Genetics
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Aislamiento rápido de nematodos silvestres por Baermann Funnel
Chapters
Summary January 31st, 2022
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Este protocolo describe un método para extraer eficientemente nematodos vivos de sustratos naturales en el campo.
Transcript
Los nematodos Caenorhabditis son animales reales, que viven en la naturaleza. La recolección de nematodos silvestres, nos permite estudiar genes, y genomas en su contexto natural revelando funciones, que pueden ser oscurecidas por las condiciones artificiales del laboratorio. Esta técnica, extrae gusanos, de sustratos orgánicos ricos en bacterias en el campo, y crea cultivos limpios en placas de Petri, capturando una instantánea de cada población, en el momento en que se recolectó.
Estas poblaciones son muy adecuadas para la ecología, la genética de poblaciones o las cuestiones de metagenética. Los cultivos de cepas silvestres también son valiosos para estudios genéticos cuantitativos. Esta técnica es simple y fácil de ejecutar, incluso para un novato en investigación de campo.
Sin embargo, un viaje de recolección exitoso requiere una preparación cuidadosa de los materiales, antes de viajar. Identifique un sustrato rico en bacterias en el campo, como frutas podridas, flores, hongos, tallos de plantas herbáceas, suelo o hojarasca. Coloque un pequeño volumen del sustrato en una bolsa de plástico etiquetada.
Si el material podrido es raro en el lado del campo de interés, coloque un poco de fruta como cebo. Déjelo rockear, luego recupérelo y cualquier gusano que lo haya colonizado. Registre el ID de la muestra, la latitud, la longitud, la fecha y la descripción del sustrato.
Registre cualquier otra medición ambiental local, relevante para el experimento, como la temperatura ambiente y del sustrato, la condición del sustrato, el tiempo de recolección y la presencia de macro invertebrados asociados al sustrato. Use tijeras para cortar un segmento de tres centímetros, de tubos de goma de cada embudo. Coloque el tubo sobre el extremo de un embudo de plástico.
Deslice una abrazadera de tubo sobre el tubo de goma y colóquelo. Para hacer un soporte de embudo, corte agujeros circulares, en el centro de una bandeja de cartón desplegada para moscas viles. Invierta el cartón, doble los lados una vez y péguelos con cinta adhesiva.
Esto creará piernas, que elevan los agujeros por encima del banco. Asegúrese de que las abrazaderas de los tubos estén en la posición cerrada y coloque embudos en los orificios. Vierta agua estéril en cada embudo, llenándolo unos tres centímetros por debajo del borde.
Toque el embudo para liberar cualquier burbuja de aire atrapada en el tubo. Dobla una toallita sin pelusa por la mitad, para hacer un cuadrado, y colócala sobre el embudo. Luego, presione la toallita hacia abajo, para sumergirla en el agua.
Rompa manualmente cualquier pieza sólida grande, del sustrato natural. Coloque suavemente parte de la muestra en la toallita en el embudo. Asegúrese de no perforar la toallita ni dejar ninguna muestra que sobresalga por encima del borde.
Doble con cuidado las esquinas de la toallita, sobre la muestra, para evitar que el agua se absorba, sobre el borde del embudo. Etiquete el embudo con el ID de ejemplo, correspondiente a las notas de colección de campos. Elija cualquier insecto activo, u otros animales, que puedan viajar y contaminar muestras cruzadas.
Agregue más agua a cada embudo, para sumergir toda la muestra. Mientras se incuban a temperatura ambiente durante la noche, los nematodos activos se moverán a través del tejido y se hundirán hasta el fondo del embudo. Escriba la identificación de muestra de un embudo, en la parte inferior de una placa de gusano NGM de seis centímetros, asentada con una mancha de bacteria OP50 E.coli.
Retire la tapa de la placa, retire el embudo, que contiene la muestra del soporte del embudo, y manténgala en posición vertical, por encima de la placa de gusano abierta, con una mano. Libere la presión sobre la abrazadera del tubo con la otra mano y permita que una o dos gotas de agua caigan del tubo sobre la placa de gusano junto al césped bacteriano. Tan pronto como el agua caiga del embudo, vuelva a cerrarla rápidamente para evitar que se inunde la placa NGM.
Para limpiar, deseche el contenido de los embudos y lávelos con agua caliente, para su posterior reutilización. Observe los nematodos aislados bajo el microscopio estereoscópico. Además de los nematodos, ocasionalmente habrá pequeños anélidos Oligo kit, Tardígrados, rotíferos y pequeños crustáceos.
Para establecer líneas hermafroditas ISO, o iso femeninas, transfiera cada hermafrodita L4 o hembra adulta acoplada, a una placa NGM separada de 3,5 centímetros, asentada con OP50. Esterilizar el pico del gusano, antes y después de cada transferencia. Finalmente, envuelva las placas a fondo para viajar, con una película de parafina.
En la isla de Barro Colorado Panamá, en 2018, se procesaron 131 sustratos por este método. El 99% de los cuales produjeron nematodos. El 34% produjo nematodos Caenorhabditis.
En la Zona de Exclusión de Chernobyl Ucrania, en 2019, se procesaron 170 sustratos por este método. El 56% de los cuales produjeron nematodos, ninguno de los cuales era Caenorhabditis. Este método funciona porque los nematodos nadan a través de la toallita.
pero el sustrato y otros animales se mantienen en la cima. Muchos aspectos de un protocolo pueden ser modificados, para hacer uso de cualquier recurso disponible en el campo. Las muestras recolectadas utilizando este método, permiten a los investigadores abordar una amplia gama de preguntas de biología de poblaciones en cultivos establecidos para estudios de laboratorio posteriores.
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