Neuroscience
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Криосекционное рассечение субэпендимальной зоны взрослого человека для точного и глубокого количественного анализа протеома
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Крио-секция-рассечение-рассечение позволяет свежей, замороженной подготовке самой большой нейрогенной ниши в мышином мозге для глубокого количественного анализа протеома. Метод является точным, эффективным и вызывает минимальное возмущение тканей. Поэтому он идеально подходит для изучения молекулярного микроокружения этой ниши, а также других органов, регионов и видов.
Transcript
Наш метод рассечения позволяет точно выделить нейрогенную нишу желудочков и поэтому хорошо подходит для изучения молекулярной микросреды этой ниши. Основным преимуществом этого метода рассечения является то, что он точен, эффективен и вызывает минимальное возмущение тканей, но при этом совместим с масс-спектрометрией для анализа протеомов. В этом протоколе мы извлекаем нейрогенную нишу желудочка из мозга мыши, но этот метод также может быть применен к другим видам и в различных состояниях здоровья и болезни.
Техника может потребовать некоторой подготовки. особенно при скальпельных разрезах при обнажении и извлечении желудочковой нейрогенной ниши. После усыпления 8-10-недельной мыши C57 black/6 мужского пола, извлеките мозг путем ручного рассечения и поместите его в культуральную посуду, содержащую ледяную среду для рассечения.
Используя скальпель, удалите обонятельную луковицу, сделав прямой корональный разрез между обонятельной луковицей и внутренним полюсом коры. Затем удалите передний полюс коры, сделав корональный разрез, гарантируя, что боковые желудочки видны в корональной плоскости. Затем с помощью ножниц откройте оба боковых желудочка сверху, начиная с сагиттального сечения от кортикальной поверхности до просвета желудочков.
Удлините этот разрез С-образным способом после сгибания желудочков. Далее соедините каудальные концы левого и правого сагиттального разреза, используя дополнительный корональный разрез. Далее удаляют кору и мозолистое тело, покрывающие медиальные стенки желудочков.
Если ткань прикреплена к медиальным желудочковым стенкам, сделайте дополнительные разрезы или поднимите кору и мозолистое тело ножницами, чтобы выбить ткань. Затем, используя щипцы, удаляют кору и мозолистое тело, покрывающие боковые желудочки. С помощью щипцов аккуратно раздвиньте стенки желудочков и удалите сосудистое сплетение.
Затем положите мозг на стеклянную горку и поместите горку поверх сухого льда, чтобы заморозить мозг стенками желудочков в открытой конфигурации. Перед разделением убедитесь, что мозг прикреплен к пластине прикрепления криостата в заднем мозге с помощью встраивающей среды для замороженных тканей. Кроме того, убедитесь, что никакая среда встраивания не вступает в контакт с передним мозгом, особенно в желудочках.
Затем отрежьте корональные участки мозга толщиной от 50 до 100 микрометров до конца бокового желудочка и установите участки на стеклянные слайды. Поместите стеклянные слайды на сухой лед под рассеченный микроскоп. Поднимите ломтики из сухого льда на 15-30 секунд, чтобы добиться кратковременного, неполного оттаивания, сделав компактный миелин полосатого тела наблюдаемым в виде плотных белых точек.
Затем, используя предварительно охлажденный скальпель, отделяют субэпендимальную зону от соседнего полосатого тела и переносят его целым куском или разрезанным на две-четыре части в микроцентрифужную трубку с помощью тупого края охлажденного скальпеля. Затем проделайте то же самое для медиальной желудочковой зоны. Миелин-ассоциированные, гликопротеин-положительные внутренние капсулы полосатого тела были идентифицированы во всех образцах, но редко в крио-секционно-диссекционных образцах с помощью иммуногистохимии.
Стриатальное загрязнение в образцах wholemount было подтверждено обогащением миелиновых белков в субэпендимальной зоне по сравнению с образцами сомато-сенсорной коры. Напротив, сравнение этих белков-маркеров миелина в образцах крио-секции-диссекции не показало существенных различий в субэпендимальной зоне и образцах сомато-сенсорной коры. При сравнении результатов масс-спектрометрии между криосекцией-рассечением и микродиссекцией лазерного захвата микродиссекция лазерного захвата дала примерно вдвое меньше количественных белков, хотя время сбора тканей было примерно в два раза больше.
Принципиальный компонентный анализ показывает, что существует большая вариабельность среди образцов, собранных с помощью микродиссекции лазерного захвата, изображенных в виде квадратов, чем среди образцов, собранных с помощью криосекции-рассечения, изображенных в виде кругов. Тест на обогащение 2D-аннотации между криосекцией-рассечением и микродиссекцией лазерного захвата для субэпендимальных и медиальных эпендимальных зон выявил аналогичное обогащение как в методах, так и в областях для белков, связанных с внеклеточным пространством. Криосекция-диссекция обеспечивает более надежную идентификацию и количественную оценку нейрогенеза в субэпендимальных зонально-ассоциированных белках внеклеточного матрикса.
В случае тенасцина-С только криосекция-диссекция отображала обогащение в субэпендимальной зоне по сравнению с медиальной эпендимальной зоной. Следите за тем, чтобы участки мозга на слайдах не стали полностью размороженными. В целом, хорошо практиковать этапы процедуры рассечения для получения последовательного результата.
Метод рассечения также может быть использован с другими методами анализа белка, которые могут легко обнаружить очень низкие обильные белки, такие как факторы роста и цитокины. Этот метод микродиссекции позволил нам идентифицировать новый регулятор нейрогенеза, и мы считаем, что он позволит другим идентифицировать другие регуляторы нейрогенеза в различных контекстах.
Tags
Неврология Выпуск 176Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
