Name: Microscopía intravital longitudinal con una ventana de imágenes mamarias con tapa reemplazable (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprende microscopía intravital longitudinal con una ventana mamaria de tapa reemplazable para estudiar la dinámica celular en glándulas sanas y tumorales. Este método permite el seguimiento del desarrollo mamario y la progresión tumoral a nivel de célula única durante varias semanas.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación Flandes (beca de doctorado de investigación fundamental 11L7222N a M.C.), la Fundación Boehringer Ingelheim (Beca de doctorado a C.L.G.J.S), una beca postdoctoral EMBO (beca ALTF 1035-2020 a C.L.G.J.S.) y el Premio Doctor Josef Steiner (a J.v.R).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

El R.MIW permite la obtención de imágenes longitudinales de la glándula mamaria sana y enferma en su entorno nativo y mínimamente interrumpido y permite la visualización repetida de la glándula mamaria en diversas etapas de desarrollo. El diseño R.MIW permite que la ventana se abra en cualquier momento durante el experimento. El acceso visual a largo plazo al tejido de interés puede verse obstaculizado, por ejemplo, por la acumulación de restos celulares en la cubierta. En tales casos, el R.MIW se puede abrir antes o inmediatamente después de una sesión de imágenes para permitir la limpieza de toda el área de tejido visible y la tapa. La tapa extraíble también permite manipulaciones del tejido, así como la aplicación local de sustancias, como inhibidores y terapias específicas, colorantes de etiquetado o tipos celulares específicos de interés.
Este método supera la limitación de los procedimientos de flap cutáneo mamario descritos anteriormente 4,7,8,13, que se limitan a una sesión de imágenes, y pueden visualizar procesos como la morfogénesis ramificada (Figura 5), el recambio de tejido homeostático (Figura 6) o el crecimiento tumoral a nivel celular (Figura 3B ). Sin embargo, al mismo tiempo, el R.MIW permite la manipulación local del tejido entre sesiones de imágenes, lo que constituye un gran activo del R.MIW en comparación con el MIW 3,18 publicado anteriormente y todas las demás ventanasde imágenes 20,22. Al abrir el R.MIW, es importante mantener las condiciones asépticas en todo momento para prevenir cualquier fuente de infección. La capacidad de abrir el R.MIW en un entorno aséptico permite optimizar las condiciones de imagen antes de cada sesión de imagen, lo que mejora en gran medida el acceso visual a largo plazo al tejido de interés. Específicamente, en la glándula mamaria, que está incrustada en un estroma rico en adipocitos, esto es de gran valor. Además, la tapa reemplazable podría permitir de manera única la administración local de terapias, diferentes tipos de células, colorantes de etiquetado, microdisección guiada por imágenes o cualquier otra manipulación local del tejido sin la necesidad de terminar el experimento de IVM. Por ejemplo, para estudiar la iniciación del tumor, se podrían inyectar poblaciones específicas de células cancerosas directamente en el árbol ductal o el estroma en un punto de tiempo IVM determinado y una ubicación precisa de la glándula mamaria, siempre que este ROI sea accesible a través del anillo R.MIW. Para estudiar la progresión tumoral, poblaciones específicas de células cancerosas (en un lugar específico, en un microambiente específico o con un comportamiento específico) podrían ser fotomarcadas durante la sesión de IVM y posteriormente microdiseccionadas utilizando un microscopio de disección fluorescente después de la apertura del R.MIW. Las células aisladas podrían procesarse aún más para análisis posteriores, como la secuenciación del ARNm (de una sola célula). Mediante el uso de este enfoque, se podría acoplar el comportamiento celular in vivo a los perfiles de expresión molecular. La ventaja de la administración local de medicamentos habilitada por el R.MIW permite que el tejido sea fotografiado antes y directamente después del tratamiento. El intervalo necesario para sacar al ratón de la caja de imágenes y posteriormente realizar la administración local del fármaco después de abrir la tapa R.MIW se puede realizar en minutos, lo que permite la captura de fase inmediata de fármacos de acción rápida.
Demostramos que la IVM de la glándula mamaria a través del R.MIW es compatible con muchos modelos diferentes de ratones reporteros fluorescentes. El entorno rico en adiposos es difícil de visualizar y, por lo tanto, se recomienda el uso de fluoróforos brillantes. Sin embargo, como se muestra aquí, incluso los fluoróforos menos brillantes, como mCFP, se pueden visualizar a través del R.MIW en condiciones óptimas de imagen. Inevitablemente, la almohadilla de grasa impedirá la obtención de imágenes de las estructuras ductales más profundas y limitará la imagen a los conductos más superficiales. Una imagen general de baja resolución al comienzo de cada experimento de IVM ayudará a identificar las estructuras ductales de interés que son lo suficientemente superficiales para las imágenes de alta resolución. La manipulación local del tejido, la extracción del tejido conectivo o el reposicionamiento del tejido adiposo después de abrir el R.MIW pueden optimizar la IVM para ROI específicos que están superpuestos por el tejido adiposo. Esta es una ventaja importante sobre todos los diseños de ventanas anteriores, que no permiten realizar estas manipulaciones y requerirían la eliminación completa de la ventana en sí. Específicamente, para la visualización del ganglio linfático inguinal, se recomienda eliminar suavemente el tejido graso suprayacente, lo que reduce la dispersión de la luz y permite imágenes de alta resolución. Al manipular el tejido, mantenga siempre condiciones asépticas y evite el sangrado o el daño grave al tejido, ya que pueden afectar los procesos que se están estudiando durante el experimento de IVM.
El R.MIW está hecho de titanio, un material que se usa comúnmente en la práctica clínica para reemplazar tejidos duros como articulaciones o placas óseas. El titanio tiene varias ventajas sobre las ventanas de acero, incluyendo su carácter ligero einerte 21. Recientemente, se utilizaron varios otros materiales para generar nuevos tipos de ventanas de imágenes, incluida la ventana de silicio flexible20. A diferencia del R.MIW, la ventana flexible no requiere suturas para la implantación y es adecuada para casi cualquier posición anatómica, específicamente en el caso de tejidos blandos y frágiles. Las ventanas de silicio tienen un impacto mínimo en la motilidad animal debido a su naturaleza ligera y deformable y tal vez más adecuadas en experimentos que estudian la rápida expansión y crecimiento de tejidos20. Otra ventaja sobre la versión de titanio es que las ventanas de silicio son compatibles con otras modalidades de imagen, incluida la resonancia magnética20,27. Sin embargo, será importante tener en cuenta que los objetivos están optimizados para cubiertas de vidrio de 0,17 mm. Además, el tejido mamario es susceptible a los movimientos respiratorios, que son difíciles de restringir usando la ventana flexible, especialmente cuando se usa un microscopio invertido. Los artefactos respiratorios se minimizan mediante el diseño R.MIW y la fijación del R.MIW en la incrustación de la caja de imágenes. Como resultado, las imágenes adquiridas utilizando la configuración R.MIW propuesta no se distorsionan debido a los artefactos respiratorios. Sin embargo, pueden ocurrir derivas menores en la localización del tejido, que generalmente son graduales y pueden corregirse mediante el uso de un software de corrección de movimiento posterior a la adquisición28. Con la creciente caja de herramientas de las tecnologías IVM 2,20, los requisitos específicos para cada experimento eventualmente determinarán la mejor manera de visualización in vivo del tejido de interés. Los diferentes diseños de ventanas tienen diferentes ventajas y desventajas y, dependiendo de la pregunta de investigación, la configuración de microscopía disponible, la resolución espacial y temporal requerida y el lapso de tiempo total del proceso estudiado, se debe determinar el enfoque óptimo.
En resumen, el R.MIW facilita la caracterización de alta resolución de la dinámica celular durante el desarrollo de la glándula mamaria, la homeostasis y la enfermedad durante varios días o semanas.

El epitelio mamario es un órgano secretor único presente en los mamíferos, que produce y secreta leche para nutrir a la descendencia. A lo largo de la vida, la glándula mamaria experimenta múltiples rondas de desarrollo y crecimiento, que se acompañan de cambios estructurales y funcionales del tejido1. Dependiendo de la etapa de desarrollo, los tipos de células que contribuyen a la remodelación del tejido son diferentes, así como la ubicación dentro del árbol ductal.
La microscopía intravital multifotónica (MIV) permite el estudio de la dinámica de las células mamarias in vivo en el entorno nativo y mínimamente perturbado 2,3,4. Para obtener acceso visual a la glándula mamaria, se han publicado varias técnicas temporales de imagen de colgajo ex vivo o de colgajo cutáneo durante diferentes etapas del desarrollo de la glándula mamaria, incluyendo la pubertad 4,5,6,7, la edad adulta 2,8, la lactancia 9,10,11,12 y la dinámica tumoral 13,14 ,15. Aunque estas técnicas dan como resultado imágenes de alta resolución espacial y temporal de la dinámica de las células mamarias, el marco de tiempo se limita a horas, mientras que la mayoría de los procesos de remodelación de la glándula mamaria toman días o semanas. Por lo tanto, se requieren métodos que permitan el acceso óptico al tejido de interés durante períodos de tiempo prolongados. A lo largo de los años, se han desarrollado varias ventanas de imágenes permanentes para imágenes de tumores mamarios 15,16,17,18, incluida una ventana de imágenes mamarias de titanio (MIW)2,3,19. Aunque es muy útil para estudiar el crecimiento del tumor mamario, la visualización de la estructura sana de la glándula mamaria se mantuvo limitada a unos pocos días. Recientemente, se desarrolló una ventana de imágenes de silicio flexible, que permite la visualización de la glándula mamaria puberal durante varias semanas20. Sin embargo, la glándula mamaria está incrustada en una almohadilla de grasa rica en adipocitos, lo que conduce a una extensa dispersión de la luz y, como resultado, una visibilidad limitada de las estructuras ductales mamarias. Por lo tanto, se requieren condiciones de imagen superiores en todo momento para visualizar la dinámica del tejido durante períodos prolongados de tiempo en la glándula mamaria. Ni el MIW clásico ni la ventana de silicio flexible permiten la manipulación del tejido o la optimización de la ubicación física del tejido antes de la obtención de imágenes, ya que la ventana forma un sistema cerrado después de la cirugía y la implantación. Como resultado, es probable que el acceso óptico óptimo al tejido mamario subyacente se vea impedido durante períodos de tiempo más largos. Por el contrario, la técnica del colgajo cutáneo permite la optimización y el reposicionamiento del tejido durante la sesión de imágenes y un colgajo cutáneo se puede repetir varias veces2. Sin embargo, las sesiones repetidas de imágenes a través de un colgajo de piel solo son posibles cuando se asigna suficiente tiempo (al menos 7 días) entre cirugías para permitir la recuperación de la piel y, por lo tanto, es principalmente adecuado para estudiar procesos en escalas de tiempo más largas. Además, es aconsejable no realizar este procedimiento muchas veces debido a su naturaleza invasiva y gran riesgo de infecciones y cicatrices al cierre de la herida.
Para superar estas limitaciones, es decir, para garantizar condiciones óptimas de imagen durante un período prolongado de tiempo a una alta frecuencia y al mismo tiempo permitir la manipulación de tejidos, se diseñó una versión mejorada de titanio del MIW con una tapa reemplazable (R.MIW) para visualizar la glándula mamaria sana y enferma durante varios días a semanas2 (Figura 1A, B). El R.MIW fue diseñado a medida para proporcionar un acceso óptimo al tejido, lo que permite la manipulación directa del tejido durante toda la duración del experimento IVM y, por lo tanto, permite la visualización de la glándula mamaria en el momento y lugar adecuados durante períodos prolongados de tiempo. Cuando está cerrado, el R.MIW forma un sistema hermético comparable al MIW clásico (Figura 1C). Cuando se abre en condiciones asépticas, el R.MIW permite la manipulación local de tejidos para mejorar el acceso óptico y también permite la administración local de sustancias, como inhibidores de la vía o agonistas, la inyección de diferentes tipos de células de interés, como células cancerosas o poblaciones de células inmunes, o la adición de colorantes de marcado de tejidos. La tapa se puede abrir en cualquier momento entre las sesiones de imágenes sin causar daño al tejido subyacente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig01.jpg"> Figura 1: Diseño de la ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable. (A) Vista superior y vista lateral de la tapa reemplazable de la ventana de imágenes mamarias con una cubierta de vidrio de 10 mm pegada al anillo. (B) Vista superior y vista lateral de la ventana de imágenes mamarias, que consiste en un anillo exterior y un anillo interior con una ranura en el medio para asegurar la ventana dentro de la piel del ratón utilizando una sutura de cuerda de bolso. El anillo exterior tiene una pequeña ranura que se ajusta a las cuatro proyecciones (brazos) de la tapa. (C) Dibujos animados e imágenes que demuestren los mecanismos de apertura y cierre de la tapa. Las proyecciones inclinadas aseguran que la tapa esté fija dentro del marco de la ventana. Esta figura ha sido modificada de Messal et al. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Este protocolo describe el procedimiento de diseño e implantación del R.MIW, así como una estrategia longitudinal de IVM para revisitar los mismos conductos mamarios y su visualización a resolución celular. El R.MIW permite seguir las divisiones celulares y los cambios morfológicos durante diferentes fases de desarrollo de la glándula mamaria en diversos modelos de ratón reportero fluorescente. En conjunto, el R.MIW facilita la caracterización de alta resolución de la dinámica celular durante el desarrollo de la glándula mamaria, la homeostasis y la enfermedad.

<table><tbody><tr><td>0.9% NaCl</td><td>BD 306573</td><td></td><td>Otras marcas disponibles</td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondos de 10 mm</td><td>Fisher scientific</td><td>10696365</td><td>Otras marcas disponibles</td></tr><tr><td>5-0 suturas de seda trenzada</td><td>Ethicon</td><td>W580</td><td></td></tr><tr><td>80% Etanol</td><td>casero</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Caja de inducción de anestesia</td><td>Kentscientific</td><td>VetFlo-MSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Vetergesic&reg;)</td><td>Ecuphar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de algodón (estériles)</td><td>Fisher scientific</td><td>13113743</td><td>Otras marcas disponibles</td></tr><tr><td>Adhesivo de cianoacrilato</td><td>Loctite</td><td>NA</td><td>Otras marcas disponibles</td></tr><tr><td>Pomada para los ojos</td><td>Duratears</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de mariposa flexible</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450120</td><td>Otras marcas disponibles</td></tr><tr><td>Pinzas Graefe (romas)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Kentscientific</td><td>RightTemp Jr.</td><td>Otras marcas disponibles</td></tr><tr><td>Caja de imagen</td><td>Hecho a medida</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de nutrientes Fusion</td><td>Braun</td><td>Nutriflex especial 70/240</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de insulina</td><td>BD</td><td>324911</td><td>Otras marcas disponibles</td></tr><tr><td>Microscopio multifotónico invertido con platina automatizada</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador de isoflurano</td><td>Kentscientific</td><td>VetFlo-1231K</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>Fine Science Tools</td><td>12510-14</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td> cinta <td>semitransparente</td></tr><tr><td>Cinta de papel tesa</td><td>Tesa</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Vaselina Vaselina</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>Fisher scientific</td><td>11904325</td><td>Otras marcas disponibles</td></tr><tr><td>Soluciones de tubos de silicona</td><td> Elastómeros</td><td>NA</td><td>Cualquier menaje para el hogar</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte (pequeñas)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Estéril PBS</td> Jeringa de <td>10010023</td><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td>(10 ml)</td><td>BD</td><td>305482</td><td>Otras marcas disponibles</td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11413-11</td><td></td></tr><tr><td>Tapa de titanio para ventana</td> <td>de imagen mamariaVentana</td><td></td> de imagen mamaria de titanio NA <td></td></tr><tr><td>hecha</td><td>a medida NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palos de madera palillos de dientes</td><td>Fisher scientific</td><td>NC1678836</td><td>Otras marcas disponibles</td></tr></tbody></table>

microscopía intravital longitudinal con una ventana de imágenes mamarias con tapa reemplazable

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

La estructura ramificada de la glándula mamaria es altamente dinámica y sufre varias fases de crecimiento y remodelación después del nacimiento. La microscopía intravital en combinación con cirugía de colgajo cutáneo o implantación de ventanas de imagen se ha utilizado para estudiar la dinámica de la glándula mamaria sana en diferentes etapas del desarrollo. La mayoría de las tecnologías de imágenes mamarias se limitan a un marco de tiempo de horas a días, mientras que la mayoría de los procesos de remodelación de la glándula mamaria ocurren en marcos de tiempo de días a semanas. Para estudiar la remodelación de la glándula mamaria, se requieren métodos que permitan el acceso óptico al tejido de interés durante períodos de tiempo prolongados. Aquí, se describe una versión mejorada de la ventana de imágenes mamarias de titanio con una tapa reemplazable (R.MIW) que permite imágenes de alta resolución de la glándula mamaria con una resolución celular de hasta varias semanas. Es importante destacar que el R.MIW proporciona acceso al tejido durante toda la duración del experimento de imágenes intravitales y, por lo tanto, podría usarse para la manipulación local de tejidos, el etiquetado, la administración de medicamentos o la microdisección guiada por imágenes. En conjunto, el R.MIW permite la caracterización de alta resolución de la dinámica celular durante el desarrollo de la glándula mamaria, la homeostasis y la enfermedad.

Para estudiar la dinámica proliferativa de las células epiteliales mamarias durante las diferentes etapas de desarrollo de la glándula mamaria se realizó el protocolo descrito. El diseño del R.MIW se representa en la Figura 1, y el procedimiento para implantar un R.MIW se resume en la Figura 2. El R.MIW se implanta quirúrgicamente entre la glándula mamaria y la piel. Se utiliza una sutura para sostener dentro del anillo de la ventana y evitar que los ratones tiren de las suturas (Figura 2). Las suturas que sujetan el R.MIW están hechas de seda no absorbible, que tiene propiedades hipoalergénicas, una textura suave y es fácil de manejar. El anillo R.MIW está hecho de titanio, uno de los materiales más biocompatibles que no promueven la inflamación o necrosis después de la implantación21. Si se siguen las condiciones asépticas y las suturas están bien ejecutadas, la implantación de la glándula mamaria R.MIW presenta un bajo riesgo de complicaciones postoperatorias. Además, a diferencia de la implantación de ventana de imagen abdominal22, la implantación de R.MIW no es un factor limitante para la supervivencia del ratón porque la glándula mamaria no es un órgano vital y permite la obtención de imágenes diarias hasta el límite especificado en el protocolo ético. El único factor que limita la duración de la implantación de la ventana es la renovación homeostática de la piel, lo que eventualmente conducirá a que las suturas se caigan después de 4 a 6 semanas. Por lo tanto, es importante inspeccionar regularmente la estabilidad de las suturas. Si se desea, las suturas se pueden quitar y reemplazar por una nueva sutura de cuerda de bolso en condiciones asépticas (como se describe en los pasos 3.5 a 3.8) para garantizar la estabilidad de la ventana.
Un desafío importante cuando se utiliza el enfoque de imágenes de varios días es volver sobre un ROI en días consecutivos. Con este fin, se puede incluir un análisis general rápido antes de seleccionar el ROI (s) (Figura 3B). Se pueden usar múltiples puntos de referencia tisulares para volver sobre la misma región del tejido, incluida la señal de la red de colágeno (visualizada por la segunda generación armónica), la estructura del tejido, así como los patrones locales de células marcadas de manera diferencial o estocástica con colorantes o proteínas fluorescentes (Figura 3B). En este ejemplo representativo, se implantó un R.MIW en la 4ª glándula mamaria de un MMTV-PyMT; R26-CreERT2het; R26-Confettihet ratón hembra al inicio de la formación palpable del tumor. Posteriormente, la recombinación estocástica fue inducida por inyección de 1,5 mg de tamoxifeno, lo que resultó en la recombinación de la construcción de confeti en algunas células (Figura 3C). Las células tumorales recombinadas fueron seguidas durante un período de 20 días (Figura 3B,C). Si se impide la obtención de imágenes de la misma región de la glándula mamaria durante días consecutivos, la ventana se puede abrir en un entorno aséptico (como se describe en el paso 5.1) para aclarar aún más y reposicionar el tejido para mejorar la visibilidad y la adquisición de imágenes (Figura 3A).
Usando este método, la glándula mamaria en desarrollo durante la pubertad fue seguida a nivel de una sola célula. Se realizó IVM repetido a través de un R.MIW utilizando R26-CreERT2het; R26-mTmGhet ratones hembra entre 4-6 semanas de edad, en los que todas las células están marcadas con tdTomato de membrana (Figura 4A)23. A los ratones se les inyectó una dosis baja de tamoxifeno (0,2 mg / 25 g de peso corporal), lo que resultó en una recombinación esporádica de la construcción mTmG, causando un cambio de rojo a verde en algunas células de todos los tejidos, incluida la glándula mamaria (Figura 4B). Los mismos ROI se revisaron durante varios días para visualizar los cambios morfológicos dentro de la glándula mamaria, incluida la elongación ductal y la ramificación ductal (Figura 4C) a una resolución celular. Es importante destacar que esta combinación de marcado de células estocásticas y IVM de varios días también permite visualizar los cambios dinámicos del entorno ductal, como la dinámica de células individuales en el estroma que rodea los conductos alargadores y ramificados (Figura 4D), así como la dinámica celular dentro del ganglio linfático inguinal (Figura 4E).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig04.jpg"> Figura 4: IVM multidía de morfogénesis ramificada puberal. (A) Pubertal R26-CreERT2; A los ratones R26-mTmG de edad entre 4 y 6 semanas se les inyectó una dosis baja de tamoxifeno que condujo a la recombinación mediada por Cre del alelo R26-mTmG y se les tomó una imagen en los días 1, 3 y 5 para seguir los cambios dinámicos en el desarrollo de la glándula mamaria. (B) Representación esquemática del constructo de ratón R26-mTmG , que en condiciones no recombinadas da como resultado la expresión ubicua de tdTomato (mT) de membrana. Tras la recombinación mediada por Cre, mT se cambia para la expresión de eGFP (mG) de membrana. (C) Representación 3D de un conducto mamario alargado y ramificado durante varios días fotografiado a través de un R.MIW en un R26-CreERT2; Ratón hembra R26-mTmG a las 6 semanas de edad. (D) Imágenes de plano Z único de la punta ramificada (paneles superiores) y la rama alargada (paneles inferiores). mT se representa en rojo, y mG en cian, las barras de escala representan 100 μm (A y B). Las células individuales en el estroma están resaltadas por asteriscos blancos. Tenga en cuenta que la intensidad de la señal se incrementó manualmente para resaltar las células individuales en el estroma, lo que lleva a una apariencia ligeramente sobreexpuesta de las células epiteliales mamarias. (E) Imágenes representativas del ganglio linfático inguinal de un R26-CreERT2; Ratón hembra R26-mTmG fotografiado a través de un R.MIW, mostrando un escaneo de mosaico general (panel izquierdo), imágenes de zoom (paneles derechos) de un solo plano Z (arriba) y una representación 3D (abajo). La segunda generación armónica (colágeno I) se muestra en verde, mT en rojo y mG en cian. Las barras de escala representan 500 μm (visión general tilescan) y 100 μm (imágenes de zoom). Los paneles de figuras C y D se modifican a partir de Messal et al. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Del mismo modo, en la glándula mamaria adulta, el enfoque R.MIW propuesto permite la visualización de las mismas estructuras ductales durante varios días con una visibilidad sin compromisos. Incluso el uso de modelos de reportero fluorescente menos brillante24, como el modelo de ratón Cdh1-mCFP (Ecadherin-mCFP), permite la visualización de la estabilidad ductal y los cambios morfológicos sutiles a una resolución celular (Figura 5). Tenga en cuenta que la visibilidad entre el día 3 y el día 5 mejoró significativamente después del reposicionamiento del tejido (Figura 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig05.jpg"> Figura 5: Imágenes de varios días de la glándula mamaria adulta. 3D representó imágenes de una estructura ductal mamaria de un ratón hembra adulta Cdh1-mCFP (cian, que marca la expresión de células luminales positivas para ecadherina) durante varios días consecutivos. El patrón de colágeno I (segunda generación armónica, magenta) se utilizó para volver sobre el mismo ROI, y la señal Cdh1-mCFP se utilizó para marcar las células ductales (luminales). Tenga en cuenta que la visibilidad después del día 3 mejoró mediante la apertura de la tapa R.MIW y el reposicionamiento del tejido. Las barras de escala representan 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para evaluar la heterogeneidad proliferativa de las células epiteliales mamarias durante el ciclo hormonal a nivel unicelular, se utilizó el modelo25,26 de ratón reportero Kikume Verde-Rojo (KikGR) foto-convertible, que tiene expresión ubicua de la proteína KikGR. KikGR es un fluoróforo brillante que sufre una conversión de verde a rojo tras la exposición a la luz violeta y la relación rojo/verde se puede utilizar como un proxy para la actividad proliferativa de una célula2 (Figura 6A, B). Utilizando el enfoque R.MIW, seguimos las mismas células dentro del árbol ductal de la glándula mamaria adulta durante varios días y encontramos heterogeneidad proliferativa previamente imprevista en todo el árbol ductal (Figura 6C). Las células proliferativas altas y bajas se distribuyeron equitativamente en las diferentes áreas convertidas (Figura 6C, D). Sorprendentemente, a nivel local, las células vecinas mostraron grandes diferencias en su relación rojo/verde (Figura 6C, D). La cuantificación de la relación rojo/verde de diferentes células (como proxy de su actividad proliferativa) 10 días después de la fotoconversión, reveló tasas de dilución altamente variables de algunas células dentro del mismo microambiente ductal (Figura 6E). Juntos, estos datos revelan una notable heterogeneidad proliferativa local dentro de la glándula mamaria adulta y, al mismo tiempo, una tasa de rotación uniforme global.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig06.jpg"> Figura 6: IVM longitudinal de heterogeneidad proliferativa en la glándula mamaria adulta utilizando el modelo de ratón KikGR. (A) Los ratones KikGR fueron fotografiados en el día 0 antes y después de la exposición a la luz violeta. Las sesiones de imágenes se repitieron en los días 2, 6 y 10 después de la conversión. (B) Representación esquemática de los resultados hipotéticos tras la fotoconversión de células epiteliales mamarias KikGR después de la proliferación (panel izquierdo) y sin proliferación (panel derecho) en función del tiempo. (C) La misma área de la glándula mamaria fue fotografiada a través de un R.MIW durante un período de 10 días. Las regiones más pequeñas se fotoconvirtieron en el día 0 y muestran una tasa de dilución similar de la señal roja de Kikume a lo largo del tiempo, lo que indica una tasa de rotación igual en todo el epitelio. (D) Las imágenes de zoom (planos Z individuales) de las regiones indicadas en el panel C muestran heterogeneidad proliferativa a nivel celular 6 y 10 días después de la fotoconversión. Las barras de escala representan 100 μm (panel C) y 10 μm (panel D). (E) Cuantificación de la relación rojo/verde de células seleccionadas aleatoriamente (n = 48 celdas) en tres áreas fotoconvertidas. Una alta relación rojo/verde es indicativa de una baja tasa de dilución y baja actividad proliferativa, mientras que una baja relación rojo/verde es indicativa de una alta tasa de dilución y proliferación. Los paneles de figura C-E han sido modificados de Messal et al. 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe una nueva ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable (R.MIW). La microscopía intravital después de la implantación del R.MIW permite obtener imágenes longitudinales y de varios días de la glándula mamaria sana y enferma con una resolución celular durante las diferentes etapas del desarrollo.

Microscopía intravital longitudinal con una ventana de imágenes mamarias con tapa reemplazable

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

La glándula mamaria es altamente dinámica y se somete a múltiples rondas de remodelación a lo largo de la vida. Nuestro protocolo permite capturar la dinámica celular que impulsa los reordenamientos tisulares en la glándula mamaria sana y enferma. Nuestra ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable permite realizar imágenes intravitales longitudinales de la glándula mamaria durante largos períodos de tiempo, hasta varias semanas.La tapa reemplazable de la ventana de imágenes mamarias garantiza condiciones óptimas de imagen en todo momento y permite la manipulación de tejidos o la administración de medicamentos entre sesiones de imágenes. Nuestro método no solo proporciona información sobre la biología saludable de la glándula mamaria, sino que también nos permite estudiar la iniciación y progresión del tumor mamario a nivel de una sola célula. Comience colocando la tapa de la ventana de imágenes mamarias sobre una superficie estéril y aplicando pegamento adhesivo de cianoacrilato alrededor de todo el perímetro de la tapa del borde.Coloque con cuidado un resbalón de cubierta de vidrio redondo de 10 milímetros en la parte superior de la tapa. Use un palo de madera estéril para colocar el resbalón de la cubierta de vidrio y aplique algo de fuerza para empujarlo hacia abajo para garantizar un sello hermético entre el deslizamiento de la cubierta de vidrio y el marco de la tapa. Asegúrese de que el vidrio no cubra los orificios en los brazos de la tapa.Desinfecte las tapas y la ventana de imágenes mamarias sumergiéndolas en etanol al 80% durante al menos 30 minutos en una placa de Petri cerrada. Use una punta de algodón empapada en acetona para eliminar el exceso de pegamento adhesivo de cianoacrilato en el resbalón de la cubierta de vidrio. Para preparar al ratón para la cirugía, afeite el área alrededor de la cuarta glándula mamaria con una cuchilla de afeitar.Use el cuarto pezón como punto de referencia y elimine los pelos sueltos con cinta adhesiva. Realice una prueba de extracción de patas para verificar si el animal está adecuadamente anestesiado. Levante suavemente la piel con pinzas finas de Graefe y use tijeras de resorte pequeñas para hacer una incisión diagonal de 10 a 15 milímetros en la piel en la parte superior de la cuarta almohadilla de grasa mamaria Use el cuarto pezón como punto de orientación y asegúrese de no cortar o dañar el peritoneo o la glándula mamaria.Separe la piel de la almohadilla de grasa mamaria y las capas de tejido subyacentes mediante una disección roma de hasta cinco a ocho milímetros alrededor de la línea de incisión para crear un bolsillo que se ajuste al marco de la ventana de imágenes mamarias. Defina la región de interés, o ROI, en función de las características macroscópicas del tejido mamario, incluida la ubicación del ganglio linfático o una lesión tumoral. Trate de mantener el ROI central con respecto a la incisión.Tome la ventana de imágenes mamarias con fórceps estériles y pruebe si la incisión es lo suficientemente grande como para insertar la ventana. Si es necesario, agrande ligeramente la incisión hasta que la ventana de imágenes mamarias encaje. Retire la ventana y use una sutura de seda 5-0 para colocar una sutura de cuerda de bolso de uno a dos milímetros de distancia del borde de la incisión comenzando desde el extremo caudal y desde el exterior hasta el interior de la piel.Muévase aproximadamente cinco milímetros hacia arriba a lo largo de la incisión y pase el hilo de sutura a través de la piel de adentro hacia afuera. Repita este procedimiento a lo largo del borde de la incisión, creando así una sutura circular que consta de cinco a seis bucles. La salida final del hilo de sutura debe ubicarse aproximadamente a dos a cinco milímetros de distancia de la primera entrada.Coloque la ventana de imágenes mamarias dentro de la incisión y use las pinzas Graefe para colocar cuidadosamente la piel en la ranura de la ventana. Asegúrese de dejar los bucles de la sutura afuera. Tire de los bucles de la sutura de la cuerda del bolso y tire suavemente de ambos extremos de la sutura para apretarla en la ranura de la ventana de imágenes mamarias.Ata con nudos quirúrgicos y corta el exceso de hilo. Use un palillo de dientes para aplicar vaselina en el borde interno de la ventana, evitando el tejido subyacente. Empuje suavemente el marco de la ventana hacia abajo con pinzas estériles y coloque la tapa en el marco de la ventana.Esto evitará un volumen de aire entre el tejido de la glándula mamaria y la tapa de la ventana de imágenes mamarias. Coloque las puntas de las pinzas delgadas a través de los orificios en los brazos de la tapa y apriete la tapa girándola en el sentido de las agujas del reloj. Si queda algo de aire después de apretar el párpado, introduzca una aguja de insulina estéril a través de la piel en la cavidad entre el tejido mamario y el párpado y saque lentamente el émbolo, creando así un vacío entre el tejido de la glándula mamaria y la tapa de la ventana de imágenes mamarias.Ahora el ganglio linfático se puede observar fácilmente después de este procedimiento. Inspeccione el estado del marco de la ventana de imágenes mamarias y la tapa, incluida la estabilidad de las suturas o cualquier daño potencial a la tapa. Coloque el mouse en la incrustación de tal manera que la ventana de imágenes mamarias caiga en el orificio de la incrustación de la caja de imágenes.Aplique cinta semitransparente y de papel sobre la parte posterior del ratón para estabilizar el ratón y reducir el movimiento del tejido debido a la respiración. Para sesiones de imágenes de más de tres horas, coloque una aguja flexible por vía subcutánea en el cuello del ratón y asegúrela con cinta adhesiva. Conecte una jeringa de 10 milímetros con una mezcla de nutrientes a un tubo de silicona flexible y empuje la mezcla de nutrientes hasta que llegue al final del tubo.Conecte el tubo de silicona a la aguja flexible e inyecte 50 microlitros de la solución infundida cada 30 minutos. Coloque la tapa sobre la caja de imágenes para cerrarla. Luego, asegure la caja de imágenes en la etapa del microscopio.Compruebe que el ratón es estable dentro de la caja de imágenes. Defina el área de interés utilizando el modo de epifluorescencia del microscopio y aplique los ajustes del microscopio. Utilice la función Espiral en el modo de navegador del software de imágenes para generar un gran escaneo de mosaico de visión general y crear un mapa de referencia del tejido.Defina la región de intereses dentro de la descripción general de Spiral y, a continuación, defina los planos Z superior e inferior para determinar la pila Z. Pulse Inicio para obtener las pilas Z tridimensionales o cuatridimensionales detalladas del tejido. Coloque las puntas de las pinzas delgadas a través de los orificios de la ventana de imágenes mamarias en los brazos de la tapa y afloje la tapa girando en sentido contrario a las agujas del reloj.Alternativamente, el tejido se puede manipular o reposicionar utilizando fórceps contundentes estériles para optimizar las condiciones de imagen para la región específica de interés. Aplique vaselina en el borde interno de la ventana de imágenes mamarias, evitando el tejido subyacente. Empuje suavemente el marco de la ventana hacia abajo con pinzas estériles y coloque la tapa en el marco de la ventana.Finalmente, coloque las puntas de las pinzas delgadas a través de los orificios de los brazos de la tapa y aligera la tapa girándola en el sentido de las agujas del reloj. A los ratones GFP de membrana de tomate de membrana Rosa26 Rosa26 de Rosa26 puberal se les inyectó una dosis baja de tamoxifeno, lo que llevó a la recombinación mediada por Cre del alelo GFP de membrana de tomate de membrana Rosa26. Los ratones fueron fotografiados en los días uno, tres y cinco para seguir los cambios dinámicos en la glándula mamaria en desarrollo.Las imágenes representativas muestran la representación en 3D de un conducto mamario alargado y ramificado durante varios días fotografiado a través de una ventana de imágenes mamarias. Aquí se muestran imágenes de un solo plano Z de la punta ramificada y la rama alargada. Las células individuales en el estroma están resaltadas por asteriscos blancos.Las imágenes representativas muestran el ganglio linfático inguinal del ratón fotografiado a través de una ventana de imágenes mamarias. La segunda generación armónica se representa en verde. Aquí se muestran imágenes renderizadas en 3D de una estructura ductal mamaria de un ratón CFP de membrana E-cadherina hembra adulta durante varios días consecutivos.El patrón de colágeno I se utilizó para volver sobre el mismo ROI y la señal CFP de la membrana de E-cadherina se utilizó para marcar las células ductales. Los ratones verde-rojo Kikume fueron fotografiados en el día cero antes y después de la exposición a la luz violeta. Las sesiones de imágenes se repitieron en los días dos, seis y 10 después de la conversión.La misma área de la glándula mamaria fue fotografiada a través de una ventana de imágenes mamarias durante 10 días. Las regiones más pequeñas se fotoconvirtieron en el día cero y mostraron una tasa de dilución similar de la señal roja de Kikume a lo largo del tiempo, lo que indica una tasa de rotación igual en todo el epitelio. Las imágenes de zoom de las regiones indicadas muestran heterogeneidad proliferativa a nivel celular seis y 10 días después de la fotoconversión.La cuantificación de la proporción rojo-verde de diferentes células 10 días después de la fotoconversión reveló tasas de dilución muy variables de algunas células dentro del mismo microambiente ductal. Un paso crucial de este procedimiento es abrir la tapa entre las sesiones de imágenes. Esta característica única de la ventana mejora las condiciones de imagen y permite la obtención de imágenes longitudinales del tejido.La ventana de imágenes mamarias con una tapa reemplazable facilitará nuevas preguntas sobre las pruebas de drogas in vivo y de acción rápida y la detección en el campo de la iniciación y progresión del tumor en la glándula mamaria del ratón.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Photoswitching intravital y el seguimiento de Dendra2 marcado con las células tumorales a través de la ventana de imagen mamaria es una técnica que nos permite la imagen del comportamiento metastático de las células tumorales en los microambientes tumor elegido por un plazo de días.

Dendra2 Photoswitching a través de la ventana de imágenes mamarias

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar imágenes unicelulares de alta resolución a largo plazo del pulmón intacto en tiempo real utilizando una ventana de imagen estabilizada por vacío.

A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado

Este protocolo describe la imagen intravital de ratones transgénicos que expresaban marcadores fluorescentes específicos de la célula. La proyección de imagen intravital proporciona un método no invasivo para observaciones de alta resolución en animales vivos utilizando windows implantables a través del cual es posible la visualización microscópica de los procesos. Este método es especialmente útil para estudiar procesos longitudinales.

La microscopia intravital de la utilización de la vasculatura asociada a Tumor avanzado Dorsal cámaras de ventana pliegues cutáneos en ratones transgénicos fluorescentes

Describimos un método para visualizar los IEL con la etiqueta GFP utilizando imágenes intravitales del intestino delgado murina mediante microscopía confocal de disco giratorio invertido. Esta técnica permite el seguimiento de células vivas dentro de la mucosa hasta 4 h y se puede utilizar para investigar una variedad de interacciones inmunoepiteliales intestinales.

Imágenes intravitales de linfocitos intraepiteliales en el intestino pequeño murino

Las imágenes in vivo de alta resolución del páncreas se facilitaron con la ventana de imágenes intravitales pancreáticas.

Visualización longitudinal estabilizada a nivel celular in vivo del páncreas en un modelo murino con una ventana de imágenes intravitales pancreáticas

Aquí se presenta un enfoque para imágenes intravitales a largo plazo utilizando ventanas de silicona ópticamente transparentes que se pueden pegar directamente al tejido / órgano de interés y la piel. Estas ventanas son más baratas y versátiles que otras utilizadas actualmente en el campo, y la inserción quirúrgica causa inflamación y angustia limitadas a los animales.

Imágenes intravitales longitudinales a través de ventanas de silicona transparente

El método de imágenes intravitales descrito aquí utiliza la segunda generación armónica de colágeno y la fluorescencia endógena del cofactor metabólico NAD(P)H para segmentar de forma no invasiva un microambiente tumoral no etiquetado en compartimentos tumorales, estromales y vasculares para un análisis en profundidad de imágenes intravitales 4D.

Un enfoque de segmentación sin etiquetas para imágenes intravitales del microambiente tumoral mamario

El presente protocolo describe una técnica sencilla para la obtención de imágenes intravitales de la glándula mamaria de ratón lactante mediante microscopía confocal y multifotónica de barrido láser.

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El protocolo presenta una nueva herramienta para simplificar la obtención de imágenes intravitales mediante microscopía confocal invertida.

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Mamaria células tumorales que expresan luciferasa se implanta de forma subcutánea en ratones y se visualizan con imágenes ópticas para controlar el crecimiento tumoral y el desarrollo de forma no invasiva en un estudio longitudinal.

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Aprende microscopía intravital longitudinal con una ventana mamaria de tapa reemplazable para estudiar la dinámica celular en glándulas sanas y tumorales. Este método permite el seguimiento del desarrollo mamario y la progresión tumoral a nivel de célula única durante varias semanas.

Microscopía intravital longitudinal con una ventana de imágenes mamarias con tapa reemplazable

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