskopi kullanarak toksik etkileri değerlendirmek, metabolik aktivitenin değerlendirilmesi ve sitokin üretimi için birçok yöntem kullanılarak, UV radyasyonunun ve kimyasal toksinlerin toksisitesi hem birincil hem de ölümsüzleştirilmiş hücre hatları için belirlenebilir.

Hücre boyutu Birincil ve ölümsüzleştirilmiş HCEC'ler, hücre canlılığının üç farklı aşamasını yansıtan üç floresan boya ile görselleştirildi. Canlı hücreler yeşildir (kalsein-), ölü hücreler kırmızıdır (ethidium homodimer-1) ve apoptotik hücreler sarıdır (floresan sinyalinin daha iyi görselleştirilmesi için ek V-bilgisayar ayarlı renk). Canlı hücreler, hücre sitoplazmasında esterazlar içerir ve kalsein-'yi kalseine dönüştürür. Ölü hücreler, ethidium homodimer-1'e geçirgen hücre zarlarına sahiptir. Apop...

Bu makalede, birincil ve ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattında UV radyasyonunun ve kimyasal toksinlerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır.

UV Radyasyonu ve Kimyasallarının Primer ve Ölümsüzleştirilmiş İnsan Kornea Epitel Hücreleri Üzerindeki Toksisitesinin Belirlenmesi

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Bu yöntem, yeni oftalmik ürün formülasyonlarının in vitro toksisitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Oküler hücreler in vitro kullanılarak kimyasalların ve ürün formülasyonlarının konsantrasyonlarının rafine edilmesiyle, yeni ürün güvenliğini değerlendirmek için hayvanların kullanımı en aza indirilebilir. İn vitro testler, bir kimyasalın mitokondriyal fonksiyon, hücre zarı bütünlüğü ve enzim aktivitesi üzerindeki etkisini belirlemek gibi in vivo olarak değerlendirilemeyen toksisite son noktalarını değerlendirir.Hücre toksisitesini in vitro olarak değerlendirmek, potansiyel toksisite mekanizmalarını anlamanın anahtarıdır. Bu, gözde tolere edilebilir maksimum dozda terapötik kimyasalların oluşturulması için gereklidir. Prosedürü gösteren, Jones Laboratuvarı'ndan bir araştırmacı olan Nijani Nagaarudkumaran olacak.Hem pHCEC'leri hem de iHCEC'leri, 1 mililitre insan oküler epitel ortamı veya HOEM ile 1 x 10 ila 5. konsantrasyonda cam alt kapak kaymaları olan kollajen kaplı Petri kaplarına yerleştirerek başlayın. pHCEC'leri ve iHCEC'leri 24 saat boyunca 1 kültür seti ve 48 saat boyunca başka bir seti% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derecelik bir inkübatörde büyütün. İnkübasyo

determining-toxicity-uv-radiation-chemicals-on-primary-immortalized

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, resazurin bazlı Alamar mavisi solüsyonu kullanılarak yapay gözyaşı formülasyonlarının kornea epitel hücrelerinin hücresel metabolik aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için bir in vitro florometrik test açıklanmaktadır. Toksik olmayan bir formülasyon, hücreleri sağlıklı, metabolik olarak aktif bir durumda tutar ve resazurinin yüksek floresan bir resorufin'e indirgenmesini kolaylaştırır.

alamarBlue Testi: Yapay Gözyaşı Formülasyonlarının İnsan Kornea Epitel Hücrelerinin Metabolik Aktivitesi Üzerindeki Sitotoksik Etkilerini Taramak İçin Hassas Bir Florometrik Yöntem

Epidermal keratinositler fonksiyonel bir cilt bariyeri oluştururlar ve dış çevresel hakaretlere karşı ana savunmanın ön saflarında yer alırlar. Burada, neonatal ve erişkin fare derisinden epidermal keratinositlerin izolasyonu ve birincil kültürü için yöntemleri ve keratinositlerden gelen terminal farklılaşmayı ve UVB tetiklemeli enflamatuar yanıtın indüksiyonunu tarif ediyoruz.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

Yüksek işlem hacmi küçük inhibitör RNA tarama daha hızlı moleküler mekanizmalar kimyasal kornea epitel yaralanma aydınlatmak için yardımcı olabilecek önemli bir araçtır. Burada, biz geliştirme ve pozlama modelleri ve kornea epitel yaralanma hidrojen florür ve polis indüklenen yüksek aktarım tarama yöntemlerini doğrulama mevcut.

Yüksek işlem hacmi SiRNA tarama için polis ve hidrojen florür kaynaklı kornea epitel hücre hasarı

Bu iletişim kuralı kornea limbal epitel kök hücre xeno - ve besleyici boş hücre kültür koşullar altında insan pluripotent kök hücrelerden ayırt için basit iki adımlı bir yöntem sağlar. Burada sunulan hücre kültür yöntemleri klinik kalite hücre kornea hücre terapisi kullanmak için uygun maliyet-etkin, büyük ölçekli üretim sağlar.

Verimli ve ölçeklenebilir yönlendirilmiş farklılaşma klinik olarak uyumlu kornea Limbal epitel kök hücrelerden insan Pluripotent kök hücreler

Bu protokol, fare oküler yüzey hücrelerinden canlı birincil kültürlerde reaktif oksijen türlerinin (ROS), canlı hücrelerin ve ölü hücrelerin eşzamanlı olarak tespitini göstermektedir. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iyodür ve Hoechst boyama ros, ölü hücreleri ve canlı hücreleri değerlendirmek için kullanılır, sırasıyla, görüntüleme ve analiz izledi.

Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

Bu protokolün amacı, farklı yapay gözyaşı formülasyonlarının bir in vitro model kullanarak insan kornea epitel hücrelerinin desiccation'dan korunup korunamayacağı değerlendirmedir. Yapay gözyaşı formülasyonlarına ve desiccation maruz kaldıktan sonra, insan kornea epitel hücreleri metabolik aktivite için değerlendirilir.

Yapay Gözyaşı Formülasyonlarının Desiccation'a Maruz Kalma sonrası İnsan Kornea Epitel Hücrelerinin Metabolik Aktivitesi Üzerine Etkisi

Burada, kornea epitelinin mekanik ve kimyasal hasarı için fare ve tavşana dayalı hayvan modelleri, yeni terapötikleri ve altta yatan mekanizmayı taramak için geliştirilmiştir.

Kornea Epitelinin Mekanik ve Kimyasal Yaralanmaları için Ex Vivo ve In Vivo Hayvan Modelleri

Kornea sütürleri ile birlikte kornea epitel küretajı yoluyla şiddetli kornea iltihabının bir sıçan modeli geliştirdik. Çalışma, enflamatuar koşullar altında kornea iltihabı paternlerini, epitel proliferasyonunu ve limbal kök hücrelerdeki değişiklikleri değerlendirdi.

Kornea Sütürleri ile Kombine Kornea Epitel Küretajına Dayalı Sıçanlarda Şiddetli Kornea İnflamasyonu Modelinin Oluşturulması

Domuz korneasının ex vivo organ kültürü ve epitelyal yara iyileşmesi, kimyasalların oküler toksisitesini test etmek için ekonomik, etik, tekrarlanabilir ve kantitatif bir araç sağlar. Ayrıca, epitelizasyon ve doku onarımının düzenlenmesinin altında yatan mekanizmaların aydınlatılmasına ve diyabetik keratopati ve gecikmiş yara iyileşmesinin tedavisi için terapötiklerin değerlendirilmesine yardımcı olurlar.

Organ Kültürü Domuz Korneaları Kullanılarak Terapötik ve Kimyasal Toksisitenin Değerlendirilmesi ve Epitel Yara İyileşmesi

Burada bir hava-sıvı arayüzü farklılaştırılmış büyüme de dahil olmak üzere insan bronşiyal solunum yolu doku eksplantlar birincil insan bronşiyal epitel hücreleri büyümek için detaylı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, insan akciğer sağlığı ve hastalıkları, solunum yolu epitel rolünü araştırmak için birincil hücreleri bol miktarda kaynak sağlar.

Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri

Öğrenin, UV radyasyonu ve kimyasal toksinlerin primer ile ölümsüzleştirilmiş insan kornea epitel hücreleri üzerindeki toksisitesini değerlendirmek için bu in vitro yöntemi. Hayvan deneylerini minimize eder.

UV Radyasyonu ve Kimyasallarının Primer ve Ölümsüzleştirilmiş İnsan Kornea Epitel Hücreleri Üzerindeki Toksisitesinin Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal

UV Radyasyonu ve Kimyasallarının Primer ve Ölümsüzleştirilmiş İnsan Kornea Epitel Hücreleri Üzerindeki Toksisitesinin Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet