Name: Mesure de l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéopathie TDP-43 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Découvrez la mesure de l'absorption du glucose dans les neurones moteurs de Drosophila à l'aide d'un capteur FRET. Cette méthode permet d'évaluer les changements métaboliques en temps réel dans les modèles de protéopathie TDP-43.

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Nous remercions Stefanie Schirmeier et Takeshi Iwatsubo d’avoir fourni des souches de drosophiles. Nous remercions également Patricia Jansma d’avoir aidé à l’imagerie dans le Marley Imaging Core de l’Université de l’Arizona. Ce travail a été financé par les National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (à DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (à EM) et le undergraduate Biology Research Program (à HB).

Les mouches transgéniques UAS FLII12Pglu-700μδ6 ont été signalées dans Volkenhoff et al.10 et aimablement fournies par le Dr S. Schirmeier. Les lignées transgéniques UAS TDP-43G298S ont été aimablement fournies par le Dr T. Iwatsubo13. Des lignées recombinantes de drosophiles abritant à la fois des transgènes UAS FLII12Pglu-700μδ6 et UAS TDP-43 ont été générées dans le laboratoire Zarnescu en utilisant des approches génétiques standard et rapportées dans Manzo et al.9. D42 GAL4 a été utilisé pour piloter l’expression du capteur de glucose seul ou avec TDP-43G298S dans les motoneurones. Toutes les lignes de mouche sont maintenues sur des milieux de semoule de maïs à la mélasse, à 25 °C en 12 h de cycle sombre/lumière.
1. Dissections du cordon nerveux ventral de la drosophile (VNC)
<ol><li>Fabriquez des plats de dissection en élastomère de silicone.<ol>
<li>Versez les composants en élastomère de silicone dans un tube de 50 mL comme indiqué dans le protocole du fabricant et remuez bien.</li>
		<li>Remplir des boîtes de culture tissulaire de 35 mm avec environ 2 mL du mélange d’élastomères. Utilisez une seringue pour enlever les bulles. Couvrir les plats et les placer sur une surface plane dans un four à 60 °C pendant la nuit pour durcir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disséquez les larves de drosophiles pour exposer le VNC tout en maintenant la viabilité des tissus.<ol>
<li>Recueillir une larve errante du troisième stade, rincer avec ddH2O, puis la placer dans une goutte de tampon HL3 (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2,10 mM NaHCO3,115 mM de saccharose, 5 mM de tréhalose, 5 mM HEPES; pH 7,1) sur un plat tapissé d’élastomère.</li>
		<li>À l’aide d’une paire de pinces (#5 ou 55 forceps) sous un microscope à dissection, épinglez les extrémités antérieure et postérieure de la larve dorsale vers le haut, en étirant soigneusement la larve dans le sens de la longueur avec des épingles à insectes (Minutein Pins).</li>
		<li>Faites une incision juste au-dessus de l’épingle postérieure à l’aide d’une paire de ciseaux à iris inclinés. Faites une coupe verticale à partir de l’incision vers l’extrémité antérieure de la larve.</li>
		<li>Ajoutez quelques gouttes de tampon HL-3 si nécessaire. Retirez la trachée et le reste des organes flottants sans perturber le SNC. Épinglez les volets qui étirent la paroi corporelle pour exposer le SNC tout en gardant le système neuromusculaire (VNC, axones et jonctions neuromusculaires) intact.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Acquisition d’images
<ol><li>Optimisez les paramètres d’imagerie.<ol>
<li>Allumez le microscope et les lasers avant de commencer les dissections. Les images doivent être acquises à l’aide d’un microscope confocal vertical avec une lentille d’immersion dans l’eau 40x. Utilisez un laser de 405 nm pour exciter la CFP et acquérir les images dans les canaux de détection CFP (465-499 nm) et FRET (535-695 nm).</li>
		<li>Optimisez les paramètres d’acquisition tels que la vitesse de numérisation (6), la moyenne (2), l’objectif (40x), le zoom (1x), la taille du sténopé (1 UA) et la résolution spatiale (512 x 512). Ajustez le gain de manière à ce que le signal se trouve dans la plage dynamique optimale. Les mêmes paramètres doivent être utilisés pour tous les génotypes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Image des motoneurones au sein du VNC.<ol>
<li>Placez le plat en silicone avec l’échantillon disséqué sous la lentille. Abaissez la lentille de manière à ce qu’elle entre en contact avec le tampon HL3 tréhalose-saccharose (voir 1.2.1). Il est essentiel de s’assurer que la lentille est complètement immergée dans le tampon. Ajoutez plus de tampon si nécessaire.</li>
		<li>Utilisez les canaux CFP et FRET pour sélectionner manuellement une section optique composée d’au moins 6 motoneurones au point, situés le long de la ligne médiane VNC. Les motoneurones sont identifiés en fonction de l’expression du capteur de glucose et de la position le long de l’axe antérieur-postérieur.</li>
		<li>Acquérir des images toutes les 10 s pendant 10 min. Ces images représentent la ligne de base.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stimuler avec du glucose supplémenté HL-3.<ol>
<li>Retirer le tréhalose-saccharose contenant un tampon HL3 à l’aide d’une pipette Pasteur et le remplacer par du HL-3 supplémenté de glucose de 5 mM (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 20 mM MgCl2,10 mM NaHCO3,115 mM de saccharose, 5 mM de glucose, 5 mM HEPES, pH 7,1). Cette étape doit être effectuée avec le plus grand soin, afin d’éviter autant que possible le mouvement du VNC.</li>
		<li>Acquérez des images toutes les 10 s pendant 10 minutes supplémentaires. Ces images représentent la phase de stimulation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enregistrez les images en tant que fichiers .czi ou tout type de fichier pris en charge par le logiciel d’imagerie avec un nom de fichier comprenant la date, le fond génétique, l’état expérimental (ligne de base ou stimulation) et les canaux utilisés.</li>
	<li>Réutilisez les paramètres pour imager tous les génotypes (Figure 2A).</li>
</ol>3. Traitement de l’image et sélection du retour sur investissement
<ol><li>Ouvrez les fichiers czi dans Fiji/ImageJ et définissez Mode couleur: Niveaux de gris,choisissez Afficher la pile avec : Hyperstack, et sélectionnez Diviser les canaux en fenêtres séparées.</li>
	<li>Traitez les images à l’aide des plugins de correction de dérive: turboreg et stackreg. Chaque canal est corrigé séparément en sélectionnant Stackreg sous Plugins, puis choisissez Transformation: Translation.</li>
	<li>Sélectionnez manuellement les régions d’intérêt (ROI) pour extraire la valeur grise moyenne de chaque canal.<ol>
<li>Choisissez les ROI en traçant tous les motoneurones qui restent au centre de l’attention sur toute la série chronologique. Utilisez le gestionnaire de retour sur investissement pour enregistrer chaque contour de motoneurone.</li>
		<li>Utilisez la fonction Multi-mesure pour mesurer la valeur grise moyenne dans chaque retour sur investissement à chaque point temporel. Copiez les retours sur investissement tracés du premier canal vers le deuxième canal pour l’image de pré-stimulation.</li>
		<li>Répétez ce processus pour les images post-stimulation dans chaque canal en utilisant les mêmes cellules/ROI sélectionnés pour l’image de pré-stimulation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analyse des données
<ol><li>Calculez le rapport FRET/CFP en utilisant les valeurs grises moyennes pour les canaux FRET et CFP. Les changements dans les rapports FRET/CFP reflètent des altérations de la concentration intracellulaire de glucose.<ol>
<li>Tracez les ratios FRET/CFP pour chaque retour sur investissement et point de temps par rapport au temps. Dans chaque VNC, certains des ROI présenteront une baisse des rapports FRET/CFP après la stimulation. REMARQUE: Ceci est interprété comme une incapacité de certains neurones à absorber le glucose, peut-être en raison du stress causé par des dissections et sont donc éliminés de l’analyse. Les rapports FRET/CFP restants pour chaque ROI et point de temps sont moyennés pour générer un seul rapport FRET/CFP par point de temps et par génotype (capteur de glucose seul et capteur de glucose avec TDP-43G298S). Ces rapports FRET/CFP uniques sont utilisés pour toutes les normalisations ultérieures. 31 ROI ont été analysés pour les contrôles des capteurs de glucose et 24 ROI ont été analysés pour le TDP-43G298S.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normalisation de base : calculez la moyenne des rapports FRET/CFP pendant les 10 premières minutes (ligne de base), puis normalisez les rapports FRET/CFP individuels pour chaque point temporel de l’ensemble de l’expérience à la moyenne de référence de 10 minutes (voir Figure 2B).</li>
	<li>Normalisation des points temporels : Normalisez les rapports FRET/CFP TDP-43G298S par rapport aux rapports FRET/CFP à partir du capteur de glucose seul à chaque point temporel (voir Figure 3A).</li>
	<li>Graphiques à barres : Pour les comparaisons entre les lignes de base et la stimulation sous forme de graphiques à barres, utilisez des rapports FRET/CFP de 5 à 10 minutes (ligne de base) et de 15 à 20 minutes (stimulation) pour chaque génotype. Normaliser le rapport de stimulation par rapport au rapport de référence (voir la figure 3B).</li>
</ol>5. Analyses statistiques
<ol><li>Évaluez les ensembles de données normalisées à l’aide de la correction de Mann-Whitney (pour les normalisations de base et de points temporels) ou du test de Kruskall-Walis (pour la représentation graphique à barres de la stimulation par rapport aux rapports FRET/CFP de base).</li>
</ol>

<ol><li>Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).</li>
<li>Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).</li>
<li>Buratti, E., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+implications+of+the+RNA+binding+properties+of+nuclear+factor+TDP-43%2C+a+novel+splicing+regulator+of+CFTR+exon+9%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).</li>
<li>Polymenidou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+pre-mRNA+depletion+and+RNA+missplicing+contribute+to+neuronal+vulnerability+from+loss+of+TDP-43%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).</li>
<li>Tollervey, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+RNA+targets+and+position-dependent+splicing+regulation+by+TDP-43%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).</li>
<li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+mechanisms+in+ALS+and+FTD%3A+disrupted+RNA+and+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li>
<li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+and+A315T+mutant+TDP-43+exert+differential+neurotoxicity+in+a+Drosophila+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS.</a> Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).</li>
<li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+glia+exhibit+specific+individualized+responses+to+TDP-43+expression+in+a+Drosophila+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).</li>
<li>Manzo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolysis+upregulation+is+neuroprotective+as+a+compensatory+mechanism+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS.</a> eLife. 8, 45114(2019).</li>
<li>Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+using+a+FRET+glucose+sensor+reveals+glucose+delivery+to+all+cell+types+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain.</a> Journal of Insect Physiology. 106, Pt 1 55-64 (2018).</li>
<li>Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+dynamics+of+glucose+uptake+in+the+cytosol+of+COS-7+cells+by+fluorescent+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).</li>
<li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimedica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).</li>
<li>Ihara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+mediates+neurotoxicity+in+the+transgenic+Drosophila+model+of+TDP-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy.</a> Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+neuronal+glucose+concentrations+with+a+genetically+encoded+fluorescence+lifetime+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor.</a> Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).</li>
<li>Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+for+the+brain%3A+the+role+of+glucose+in+physiological+and+pathological+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).</li>
<li>Lu, B., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of neurodegenerative diseases.</a> Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La technique décrite en détail ici peut être appliquée pour mesurer l’absorption du glucose dans un type cellulaire spécifique d’intérêt chez la drosophile vivante en utilisant FLII12Pglu-700μδ6, un capteur basé sur FRET qui peut détecter les changements dans les niveaux de glucose à une gamme millimolaire10,11,12. Ce capteur a déjà été utilisé en conjonction avec le système UAS-GAL4 pour cibler son expression sur des t...

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative progressive qui est actuellement incurable. La SLA affecte les motoneurones supérieurs et inférieurs entraînant une perte de coordination motrice, une paralysie irréversible, une insuffisance respiratoire et la mort éventuelle dans les 2 à 5 ans suivant le diagnostic1. La SLA est associée à des défauts métaboliques tels que la perte de poids, la dyslipidémie et l’hypermétabolisme (examinés en2); cependant, on ne sait toujours pas comment ces altérations du métabolisme sont liées à la dégénérescence des motoneurones. Un dénominateur commun dans la SLA et les maladies neurodégénératives connexes est le TDP-43, une protéine de liaison aux acides nucléiques impliquée dans plusieurs étapes du traitement de l’ARN3,4,5. Bien que les mutations du TDP-43 n’affectent que 3% à 5% des patients, la protéine TDP-43 de type sauvage se trouve dans les agrégats cytoplasmiques dans >97% des cas de SLA (examinés dans6). Cette pathologie a été modélisée chez la drosophile par surexpression de type sauvage humain ou de TDP-43 mutant (G298S) dans les motoneurones, qui récapitule de multiples aspects de la SLA, notamment les inclusions cytoplasmiques, le dysfonctionnement locomoteur et la durée de vie réduite7,8. En utilisant ces modèles, il a été récemment rapporté que la protéinopathie TDP-43 provoque une augmentation significative des niveaux de pyruvate et d’ARNm phosphofructokinase (PFK), l’enzyme limitant le taux de glycolyse9. Des augmentations similaires des transcriptions de PFK ont été trouvées dans les motoneurones et la moelle épinière dérivés du patient, suggérant que la glycolyse est régulée à la hausse dans le contexte de la protéinopathie TDP-43. Fait intéressant, une augmentation supplémentaire de la glycolyse à l’aide de manipulations alimentaires et génétiques a atténué plusieurs phénotypes de la SLA tels que le dysfonctionnement locomoteur et l’augmentation de la durée de vie dans les modèles de mouche de la protéinopathie TDP-43, compatible avec un mécanisme neuroprotecteur compensatoire dans les motoneurones en dégénérescence.
Pour sonder davantage les changements dans la glycolyse et mesurer l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéinopathie TDP-43, un capteur à base de FRET génétiquement codé précédemment FLII12Pglu-700μδ610 a été exprimé dans les motoneurones spécifiquement en utilisant le système d’expression UAS-GAL4. Le capteur de glucose FLII12Pglu-700μδ6 utilise le transfert d’énergie par résonance entre deux variantes de protéines fluorescentes vertes, les protéines fluorescentes cyan et jaunes (CFP et YFP) pour détecter le glucose au niveau cellulaire. Il s’agit d’un domaine de liaison au glucose bactérien du gène E. coli MglB fusionné à CFP et YFP aux extrémités opposées de la molécule. Lorsqu’il est lié à une molécule de glucose, le capteur subit un changement conformationnel rapprochant CFP et YFP et permettant à FRET de se produire, qui peut ensuite être utilisé pour quantifier les niveaux de glucose intracellulaire10,11,12 ( Figure1). Ici, nous montrons comment le capteur FLII12Pglu-700μδ6 peut être utilisé pour déterminer les changements dans l’absorption du glucose causés par la protéinopathie TDP-43 dans les motoneurones. Les expériences décrites ici montrent que la surexpression d’un mutant associé à la SLA, TDP-43G298S,dans les motoneurones provoque une augmentation significative de l’absorption de glucose par rapport aux témoins. Cette approche peut être utilisée dans d’autres types de SLA (p. ex. SOD1, C9orf72, etc.) et/ou d’autres types de cellules (p. ex. glie, muscles) pour déterminer les changements dans l’absorption du glucose associés à la neurodégénérescence.

<table><tbody><tr><td>Boîtes de culture tissulaire 35 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>40X lentille immergée dans l’eau</td><td>Zeiss</td><td>440090</td><td>plongeable, N.A. 0.8</td></tr><tr><td>ciseaux de dissection</td><td>Roboz</td><td>RS-5618</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pince</td><td>VWR</td><td>100189-236</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 pince</td><td>VWR</td><td>100189-244</td><td></td></tr><tr><td>goupilles</td> <td>minutienOutils de science fine</td><td>26002-10</td><td>utilisés pour les dissections</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Kit d’élastomère de silicone</td><td>Dow</td><td>1317318</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM880 NLO microscope multiphotonique/confocal droit</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéopathie tdp-43

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative provoquant une faiblesse musculaire progressive et la mort dans les 2 à 5 ans suivant le diagnostic. Les manifestations cliniques comprennent la perte de poids, la dyslipidémie et l’hypermétabolisme; cependant, on ne sait toujours pas comment ceux-ci sont liés à la dégénérescence des motoneurones. En utilisant un modèle de drosophile de la protéopathie TDP-43 qui récapitule plusieurs caractéristiques de la SLA, y compris les inclusions cytoplasmiques, le dysfonctionnement locomoteur et la durée de vie réduite, nous avons récemment identifié de vastes déficits métaboliques. Parmi ceux-ci, la glycolyse s’est avérée être régulée à la hausse et les expériences d’interaction génétique ont fourni des preuves d’un mécanisme neuroprotecteur compensatoire. En effet, malgré la régulation à la hausse de la phosphofructokinase, l’enzyme limitant le taux dans la glycolyse, il a été démontré qu’une augmentation de la glycolyse à l’aide de manipulations alimentaires et génétiques atténuait le dysfonctionnement locomoteur et augmentait la durée de vie dans les modèles de mouches de la protéinopathie TDP-43. Pour étudier plus avant l’effet de la protéinopathie TDP-43 sur le flux glycolytique dans les motoneurones, un capteur à base de FRET génétiquement codé précédemment, FLII12Pglu-700μδ6, a été utilisé. Ce capteur est composé d’un domaine de détection du glucose bactérien et de protéines fluorescentes cyan et jaunes comme la paire FRET. Lors de la liaison au glucose, le capteur subit un changement conformationnel permettant à FRET de se produire. En utilisant FLII12Pglu-700μδ6, l’absorption de glucose s’est avérée significativement augmentée dans les motoneurones exprimant TDP-43G298S, une variante causant la SLA. Ici, nous montrons comment mesurer l’absorption de glucose, ex vivo,dans les préparations larvaires du cordon nerveux ventral exprimant le capteur de glucose FLII12Pglu-700μδ6 dans le contexte de la protéinopathie TDP-43. Cette approche peut être utilisée pour mesurer l’absorption du glucose et évaluer le flux glycolytique dans différents types de cellules ou dans le contexte de diverses mutations causant la SLA et les troubles neurodégénératifs connexes.

Acquisition d’images du capteur de glucose dans le cordon nerveux ventral (VNC), ex vivo Pour déterminer les différences dans l’absorption du glucose dans un modèle de drosophile de la SLA basé sur le TDP-43, un capteur de glucose à base de FRET génétiquement codé a été utilisé. Le capteur comprenait CFP et YFP fusionnés au domaine de liaison au glucose à partir du gène E. coli MglB. La liaison au glucose provoque un changement conformationnel, qui peut êt...

L’absorption du glucose est augmentée dans les motoneurones de la drosophile affectés par la protéinopathie de la protéine de liaison à l’ADN TAR (TDP-43), comme l’indique un capteur de glucose génétiquement codé à base de FRET.

Mesure de l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéopathie TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Cette technique est importante car elle peut mesurer l’absorption du glucose dans des cellules spécifiques dans les tissus vivants de la drosophile. Le capteur basé sur FRET fournit une mesure directe des changements dans les niveaux de glucose intracellulaire. Cette technique permet aux chercheurs d’évaluer les changements dans les niveaux de glucose en temps réel, dans les motoneurones vivants à partir de modèles de SLA par rapport à des témoins.Un aspect difficile est l’imagerie du même ensemble de neurones après avoir changé le tampon. Laisser l’échantillon sur le microscope permet de s’assurer que le VMC bouge le moins possible. Avant de commencer les dissections, allumez le microscope d’imagerie et les lasers.Ensuite, recueillez une larve errante du troisième stade, rincez-la à l’eau distillée double et placez-la dans une goutte de tampon HL3 sur un plat tapissé d’élastomère préalablement préparé. Ensuite, sous un microscope à dissection, utilisez une paire de pinces pour épingler les extrémités antérieure et postérieure de la larve, côté dorsal vers le haut, en étirant soigneusement la larve dans le sens de la longueur avec des épingles à insectes. À l’aide d’une paire de ci

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La vidéo présente une technique de mesure de l’absorption du glucose dans les motoneurones larvaires de la drosophile à l’aide d’un capteur de glucose intracellulaire basé sur le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET). Après avoir disséqué les larves pour exposer le cordon nerveux ventral, les motoneurones sont visualisés à travers la fluorescence émise par le fluorophore donneur du capteur. Lorsqu'il est stimulé par du glucose, le FRET entre les fluorophores donneur et...

Évaluation de l’absorption du glucose dans les motoneurones des larves de drosophile avec un métabolisme du glucose régulé à la hausse

Les troubles métaboliques sont parmi l'une des maladies les plus communes chez les humains. Le modèle organisme génétiquement traitable D. melanogaster peut être utilisé pour identifier de nouveaux gènes qui régulent le métabolisme. Ce document décrit une méthode relativement simple qui permet d'étudier le taux métabolique chez les mouches par la mesure de leur production de CO 2.

Mesure des taux métabolique dans<em&gt; Drosophila</em&gt; En utilisant Respirométrie

Cet article décrit une méthode de mesure de l’oxydation du carburant chez Drosophila melanogaster dans laquelle des traces de substrats métaboliques spécifiques radiomarqués sont administrées à des mouches. LeCO2 radiomarqué expiré qui est produit par l’oxydation du combustible est collecté et mesuré.

Mesure de dioxyde de carbone de production de radiomarqué Substrats en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Accumulation de preuves souscrit l’idée qu’agrégats de protéine pathogène est associée aux maladies neurodégénératives répartis entre les cellules ayant des propriétés prion. Nous décrivons ici une méthode qui permet la visualisation de cellule à cellule propagation des agrégats de type prion dans l’organisme modèle, Drosophila melanogaster.

Surveillance de cellule à cellule Transmission des agrégats de protéine Prion chez Drosophila Melanogaster

Ici, des méthodes non invasives sont décrites pour la localisation des protéines de la membrane photoréceptrice et l’évaluation de la dégénérescence rétinienne dans l’œil composé de la drosophile à l’aide de la fluorescence eGFP.

Étude du trafic de protéines membranaires dans les cellules photoréceptrices de la drosophile à l’aide de protéines marquées eGFP

L’épuisement extracellulaire du glucose marqué par fluorescence est en corrélation avec l’absorption du glucose et pourrait être utilisé pour le dépistage à haut débit de l’absorption du glucose dans les organes excisés et les cultures cellulaires.

L’épuisement extracellulaire du glucose comme mesure indirecte de l’absorption du glucose dans les cellules et les tissus Ex Vivo

Nous présentons ici un protocole pour visualiser le transport des monocarboxylates, du glucose et de l’ATP dans les cellules gliales et les neurones à l’aide de capteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de Förster génétiquement codés dans une préparation cérébrale ex-vivo de larves de drosophile .

Visualisation des monocarboxylates et d’autres métabolites pertinents dans le cerveau larvaire de la drosophile ex vivo à l’aide de capteurs génétiquement codés

Ce protocole présente un test de modélisation de la constipation dans un modèle de drosophile de la maladie de Parkinson à base d’alpha-synucléine.

Mesure de la constipation dans un modèle de la maladie de Parkinson chez la drosophile

Découvrez la mesure de l'absorption du glucose dans les neurones moteurs de Drosophila à l'aide d'un capteur FRET. Cette méthode permet d'évaluer les changements métaboliques en temps réel dans les modèles de protéopathie TDP-43.

Mesure de l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéopathie TDP-43

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