Biology
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通过粘附足迹测定法对细胞滚动中的分子粘附进行成像
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Summary September 27th, 2021
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该协议提供了执行粘附足迹测定的实验程序，以在快速细胞滚动粘合期间对粘附事件进行成像。
Transcript
该协议有助于建立分子力和细胞滚动行为之间的联系，除了允许在分子水平上空间映射和量化滚动粘附。该技术允许在实际细胞滚动期间研究单个粘附事件，使我们能够直接测量生理相关的分子粘附力。在每一步中使用适当的浓度和孵育时间进行表面处理对于实现高质量的表面功能化至关重要。
生物偶联的质量和适当的条件也至关重要。视觉演示对于帮助研究人员复制该协议至关重要。特别是，流室组装和后处理图像等步骤将从视觉演示中受益匪浅。
首先用剃须刀片在双面胶带的两侧薄铺少量环氧树脂。使用激光切割环氧树脂涂层胶带以形成四个通道。通过将环氧胶带夹在四孔滑块和PEG盖玻片之间来创建流动芯片。
使用移液器吸头，沿通道长度轻轻按压以形成良好的密封，然后将环氧树脂固化至少一小时。对齐芯片，使每个通道的开口位于适配器的中心。然后将两个透明的丙烯酸垫片放在芯片顶部。
在块的中间施加牢固的压力，并在每个垫片的末端拧紧。将入口拧入支架另一侧的螺纹孔中，并通过透明丙烯酸块监控密封状况。将200微升洗涤缓冲液流入腔室以检查泄漏。
如果在通道中形成气泡，请积极推动额外的200微升洗涤缓冲液以除去气泡。向流动室中加入40微升BSA以防止非特异性结合，并在湿度室中孵育10分钟。孵育后，在吐温20处向流动室中加入40微升，并再次孵育10分钟，以进一步减少非特异性结合。
然后用200微升洗涤缓冲液洗涤通道，以除去所有钝化剂。对于腔室表面功能化，将40微升链霉亲和素加入流动室并孵育20分钟，然后用200微升洗涤缓冲液洗涤腔室。现在，将40微升杂交蛋白G-TGT加入流动室并孵育20分钟。
用洗涤缓冲液洗涤后，加入40微升蛋白质G-TGT顶链并孵育20分钟，以完成表面上任何未混合的TGT底链，然后用洗涤缓冲液洗涤。最后，向流动室中加入40微升P-selectin-Fc并孵育60分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤。用滚动缓冲液填充五毫升玻璃注射器，然后敲击注射器的侧面以移开并将气泡推出，因为它们漂浮在尖端。
将无菌针头插入200毫米聚乙烯管中后，将针头连接到玻璃注射器上。将注射器固定在注射器泵上，并倾斜注射器泵，使柱塞侧升高以防止气泡进入通道。将管子的末端插入流室入口。
将另一块200毫米聚乙烯管的一端插入出口，并将另一端浸入废烧杯中。取一至两毫升细胞悬浮液样品并离心以沉淀细胞。除去培养基，轻轻地将细胞重悬于500微升的滚动缓冲液中。
小心地断开管道与入口和出口的连接，并将40微升的细胞悬浮液移入流动室。如前所述重新连接管道，确保气泡不会引入流道。通过以所需的流速启动注射器泵来开始细胞滚动实验。
使用具有10X物镜的暗场显微镜观察细胞滚动。实验完成后，通过以每小时100毫升的速度注入滚动缓冲液，直到表面无细胞，将细胞从通道中取出。为了通过DNA-PAINT对局部轨迹进行成像，将40微升在DNA-PAINT缓冲液中制备的DNA-PAINT成像器链加入通道中。
使用文本手稿中提到的条件进行全内反射荧光显微镜检查。本地化和渲染超分辨率图像。对于通过永久标记对长轨迹进行成像，加入永久成像器链并在T50M5缓冲液中孵育120秒。
然后通过注入200微升洗涤缓冲液来洗涤通道。在关闭激发激光器的情况下录制图像，以获得背景相机噪声。通过TIRF显微镜对网格图案中的大面积进行成像。
对显微镜进行编程，以扫描 400 x 50 张图像的区域，并使用 ImageJ 程序将原始数据拆分为单独的 TIP 文件，每个文件最多包含 10， 000 张图像。使用照明配置文件拼合所有图像，并使用 MIST 插件拼接图像。用于蛋白G ssDNA生物共轭表征的结果表明，蛋白G与ssDNA的比值接近一，其中蛋白G马来酰亚胺ssDNA和咪唑洗脱缓冲液光谱从正交基上适合生物共轭产物谱。
使用天然PAGE来确认生物偶联，显示与单体蛋白G条带一致的亮绿色条带表明成功偶联和良好的产量。从单模光纤引入的TIRF照明曲线通常在视野中间更亮，在边缘周围变暗。为了补偿不均匀的照明并展平图像以进行定量分析，通过平均数千个单独的帧来确定照明曲线。
通过从原始和照明配置文件中减去相机噪声，然后通过照明配置文件进行归一化来生成平坦的图像。原始拼接显示出与未校正图像相对应的清晰周期性图案，而从扁平图像拼接的相同视野产生平坦的背景。使用斜坡上升的流动曲线来确定剪切应力的范围，导致细胞滚动和产生荧光轨迹，在该轨迹下可以看到典型的单细胞粘附足迹。
显示了对比度不足的荧光轨迹的次优和最佳结果，轨迹密度过高，最佳轨迹密度和对比度，衍射受限和DNA-PAINT成像。超过60分钟的孵育时间可确保表面功能化，适当的腔室结构可防止损坏功能化表面的气泡通过。该程序适用于对卷入滚动粘附的分子力进行定量分析，并使研究人员能够了解不同细胞类型的滚动行为。
该技术使研究人员能够探索有关快速粘附事件的新问题，从而导致单分子和机械生物学研究的进一步发展。
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