Genetics
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Schnelle Isolierung wilder Nematoden durch Baermann Funnel
Chapters
Summary January 31st, 2022
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Dieses Protokoll skizziert eine Methode zur effizienten Extraktion lebender Nematoden aus natürlichen Substraten im Feld.
Transcript
Caenorhabditis nematoden sind echte Tiere, die in der Natur leben. Das Sammeln wilder Nematoden ermöglicht es uns, Gene und Genome in ihrem natürlichen Kontext zu untersuchen und Funktionen aufzudecken, die durch die künstlichen Bedingungen des Labors verdeckt werden können. Diese Technik extrahiert Würmer aus bakterienreichen organischen Substraten im Feld und erzeugt saubere Kulturen auf Petrischalen, wobei eine Momentaufnahme jeder Population zum Zeitpunkt der Sammlung erfasst wird.
Diese Populationen eignen sich gut für Fragen der Ökologie, Populationsgenetik oder Metagenetik. Wilde Stammkulturen sind auch wertvoll für quantitative genetische Studien. Diese Technik ist einfach und leicht auszuführen, auch für einen Feldforschungsanfänger.
Eine erfolgreiche Sammelreise erfordert jedoch eine sorgfältige Vorbereitung der Materialien vor der Reise. Identifizieren Sie ein bakterienreiches Substrat auf dem Feld, wie verrottende Früchte, Blumen, Pilze, Stängel krautiger Pflanzen, Erde oder Laubstreu. Legen Sie ein kleines Volumen des Substrats in eine beschriftete Plastiktüte.
Wenn verrottendes Material auf der Feldseite von Interesse selten ist, legen Sie etwas Obst als Köder. Lassen Sie es felsen, holen Sie es dann und alle Würmer, die es besiedelt haben. Notieren Sie die Proben-ID, den Breitengrad, den Längengrad, das Datum und die Beschreibung des Substrats.
Zeichnen Sie alle anderen lokalen Umweltmessungen auf, die für das Experiment relevant sind, z. B. Umgebungs- und Substrattemperatur, Substratzustand, Zeitpunkt der Sammlung und Vorhandensein von substratassoziierten Makroinvertebraten. Verwenden Sie eine Schere, um ein drei Zentimeter langes Segment aus Gummischläuchen aus jedem Trichter zu schneiden. Passen Sie den Schlauch über das Ende eines Kunststofftrichters an.
Schieben Sie eine Schlauchschelle über den Gummischlauch und klemmen Sie ihn zu. Um einen Trichterhalter zu machen, schneiden Sie kreisförmige Löcher in der Mitte eines entfalteten Pappfliegen-Vile-Tabletts. Drehen Sie den Karton um, falten Sie die Seiten einmal nach oben und kleben Sie sie zusammen.
Dadurch entstehen Beine, die die Löcher über die Bank heben. Stellen Sie sicher, dass sich die Schlauchklemmen in der geschlossenen Position befinden, und platzieren Sie Trichter in den Löchern. Gießen Sie steriles Wasser in jeden Trichter und füllen Sie es etwa drei Zentimeter unter dem Rand.
Tippen Sie auf den Trichter, um eingeschlossene Luftblasen im Schlauch freizugeben. Falten Sie ein fusselfreies Wischen in zwei Hälften, um ein Quadrat zu bilden, und legen Sie es über den Trichter. Drücken Sie dann das Tuch nach unten, um es ins Wasser zu tauchen.
Brechen Sie manuell alle großen festen Stücke des natürlichen Substrats auf. Legen Sie vorsichtig einen Teil der Probe auf das Tuch im Trichter. Achten Sie darauf, das Tuch nicht zu durchstechen oder eine Probe über den Rand hinausragen zu lassen.
Falten Sie die Ecken des Tuchs vorsichtig über die Probe, um zu verhindern, dass Wasser über den Rand des Trichters ableitet. Beschriften Sie den Trichter mit der Beispiel-ID, die den Feldsammlungsnotizen entspricht. Wählen Sie alle aktiven Insekten oder andere Tiere aus, die reisen und Proben kreuzkontaminieren können.
Fügen Sie jedem Trichter mehr Wasser hinzu, um die gesamte Probe einzutauchen. Während der Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht wackeln aktive Nematoden durch das Gewebe und sinken auf den Boden des Trichters. Schreiben Sie die Proben-ID eines Trichters auf den Boden einer sechs Zentimeter langen NGM-Wurmplatte, die mit einem Fleck von OP50 E. coli-Bakterien sitzt.
Entfernen Sie den Deckel von der Platte, entfernen Sie den Trichter, der die Probe aus dem Trichterständer enthält, und halten Sie ihn mit einer Hand aufrecht über der offenen Wurmplatte. Lösen Sie mit der anderen Hand den Druck auf die Schlauchschelle und lassen Sie ein oder zwei Tropfen Wasser vom Schlauch auf die Schneckenplatte neben dem Bakterienrasen fallen. Sobald das Wasser aus dem Trichter fällt, klemmen Sie es schnell wieder zu, um ein Überfluten der NGM-Platte zu verhindern.
Um aufzuräumen, werfen Sie den Inhalt der Trichter weg und waschen Sie sie mit heißem Wasser zur späteren Wiederverwendung. Beobachten Sie die isolierten Nematoden unter dem Stereomikroskop. Neben Nematoden gibt es gelegentlich kleine Oligo-Kit-Anneliden, Bärtierchen, Rädertierchen und kleine Krebstiere.
Um ISO-Hermaphrodit oder ISO-Weibchenlinien zu erstellen, übertragen Sie jeden L4-Hermaphroditen oder jedes gepaarte erwachsene Weibchen auf eine separate 3,5-Zentimeter-NGM-Platte, die mit OP50 sitzt. Sterilisieren Sie den Wurmpickel vor und nach jedem Transfer. Zum Schluss wickeln Sie die Teller gründlich für die Reise mit einem Paraffinfilm ein.
Auf der Insel Barro Colorado Panama wurden 2018 131 Substrate mit dieser Methode verarbeitet. 99% davon ergaben Nematoden. 34% ergaben Caenorhabditis nematoden.
In der Tschernobyl-Sperrzone Ukraine wurden 2019 170 Substrate nach dieser Methode verarbeitet. 56% davon ergaben Nematoden, von denen keiner Caenorhabditis war. Diese Methode funktioniert, weil die Nematoden durch das Tuch schwimmen.
aber das Substrat und andere Tiere bleiben oben. Viele Aspekte eines Protokolls können geändert werden, um die im Feld verfügbaren Ressourcen zu nutzen. Proben, die mit dieser Methode gesammelt wurden, ermöglichen es den Forschern, eine breite Palette von populationsbiologischen Fragen in etablierten Kulturen für nachfolgende Laborstudien zu behandeln.
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