Name: 建立区域特异性人多能干细胞衍生星形胶质细胞和神经元模拟ALS的电生理平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 了解利用人多能干细胞分化脊髓特异性星形胶质细胞和神经元并进行共培养的技术，通过电生理记录分析细胞相互作用，为研究肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病提供重要平台。

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本手稿得到了以下资助：2019年MSCRFF 5119（AT）；NIH/NINDS K08NS102526（CWH）；2020年多丽丝·杜克慈善基金会临床科学家职业发展奖（CWH）；NIH/NINDS 1R01NS117604-01（NJM）；美国国防部ALS研究计划W81XWH2010161（NJM）；2019年MSCRFD 5122（NJM）。我们感谢Raha Dastgheyb博士和Norman Haughey博士提供了我们用于验证所述电生理平台的MEA平台及数据分析软件。&#160;我们还要感谢Khalil Rust在实验方案演示和拍摄过程中提供的协助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

迄今为止，基于 hiPSC 和多电极阵列（MEA）的星形胶质细胞-神经元共培养电生理记录方法在肌萎缩侧索硬化症（ALS）研究领域中的应用仍较为有限6 并且尚未应用于完全人类化的平台，相比之下，其在更广泛用途中的应用 体外 癫痫建模9然而，该平台有望解决肌萎缩侧索硬化症（ALS）研究中具有病理生理学意义的问题，例如神经元过度兴奋的机制、星形胶质细胞对神经毒性的贡献，或神经网络活动在疾病进展中的作用。此外，该平台可实现长达9个月以上的前瞻性电生理数据采集。 体外 因此，提供了一种用于测试具有治疗潜力化合物的方法2.
文献中报道的 hiPSC-N 和 hiPSC-A 生成方案在培养基条件、培养时间、产量以及成熟特征等方面存在广泛差异。本平台的一个主要优势在于，星形胶质细胞和神经元是分别诱导分化，随后在较晚的时间点通过两种细胞类型的共同接种实现共培养。在对细胞密度和时间进行优化后，该方法也可推广应用于其他方案获得...

人诱导多能干细胞来源的星形胶质细胞（hiPSC-A）和神经元（hiPSC-N）是研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）病理生理机制的有力工具 体外 为药物发现策略提供转化研究范式1研究人员已证明，hiPSC-A 与 hiPSC-N 的共培养可促进两类细胞在形态学、分子水平、电生理学及药理学方面的成熟，形成复杂的神经元网络以及类似体内的星形胶质细胞-神经元相互作用 体内 对应物2,3类似的共培养实验可以重现肌萎缩侧索硬化症（ALS）病理生物学的特征，例如星形胶质细胞介导的神经毒性4,5 神经元过度兴奋性6此外，随着分化方案的进步，人诱导性多能干细胞（hiPSC）可被分化为具有区域特异性的神经亚型，包括皮层和脊髓来源的hiPSC-A和hiPSC-N7,8这些策略为模拟肌萎缩侧索硬化症（ALS）中皮层和脊髓运动神经元的病理变化以及星形胶质细胞对二者的影響提供了可能。然而，这需要一种可重复的功能性检测方法来确定这些效应。
最近研究表明，多电极阵列（MEA）记录特别适用于神经元-星形胶质细胞共培养体系的电生理表征2。与单细胞电生理分析不同，这些高密度电极阵列能够在不破坏培养条件且保持细胞膜完整性的前提下，被动记录大量神经元的细胞外场电位。这类平台特别适用于长期记录培养细胞的细胞及网络活动，以及其对药理学干预的响应。最后，当星形胶质细胞作为培养体系中的变量存在时，MEA记录可为星形胶质细胞与神经元之间的双向相互作用提供功能性见解2,9。
本文展示了一种经过先前验证的、用于将人诱导多能干细胞（hiPSC）分化为脊髓来源的hiPSC星形胶质细胞（hiPSC-A）和hiPSC运动神经元（MN）的优化方案2。该脊髓来源hiPSC-A分化方案可稳定获得星形胶质细胞培养物，其中分别有高达80%、50%和90%的细胞表达S100钙结合蛋白B（S100β）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和同源框B4（HOXB4），表明细胞具有成熟的胶质细胞特性及脊髓区域特异性2,10。hiPSC-MN分化方案所产生的神经元中，&gt;90%表达胆碱乙酰转移酶（ChAT），提示其具备成熟α运动神经元的身份特征2。此外，本方案还描述了生成hiPSC-A/MN共培养体系的技术，已有研究证实，与无星形胶质细胞或与啮齿类星形胶质细胞共培养的神经元相比，此类共培养体系中的神经元在Sholl分析和免疫荧光显微镜观察下表现出更复杂的形态结构2。尽管上述描述主要针对脊髓来源的hiPSC-A和hiPSC-N，但该方法的一个独特优势在于：先独立培养星形胶质细胞和神经元，再于后续时间点进行共培养的策略，可推广应用于研究其他特定脑区来源的神经元-星形胶质细胞相互作用，以及疾病特异性细胞间的相互作用7,8。最后，本方案还介绍了如何在微电极阵列（MEA）板上培养这些细胞，从而能够长期监测共培养体系组成对细胞功能活性的影响，并具备调控细胞组成和培养条件的能力。
这些实验方案的目的是提供一种功能性检测方法，用于研究星形胶质细胞与神经元之间的相互作用，观察与疾病相关的特异性变化，并测试在肌萎缩侧索硬化（ALS）领域具有治疗潜力的药物。对于本方案中最具挑战性的步骤，提供了视频操作说明。

<table><tbody><tr><td>10 cm 无菌培养皿</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 无菌培养瓶</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇（&amp;beta;-ME</td><td>Thermofisher</td><td>21985023</td><td>工作浓度 110 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>500 mL 0.2 &amp;micro;m CA 过滤系统</td><td>康宁</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 移液管</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>6 孔无菌培养板</td><td>Falcon</td><td>3046</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>工作浓度 2.0 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>含蛋白酶的阴离子洗涤剂 - Terg-A-Zyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287</td><td>工作浓度 1% m/v</td></tr><tr><td>抗坏血酸（ASAC）</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>将100 mg溶解于250 mL的dH₂O中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O以获得0.4 mg/ml的储存液。经0.22 μm滤膜无菌过滤 &amp;micro;m 滤器分装并置于 -80 冻存 &amp;ordm;C. 按1:1000稀释后使用。（工作浓度为0.4 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Axion CytoView MEA 24 孔板（M384-tMEA-24W）</td><td>Axion</td><td>OPT-24</td><td></td></tr><tr><td>Axion Edge MEA 平台</td><td>Axion</td><td>Maestro Edge</td><td></td></tr><tr><td>基底膜基质 - Matrigel</td><td>康宁</td><td>354277</td><td>实验方案中的细节</td></tr><tr><td>台式显微镜（在细胞培养罩内保持无菌）</td><td>Zeiss</td><td>415510-1100-000</td><td>Primo Vert</td></tr><tr><td>荷包牡丹碱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14340</td><td>工作浓度10 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>睫状神经营养因子（CNTF）</td><td>Peprotech</td><td>450-13</td><td>溶解 100 &amp;micro;g 溶于 1 mL 无菌 PBS 中，然后向其中加入 9 mL 无菌 0.1% BSA-PBS 至 10 &amp;micro;g/mL。分装后于 -80 ℃ 冻存 &amp;ordm;C. 按1:1000稀释后使用（工作浓度为10 ng/mL）。</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Axion Edge 的储液罐和调节器</td><td>AirGas/Harris</td><td>9296NC</td><td></td></tr><tr><td>化合物 E</td><td>Abcam</td><td>ab142164</td><td>溶解 250 &amp;micro;g 溶于 2.0387 mL DMSO 中，得到 250 &amp;micro;M 储存液。分装后于 -80 ℃ 冻存 &amp;ordm;C. 按1:2000稀释后使用（工作浓度为125 nM）。</td></tr><tr><td>Cyanquixaline&amp;nbsp; (CNQX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C239</td><td>工作浓度 50 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>二氢海人酸（Dihydrokainic acid, DHK）</td><td>Tocris</td><td>111</td><td>工作浓度 50 &amp;mu;M 和 300 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>113300</td><td>工作浓度 1x</td></tr><tr><td>Essential 8 培养基 + Essential 8 添加剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1517001</td><td>将10 mL Essential 8 (10x) 培养基混合&amp;nbsp; 加入500 mL Essential 8生长培养基（1×）</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16140071</td><td>工作浓度 1x</td></tr><tr><td>胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>溶解 100 &amp;micro;g 溶于 1 mL PBS 至 100 &amp;micro;g/mL，然后向其中加入9 mL无菌的0.1% BSA-PBS至10 &amp;micro;g/mL。分装后于 -80 ℃ 冻存 &amp;ordm;C. 按1:1000稀释后使用（工作浓度为10 ng/mL）。</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>电子显微科学</td><td>63510-20</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Millipore-sigma</td><td>H3149-100KU</td><td>将200 mg溶解于100 mL PBS中，配制成2 mg/mL的储存液。将储存液分装为每份15 mL和500 mL。 &amp;micro;L 型试管。使用时按 1:1000 稀释。（工作浓度为 2 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>湿度可控细胞培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>370</td><td>设定为37 &amp;ordm;C，5% CO2</td></tr><tr><td>胰岛素样生长因子1（IGF-1）</td><td>R&amp;amp;D 系统</td><td>291-G1-200</td><td>溶解 200 &amp;micro;g 溶于 2 mL PBS 至 100 &amp;micro;g/mL，然后加入18 mL 0.1% BSA-PBS，定容至10 &amp;micro;g/mL 储液，于 -80 保存 &amp;ordm;C. 分装并置于 -80 冰冻 &amp;ordm;C. 稀释10倍 &amp;micro;g/mL 原液按 1:1000 稀释使用（工作浓度为 10 ng/mL）。</td></tr><tr><td>红藻氨酸</td><td>Abcam</td><td>ab144490</td><td>工作浓度 5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>无血清替代物（Knockout Serum Replacement, KSR）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10828</td><td>工作浓度 1x</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23017-015</td><td>储存液浓度 1 mg/mL，工作浓度 10 &amp;micro;g/mL（包被），1 &amp;micro;g/mL（细胞培养基）</td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>将2 mg的LDN溶解于500 &amp;micro;加入氯仿至终浓度为10 mM的储存液。分装后于-80℃保存 &amp;ordm;C. 使用时，先将储存液按1:10的比例用DMSO稀释至1 mM，再将1 mM的溶液按1:5000的比例稀释到所需培养基中，以获得0.2 μM的终浓度。 &amp;micro;M 工作液</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25030</td><td>工作浓度 100 倍</td></tr><tr><td>MEA 玻璃板</td><td>MultiChannel Systems</td><td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器 P200</td><td>Gilson</td><td>PJ22224</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21103049</td><td>工作浓度 1x</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11140050</td><td>工作浓度 100x</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td>工作浓度 100 倍</td></tr><tr><td>多聚鸟氨酸（PLO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td>将100 mg溶解于1 mL去离子水中，配制成100 mg/mL的储存液。将储存液分装为每份100 μL &amp;micro;L 管。（工作浓度 100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>工作浓度100 mM</td></tr><tr><td>Purmorphamine (PMN)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>540223</td><td>将5 mg溶于9.6 mL DMSO中，配制成1 mM溶液。分装后于-80 ℃保存 &amp;ordm;C. 按1:1000稀释后使用。（工作浓度为1 &amp;micro;M)</td></tr><tr><td>重组人脑源性神经营养因子（BDNF）</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>离心片刻后再进行重悬。溶解100 &amp;micro;g 溶于 1 mL PBS 至 100 &amp;micro;g/mL，然后向其中加入 9 mL 无菌的 0.1% BSA-PBS &amp;micro;g/mL。分装后于 -80 ℃ 冻存 &amp;ordm;C. 按1:1000稀释后使用（工作浓度为10 ng/mL）。</td></tr><tr><td>视黄酸（RA）</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>将100 mg溶解于3.3 mL DMSO中，配制成100 mM的储存液。分装储存液100 &amp;micro;L型管，-80℃冻存 &amp;ordm;C. 取 200 &amp;micro;100 mM 原液取 L，稀释 10 倍（加入 1.8 mL DMSO）制备 10 mM 原液。分装 50 &amp;micro;L型管&amp;nbsp;并储存于 -80 &amp;ordm;C. 按1:10000稀释后使用。（工作浓度为2 &amp;micro;M)</td></tr><tr><td>ROCK-I 抑制剂</td><td>Peprotech</td><td>1293823</td><td>将5 mg溶解于1480 &amp;micro;L 的 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 配制成 10 mM 储存液，分装后于 -80 ℃ 冻存 &amp;ordm;C. 按1:500稀释后使用。（工作浓度为20 &amp;micro;M)</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td>将5 mg溶解于1.3 mL DMSO中，配制成10 mM储备液。分装后于-80 ℃保存 &amp;ordm;C. 使用时按1:1000稀释。（工作浓度10 &amp;micro;M)</td></tr><tr><td>无菌细胞培养罩</td><td>贝克公司</td><td>SG-600</td><td></td></tr><tr><td>补充剂 B - B27 补充剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21985023</td><td>工作浓度 50x</td></tr><tr><td>补充剂 N - N2 补充剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17502048</td><td>工作浓度 100 倍</td></tr><tr><td>台式细胞培养离心机</td><td>ThermoFisher</td><td>75004261</td><td>Sorvall Legend X1R</td></tr><tr><td>热塑性塑料&amp;nbsp;薄膜 - Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>组织解离蛋白酶 - Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7923</td><td>工作浓度 1x</td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T6522-1G</td><td>将1g溶于100mL ddH₂O中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O以配制10 mg/mL的储存液。分装后于4℃保存 &amp;ordm;C. 将胰蛋白酶按1:10体积稀释后使用（工作浓度为1 mg/mL）。</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>2530054</td><td>工作浓度 1x</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>2332</td><td>Isotemp</td></tr></tbody></table>

建立用于模拟肌萎缩侧索硬化症的电生理平台：采用区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

人诱导多能干细胞来源的星形胶质细胞（hiPSC-A）和神经元（hiPSC-N）为研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）的病理生理机制提供了有力工具 体外多电极阵列（MEA）记录是一种用于记录大量神经元群体的电场电位并随时间分析神经网络活动的方法。先前的研究已表明，当使用促进脊髓星形胶质细胞表型的分化技术获得的人诱导多能干细胞来源的星形胶质细胞（hiPSC-A）与具有区域特异性的脊髓来源人诱导多能干细胞运动神经元（MN）共培养时，相较于无hiPSC-A共培养或与啮齿类动物星形胶质细胞共培养的情况，能够促进神经元的成熟并增强其电生理活性。本文描述了一种将脊髓区域特异性hiPSC-A与hiPSC-MN共培养，并利用MEA记录其电生理活动的方法。尽管本文所述的分化方案专门针对具有脊髓区域特异性的星形胶质细胞和神经元，但该共培养平台亦可应用于其他谱系特异性分化所得的星形胶质细胞与神经元，包括皮层来源的hiPSC-A与hiPSC-N。这些实验方案旨在提供一种电生理检测手段，以研究胶质细胞与神经元之间的相互作用，并为在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中具有治疗潜力的药物筛选提供平台。

多电极阵列, 人诱导多能干细胞, 星形胶质细胞, 运动神经元, 脊髓, 电生理记录, 共培养, 肌萎缩侧索硬化症

生成hiPSC-MN和脊髓hiPSC-A的脊髓模式化方案如图1所示。在本方案中，hiPSC以非融合集落形式进行维持和传代（图2A）。通过添加LDN193189和SB431542实现双SMAD抑制，从而启动神经发生（神经诱导），分别抑制骨形态发生蛋白（BMP）和转化生长因子-β（TGF-β）信号通路。该步骤采用基于单层培养的方法，将hiPSC接种于黏附基质（如基底膜基质）上，以生成类似神经上皮的二维培养体系。从形态学上看，神经诱导的特征是细胞由具有大细胞核和圆形形态的iPSC转变为紧密排列、细胞质丰富且呈柱状的神经上皮（干细胞）样细胞。这些细胞将进行水平和垂直方向的分裂，形成多层上皮结构（图2B，i）。
相较于三维策略（即基于胚状体的方法），选择二维策略的依据来自文献证据11,<sup class="xr...

我们描述了一种用于诱导人源多能干细胞分化为脊髓星形胶质细胞和神经元，并将其共培养以进行电生理记录的方法。

由人多能干细胞衍生的星形胶质细胞（hiPSC-A）和神经元（hiPSC-N）为肌萎缩侧索硬化症（ALS）的建模提供了强有力的工具……

我们今天介绍的技术能够分析脊髓神经元活动，该活动受神经元内在因素以及周围星形胶质细胞影响。该技术可稳定地生成具有脊髓特异性的功能性人源神经元和人源星形胶质细胞，并采用可量化、可重复的功能性输出指标。本技术可用于研究脊髓特异性神经元疾病，例如肌萎缩侧索硬化症，可使用来自散发性或遗传性疾病的患者神经元进行相关研究。首先，检查人iPSC培养板，观察是否具有足够密集的克隆，且克隆中心出现散在的白色区域。随后开始进行细胞包装，在培养板底部外表面用记号笔绘制网格线，以帮助准确覆盖整个培养板。在超净台内使用10倍放大倍率的相差显微镜，通过200微升移液器枪头手动刮除已分化的克隆，使其脱离。接下来，用 PBS 清洗平板两次。然后加入 5 mL 预先在 37°C 下温育的组织解离蛋白酶。将细胞在 37°C 下孵育 4 至 7 分钟，直至克隆边缘开始变圆，再进行克隆从培养板上的剥离操作。小心吸除消化用蛋白酶，并用 PBS 轻轻冲洗培养板两次，注意不要使细胞集落脱落。向培养板中加入 5 mL 预热的人诱导多能干细胞（iPSC）培养基。然后用 5 mL 移液器枪头从上至下前后刮擦整个培养板表面，同时将细胞集落刮起并破碎成较小的细胞团块。将人iPSC诱导分化为神经前体细胞。当人iPSC形成单层且融合度达到90%时，按照文中的描述开始分化。第12天经胰蛋白酶处理后，若细胞未悬浮，可使用1000微升移液器枪头将神经诱导培养基以环形方式吹打至细胞表面，使其覆盖整个培养区域，从而机械性地分离细胞。如果神经前体细胞培养物已被冷冻，则将其解冻。按照文稿中所述进行培养基更换和PBS洗涤后，更换为含有0.02微摩尔阿糖胞苷的运动神经元分化培养基，然后在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养48小时，此时胶质定向前体细胞作为单个增殖的扁平细胞出现在处于有丝分裂后阶段的运动神经元前体细胞下方，并在细胞簇中聚集。随后，按照文稿中所述进行培养基更换。在铺板当天或前一天，开始包被24孔MEA板。首先将PLO溶于水或PBS中进行稀释，然后向每个孔中加入15至20微升PLO，使液体在孔中央形成液滴，覆盖电极区域，注意移液枪头不要损伤电极。向孔周围的腔室中加入水，以确保足够的湿度。将PLO在37摄氏度孵育1至2小时。然后使用塑料微量移液器吸头，尽可能吸除PLO溶液，注意不要触碰电极。接着用250微升水洗涤孔板三次。使用移液枪枪头尽可能吸除水分，并在打开盖子的情况下让表面干燥。接着，加入15至20微升稀释后的层粘连蛋白，以覆盖每个电极阵列。向湿度槽中加入水并盖上盖子后，在37摄氏度下孵育至少两小时，最长可过夜。铺板当天，用 PBS 将运动神经元和星形胶质细胞培养物冲洗一次后，加入 0.05% 胰蛋白酶，于 37 摄氏度孵育约五分钟以使细胞脱落。将细胞收集至含有胰蛋白酶抑制剂的 15 毫升锥形管中，并用培养基或缓冲液冲洗培养板，以确保所有细胞均被收集。通过离心沉淀细胞。然后使用1000微升移液器，用含有20微摩尔ROCK抑制剂的共培养基重悬运动神经元和星形胶质细胞，制备成1毫升单细胞悬液。使用血细胞计数板对运动神经元和星形胶质细胞进行计数。计数的同时，将细胞悬液置于四摄氏度的泡沫塑料架上。取一毫升两种细胞悬液，于300 × g 离心五分钟。计算所需体积，并重悬细胞沉淀。按相等比例混合所需体积的神经元和星形胶质细胞悬液，轻轻吹打两次，充分混匀。随后吸除每孔中的层粘连蛋白，并将10 µL最终混合的细胞悬液转移至各孔，形成覆盖电极阵列的小液滴。将细胞液滴在37°C条件下静置孵育20至30分钟，使细胞在孔板上形成初始贴附。然后将含有ROCK抑制剂的250微升预热共培养基沿每个孔的孔壁缓慢加入，并在每个孔的对侧孔壁同样加入相同体积的培养基，将培养板置于37°C孵育24至36小时。次日，观察培养板中是否有碎片或死亡细胞。如有需要，更换为新鲜的含ROCK抑制剂的共培养基。否则，从共培养第二天开始，使用不含ROCK抑制剂的共培养基，每周进行两次半量换液。进行记录时，应从共培养第一天后尽快开始，将温度设置为37摄氏度，二氧化碳浓度设置为5%。然后将培养板转移至记录仪器，平衡至少五分钟后再开始记录。根据实验设计，每隔一天或每周记录一次基线活性，每次持续1至15分钟。为了研究靶向神经元或星形胶质细胞的化合物的瞬时电生理效应，需移除培养板盖，但保持仪器盖关闭，记录至少一分钟的基础电活动。在不停止电生理记录的情况下，手动打开仪器盖，用适当的药物溶剂置换25微升培养基。然后手动关闭盖子，并根据需要继续记录数分钟。同样，测试目标药物。在本方案中，hiPSCs 以非融合集落的形式进行培养和传代。通过抑制 BMP 和 TGF-β 通路的双重 SMAD 抑制来启动神经发生。由此产生的神经上皮干细胞分裂并形成多层上皮结构。早期暴露于神经元生长因子和促胶质生成的睫状神经营养因子，产生了一群混合的前体细胞。神经元从这群混合前体细胞中自发出现。通过激活JAK-STAT通路，促胶质细胞转换诱导了星形胶质细胞的分化。经Notch抑制剂处理并分化的运动神经元细胞表现出脊髓特性，这由高水平的胆碱乙酰转移酶表达所支持。在体外培养第90天，人iPSC来源的星形胶质细胞表现出成熟表型，表现为S100β和GFAP的表达，而其脊髓区域特性则由Hb9的表达所支持。共培养的细胞自发地重新排列，星形胶质细胞在底部形成一层滋养层，而神经元在顶部连接成网络。单独培养时，神经元会聚集形成大的细胞簇；而将人iPSC来源的运动神经元与人iPSC来源的星形胶质细胞共培养，则形成了均匀分布的单层结构。人iPSC来源的星形胶质细胞促进了人iPSC来源运动神经元的电生理成熟，共培养体系中神经元的放电和簇状放电活动显著增强即证明了这一点。根据我们的经验，干细胞培养和早期神经前体细胞分化是最具挑战性且对技术误差最为敏感的步骤。在此阶段，相关技术操作必须保持高度的一致性和准确性，容错空间极小。本文所述的共培养技术也可应用于其他细胞类型特异性的模型中。

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建立区域特异性人多能干细胞衍生星形胶质细胞和神经元模拟ALS的电生理平台

该视频展示了一种利用人多能干细胞的前体细胞生成星形胶质球体的方法。该方法包括在含有生长因子和激酶抑制剂的营养培养基中培养并扩增干细胞。随后这些细胞聚集并分化为星形胶质细胞，形成星形胶质球体。...

利用人多能干细胞生成与维持星形胶质细胞球

本视频展示了一种将脊髓神经前体细胞（NPCs）分化为运动神经元的方法。该方法详细介绍了在包被的培养板上使用特定培养基培养NPCs的过程，该培养基中添加了特定的抑制剂，旨在促进NPCs向成熟运动神经元的分化。...

脊髓神经前体细胞向运动神经元的分化

本视频展示了建立神经元-星形胶质细胞共培养体系以记录神经元网络活动的方法。将运动神经元与星形胶质细胞共培养于多电极阵列（MEA）培养板上后，利用MEA对外记录神经元网络的同步节律性电活动。...

记录神经元-星形胶质细胞共培养体系中神经网络的电生理活动

本文描述了一种建立共培养体系的方案，该体系包含由诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的神经元、原代皮层神经元以及星形胶质细胞。该共培养系统可用于检测新生成的、由iPSCs衍生的神经元与已存在的表达光敏通道蛋白-2（channelrhodopsin-2）的皮层神经元之间突触连接和神经回路的形成。...

一种用于评估共培养系统中神经元连接形成的光遗传学方法

我们修改并实施了一项先前发表的方案，该方案描述了将人 诱导 多能干细胞（hiPSCs）快速、可重复且高效地分化为兴奋性皮层神经元的方法12。具体而言，我们的改进可实现对神经元细胞密度的控制，并可在微电极阵列上应用，以在神经网络水平上检测其电生理特性。...

利用微电极阵列测量网络活性的诱导多能干细胞快速神经元分化

我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的"活体支架"具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。...

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

在本实验方案中，我们旨在描述一种可重复的方法，用于将解离的人多能干细胞来源的神经元与星形胶质细胞共同组合形成三维球状共培养体系，在悬浮条件下维持这些细胞球的生长，并随后通过免疫分析和多电极阵列记录来检测细胞球中突触环路的活性。...

利用人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元三维共培养构建突触微环路模型

由于缺乏足够的工具和方法，神经退行性疾病中神经元与胶质细胞之间的相互作用尚未被充分理解。在此，我们描述了从人多能干细胞获得诱导神经元、少突胶质前体细胞以及少突胶质细胞的优化方案，并举例说明这些方法在理解阿尔茨海默病中细胞类型特异性贡献方面的应用价值。...

由多能干细胞生成人神经元和少突胶质细胞以模拟神经元-少突胶质细胞相互作用

多能干细胞, 神经元, 少突胶质细胞, 细胞分化, 神经发育, 共培养, 神经退行性疾病, 人源细胞模型, 髓鞘形成, 神经胶质生物学

我们描述了一种将人皮肤来源的成纤维细胞重编程为诱导性神经前体细胞（iNPCs），并进一步将其分化为诱导性星形胶质细胞（iAs）的实验方案。该方法可快速、可重复地大量生成iNPCs和iAs。...

利用成纤维细胞直接转化为神经祖细胞并分化为星形胶质细胞的体外神经疾病建模

本方案旨在将背腹侧融合类脑器官稳定接种于多电极阵列上，用于癫痫建模 体外.

一种用于癫痫建模的多电极阵列平台：基于人多能干细胞衍生脑类组装体

了解利用人多能干细胞分化脊髓特异性星形胶质细胞和神经元并进行共培养的技术，通过电生理记录分析细胞相互作用，为研究肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病提供重要平台。

建立用于模拟肌萎缩侧索硬化症的电生理平台：采用区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元

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