Name: Verschuivingen op neuron-glia-circuit visualiseren met de calciumbeeldvormingstechniek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Leer calciumbeeldvorming om neuron- en glia-reacties te onderscheiden in kippenretina-culturen met Fura-2 AM. Deze methode volgt calciumdynamiek na stimulatie met kaliumchloride en ATP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Beurzen, sponsors en financieringsbronnen: MH is ontvanger van een PhD CNPq-beurs. HRF ontvangt een postdoc fellowship ondersteund door CNPq (HRF grant number 152071/2020-2). RAMR wordt ondersteund door CNPq en FAPERJ (subsidienummers E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 en 312157/2016-9 en INCT-INNT (National Institute for Translational Neuroscience).

Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Federal University of Rio de Janeiro, volgens de "Principles of Laboratory Animal Care" (NIH, Bethesda, VS); vergunningsnummer IBCCF-035 voor bevruchte White Leghorn kippeneieren.
1. Bereiding van oplossingen
<ol><li>Krebs-oplossing bereiden: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 6 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 7,4, 373 mOsm).</li>
	<li>Bereid zoutoplossingbuffer voor (Ca2+ en Mg2+ vrije oplossing - CMF): 76,55 g/L NaCl, 3,05 g/L KCl, 1,65 g/L Na2HPO4, 0,610 g/L KH2PO4, 21,95 g/L glucose en 7,90 g/L NaHCO3.</li>
	<li>Bereid broedoplossing voor (met Fura-2 in Krebs-oplossing:) 5 μM Fura-2-acetoxymethylester (Fura-2), 0,1% vetzuurvrij runderserumalbumine (BSA) en 0,02% poloxameer 407.</li>
	<li>Voor gemengde populatie of gliacultuur, bereid DMEM /F12 met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 40 mg / L gentamicine als medium.</li>
	<li>Voor neuron verrijkte cultuur, bereid DMEM / F12 met 1% FCS, neuronale celcultuur supplement, 40 mg / L en gentamicine als medium.</li>
</ol>2. Retinadissectie en celkweekvoorbereiding
<ol><li>Open het 8 dagen oude eicel van het kikkererkimbryo (E8) waar de luchtcel zich bevindt.</li>
	<li>Verwijder de ei-inhoud in een petrischaaltje en ga verder met de embryo-euthanasie door onthoofding met een pincet.</li>
	<li>Breng de kop naar een schone petrischaal en giet wat calcium- en magnesiumvrije oplossing (CMF) om het te wassen.</li>
	<li>Verwijder de ogen en zorg ervoor dat u deze tijdens het proces niet beschadigt. OPMERKING: Probeer te voorkomen dat de ooglagen worden doorgesneden of versnipperd voordat u deze uit de oogholte verwijdert.</li>
	<li>Breng de ogen naar een schone petrischaal met CMF.</li>
	<li>Begin de oogdissectie door de lens te verwijderen.</li>
	<li>Maak 3 of 4 longitudinale sneden in het oog, te beginnen bij het gat dat de lens achterlaat. Maak sneden door aan het pincet te trekken en de oogsclera in tegengestelde richtingen te houden.</li>
	<li>Verwijder het transparante glasachtige lichaam met de nodige voorzichtigheid en zorg ervoor dat het netvlies er niet aan gebonden is.</li>
	<li>Maak het netvlies los van het gepigmenteerde epitheel en verwijder eventueel achtergebleven weefsel.</li>
	<li>Knip het heldere netvlies in kleine stukjes.</li>
	<li>Breng het netvlies over naar een andere ontvanger en centrifugeer het kort (~ 1.800 x g gedurende 1 minuut) om het CMF te verwijderen.</li>
	<li>Dissociëren het netvlies enzymatisch met 1 ml 0,25% trypsine, door het gedurende 10 minuten bij 37 °C te incuberen.</li>
	<li>Stop de reactie door 1 ml medium toe te voegen dat 10% FCS bevat.</li>
	<li>Was het netvlies 2 of 3 keer met medium. De was bestaat uit cycli van het toevoegen van medium en het verwijderen door centrifugeren (~ 1.800 x g gedurende 1 min).</li>
	<li>Voeg 2 ml volledig medium per netvlies toe en dissociëer het netvlies voorzichtig mechanisch door het op en neer te pipetteren. OPMERKING: Hier kunnen onderzoekers kiezen welk type cultuur zal worden voorbereid. Gebruik voor een verrijkte neuronale cultuur DMEM-F12 + neuronaal supplement + 1% FCS + antibiotica. Voor gemengde populatie of gezuiverde glia, gebruik DMEM-F12 + 10% FCS + antibiotica.</li>
	<li>Tel de cellen en verdun ze tot de gewenste dichtheid. OPMERKING: Idealiter zou dit een cultuur met lage dichtheid moeten zijn met ~ 2 x 106 cellen of minder.</li>
	<li>Voeg 50 μL van de celsuspensie toe aan elke coverslip.</li>
	<li>Coverslip behandeling<ol>
<li>Incubeer coverslips gedurende ten minste 1 uur (idealiter 's nachts) in 1 ml van 10-50 μg / ml poly-L-lysine in gesteriliseerd gezuiverd water bij 37 °C.</li>
		<li>Verwijder de poly-L-lysine-oplossing en was de dekens met gesteriliseerd gezuiverd water 2-3 keer.</li>
		<li>Laat coverslips drogen in een veiligheidskast met UV-lampen aan. Bewaar ze op dit punt in een verzegelde container bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.</li>
		<li>Optionele stap: Voeg voor met neuronen verrijkte culturen 50 μL 10-20 ng/ml laminine in PBS of medium toe aan elke coverslip gedurende 2 uur bij 37 °C. Verwijder na incubatie overtollige laminine-oplossing en de coverslip is klaar voor gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer cellen bij 37 °C bij een CO2-atmosfeer van 5% totdat ze zich aan het glas hechten. Dit duurt ongeveer 1-2 uur.</li>
	<li>Voeg 1 ml volledig medium toe aan elke put en breng de plaat terug naar de incubator tot de dag van het experiment. Vervang indien nodig het medium om de 2-3 dagen.</li>
</ol>3. Cellen laden met Fura-2 AM
<ol><li>Reconstitueer een injectieflacon fura-2 AM van 50 μg met 50 μl DMSO.</li>
	<li>Om een werkende Fura-2 AM-oplossing te bereiden, voegt u 3 μL 10% Poloxameer 407, 7,5 μL Fura-2 AM in DMSO en Krebs-oplossing q.s.p. toe aan 1,5 ml.</li>
	<li>Soniceer het mengsel gedurende 7 minuten in een waterbad.</li>
	<li>Was de dekplaat 3x met de celkweek met Krebs-oplossing voordat u deze in Fura-2 incubeert.</li>
	<li>Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 30 min.</li>
	<li>Was het na de incubatie 3x opnieuw en breng het over naar een andere ontvanger met Krebs en beschermd tegen het licht. OPMERKING: De werkende Fura-2 AM-oplossing blijft 24 uur stabiel als deze wordt beschermd tegen het licht.</li>
</ol>4. Calcium beeldvorming van cellen
<ol><li>Voeg voor elke run silicium toe aan de afdekplaatsteun en -kamer om lekkage tijdens het experiment te voorkomen.</li>
	<li>Was de bodem van de coverslip met gedestilleerd water om zoutkristallisatie op de microscooplens te voorkomen.</li>
	<li>Leg de coverslip op de steun en druk zachtjes op de randen.</li>
	<li>Bevestig de steun en kamer aan de microscoop en begin cellen te perfuseren met Krebs-oplossing. OPMERKING: Celperfusie tijdens eencellige calciumbeeldvormingsexperimenten wordt gekalibreerd tot een stroomsnelheid van 0,5 ml / min en het duurt 8-10 s voordat de platformoplossing volledig is vervangen.</li>
	<li>Bekijk de cellen en selecteer een geschikt gezichtsveld.</li>
	<li>Selecteer handmatig de cellichamen op basis van hun verschillende morfologie.</li>
	<li>Voordat u een stimulus toepast, wacht u op basislijnstabilisatie. Elke stimulus duurt ongeveer 30 seconden. OPMERKING: Bereid alle oplossingen direct voor elk experiment voor.</li>
	<li>Evalueer de variaties in [Ca2+]i door de verhouding van de uitgestraalde fluorescentie bij 510 nm na alternatieve excitatie (750 milliseconden) bij 340 en 380 nm te kwantificeren.</li>
	<li>Verwerk verworven waarden met behulp van fluorescentieanalysesoftware.</li>
	<li>Experimentele resultaten uitdrukken in een tabel waarin elke rij een afzonderlijke cel vertegenwoordigt en elke regel een tijdspunt.</li>
</ol>5. Gegevensverwerking
<ol><li>Zet met behulp van een spreadsheetsoftware de variatie van Fura-2 fluorescentieverhoudingswaarden van enkelvoudige cellen afzonderlijk of van allemaal tegelijk uit.</li>
	<li>Om het aantal reactieve cellen voor bepaalde stimulus te kwantificeren, stelt u een cutoff in van 30% toename van calciumbasislijnniveaus</li>
</ol>

<ol><li>Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+homeostasis+in+intact+lymphocytes%3A+cytoplasmic+free+calcium+monitored+with+a+new%2C+intracellularly+trapped+fluorescent+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator.</a> Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Islam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Signaling%3A+From+Basic+to+Bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium Signaling: From Basic to Bedside.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).</li>
<li>De Melo Reis, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+cell+phenotypes+differentiating+from+mice+retinal+neurospheres+using+single+cell+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).</li>
<li>Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+itself+promotes+the+developmental+switch+of+neuronal+GABAergic+responses+from+excitation+to+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition.</a> Cell. 105 (4), 521-532 (2001).</li>
<li>Schitine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ampakine+CX546+increases+proliferation+and+neuronal+differentiation+in+subventricular+zone+stem%2Fprogenitor+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).</li>
<li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+subventricular+zone+oligodendrogenesis%3A+a+role+for+hemopressin%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59(2014).</li>
<li>Ribeiro-Resende, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+lacking+GD3+synthase+display+morphological+abnormalities+in+the+sciatic+nerve+and+neuronal+disturbances+during+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration.</a> PLoS One. 9 (10), 108919(2014).</li>
<li>Xapelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+type+1+cannabinoid+receptor+%28CB1R%29+promotes+neurogenesis+in+murine+subventricular+zone+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures.</a> PLoS One. 8 (5), 63529(2013).</li>
<li>Kubrusly, R. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-glial+cannabinoid+receptors+modulate+signaling+in+the+embryonic+avian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina.</a> Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).</li>
<li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).</li>
<li>Illes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X7+Receptors+Amplify+CNS+Damage+in+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li>
<li>Faroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signaling+mediated+by+P2X7+receptors+controls+myelination+in+sciatic+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves.</a> Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).</li>
<li>Freitas, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+Induce+Cell+Death+and+Promote+P2X7+Receptor+Signaling+in+Retinal+Glial+Progenitors+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture.</a> Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).</li>
<li>Freitas, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-Induced+Calcium+Shifts+in+Chick+Retinal+Glial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells.</a> PLoS One. 11 (4), 0153677(2016).</li>
<li>Yang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+receptors+for+glutamate+and+GABA+in+retinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons.</a> Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).</li>
<li>Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+coupling+of+NMDA+receptor+with+ip3+production+in+cultured+cells+of+the+avian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina.</a> Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).</li>
<li>López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+amino+acid-induced+phosphoinositide+hydrolysis+in+M%C3%BCller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia.</a> Glia. 9 (2), 127-135 (1993).</li>
<li>Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+dopamine+research+in+retina+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods of dopamine research in retina cells.</a> Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).</li>
<li>Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, Á, de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+P2X7+Receptor%3A+Involvement+in+Neuronal+Physiology+and+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).</li>
<li>Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+P2X7+Receptors+Revisited%3A+Do+They+Really+Exist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).</li>
<li>Schitine, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+plasticity+of+GAT-3+in+avian+M%C3%BCller+cells+is+regulated+by+neurons+via+a+glutamatergic+input%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input.</a> Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).</li>
<li>Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+potentiates+the+release+of+GABA+mediated+by+NMDA+receptor+activation%3A+Involvement+of+A1+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors.</a> Neuroscience. 281, 208-215 (2014).</li>
<li>Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X7+receptor+large+pore+signaling+in+avian+M%C3%BCller+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).</li>
<li>Passos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Serotonergic+System+by+Kainate+in+the+Avian+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).</li>
<li>de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+an+active+compartment+modulating+nervous+activity+in+the+vertebrate+retina%3A+neurotransmitters+and+trophic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors.</a> Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).</li>
<li>Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotransmitter+Release+from+Astrocytes%3A+Functional+Developmental%2C+and+Pathological+Implications+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience.+9%2C+499%22%5BJournal%5D)">Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben het netvliesweefsel gebruikt om aan te tonen dat calciumresponsen gemedieerd door KCl of ATP duidelijk zijn gecompartimenteerd in respectievelijk neuronale en gliale responsen (figuur 1). Hoewel sommige gegevens in de literatuur impliceren dat P2X7-receptoren tot expressie komen in neuronen, die neuronale activiteit en synaptische neurotransmitterafgifte reguleren20, betwijfelen andere auteurs het bestaan van neuronale P2X7-receptoren. Inderdaad, de huidige ...

Vanwege de universele eigenschappen van calcium als tweede boodschapper, is dit ion betrokken bij een groot aantal signaleringsactiviteiten: gentranscriptie, geboorte en dood, proliferatie, migratie en differentiatie, synaptische transmissie en plasticiteit. Vandaar dat een methode die in staat is om de calciumactivatiedynamiek met getrouwheid en behendigheid te volgen, een manier zou bieden om unieke ruimtelijk-temporele reacties te observeren. Een dergelijke methode is de cellulaire calciumbeeldvormingstechniek, die calciumverschuivingen functionele gegevens correleert met specifieke celfenotypen op basis van hun verschillende reacties.
Ca2 + probes werden voor het eerst ontwikkeld in de jaren 1980, met latere verbeteringen waardoor deze moleculen kunnen worden gebruikt in levende cel assays1. Als chemische indicator wordt Fura-2 beschouwd als de standaard voor kwantitatieve [Ca2+]i metingen. De acetoxymethylester (AM) van deze indicator (d.w.z. Fura-2 AM) dringt gemakkelijk door in het celmembraan en kan intracellulaire concentraties bereiken die 20 keer groter zijn dan de incubatieverdunning (bijv. [5 μM] o / [100 μM]i). Een ander voordeel van Fura-2 is dat het een goede fotobleachingweerstand heeft; het in beeld brengen van deze indicator voor langere tijd zal dus geen grote invloed hebben op de fluorescentiemogelijkheden. Ten slotte is Fura-2 gevoelig voor een breed scala aan calciumniveaus, van ~ 100 nM tot ~ 100 μM, en heeft het een Kd van ~ 145 nM, wat vergelijkbaar is met de rust [Ca2 +] i2. Later werd celcalciumbeeldvorming ontwikkeld met betere fluorescerende microscopen en berekeningsmethoden, samen met ratiometrische sondes die niet worden beïnvloed door kleurstofbelasting.
Elke cel drukt verschillende calciumapparaten uit (pompen, transporters, receptoren en kanalen) die bijdragen aan de uiteindelijke respons als een bepaalde handtekening. De belangrijke tip is om selectieve reacties van verschillende soorten cellen te vinden die gecorreleerd zijn met hun fenotypische expressie. Dienovereenkomstig zijn er ten minste twee verschillende receptoren die werken via calciumverschuivingen: ionotrope receptoren die Ca2 + in een snelle modus doordringen en langzame metabotrope receptoren gekoppeld aan signaalroutes en intracellulaire voorraden die Ca2 + vrijgeven die worden geactiveerd door tweede boodschappers, zoals inositoltrifosfaat en cyclisch ADP-ribose3.
Voorlopercellen brengen bijvoorbeeld nestine tot expressie in het onrijpe netvlies en vertonen GABAA-receptoren gedepolariseerd door GABA (of muscimol)4. Dit gebeurt als gevolg van de Cl- elektrochemische gradiënt met hoge intracellulaire Cl− niveaus; naarmate het weefsel zich ontwikkelt, schakelen KCC2-transporters over van excitatie op voorlopercellen naar remming op volwassen GABAerge neuronen5. Aan de andere kant presenteren stamcellen die sox-2 tot expressie brengen in de onrijpe subventriculaire zone (SVZ) van postnatale knaagdieren ook metabotrope H1-receptoren die worden geactiveerd door histamine die Ca2 + op een langzame manier verhoogt6. Een tweede metabotrope receptor uit de protease-geactiveerde receptor-1 (PAR-1) familie, geactiveerd door trombine en stroomafwaarts naar G(q/11) en fosfolipase C (PLC), geeft langzame Ca2+ verschuivingen in oligodendrocyten (die O4 en PLP tot expressie brengen) gegenereerd uit multipotente SVZ neurale stamcellen7.
Over het algemeen drukken neuronen spanningsafhankelijke calciumkanalen uit, evenals belangrijke neurotransmitterreceptoren die doorlaatbaar zijn voor Ca2 +, zoals glutamaterge (AMPA, NMDA, kainate) en perifere en centrale nicotinereceptoren. Kaliumchloride wordt meestal gebruikt als een depolariserend middel om perifere neuronen te activeren, zoals de dorsale wortel ganglion neuronen8 of centrale neuronen, vanaf subventriculaire zone9 of retina10. Aan de andere kant wordt ATP erkend als de belangrijkste gliotransmitter (naast D-serine), die selectieve Ca2 + permeabele P2X-leden activeert, zoals P2X7 en P2X4. Beide receptoren vertonen equivalente Ca2+-stromen, vergelijkbaar met die van NMDA-receptoren die worden erkend als de grootste Ca2+-stromen die door zenders worden geactiveerd11. P2X7-receptoren komen sterk tot expressie op microglia, maar met een lagere dichtheid op astrocyten en oligodendrocyten, die een rol spelen bij de afgifte van pro-inflammatoire cytokines12. P2X7-receptoren worden ook tot expressie gebracht op Schwann-cellen13 en Müller-glia in het netvlies14,15.
Van het netvlies is bekend dat het bijna alle zenders in de hersenen laat zien. De verticale as (fotoreceptoren, bipolaire en retinale ganglioncellen) is bijvoorbeeld voornamelijk glutamaterge, met calciumdoorlatende AMPA- of kainatereceptoren uitgedrukt in OFF-bipolaire cellen en mgluR6 uitgedrukt in ON-bipolaire cellen16. Vreemd genoeg worden alle drie de receptoren ook aangetroffen in Müller glia, die zijn gekoppeld aan calcium- en inositoltrifosfaatroutes17,18. De horizontale remmende as, gemaakt door horizontale en amacrine cellen, scheidt niet alleen GABA, maar ook dopamine, acetylcholine en andere klassieke neurotransmitters. Amacrinecellen zijn de belangrijkste soorten cellen die worden aangetroffen in de aviaire retinale culturen, met verschillende soorten calciumbediende kanalen, zoals glutamaterge, purinerge, nicotine- en spanningsafhankelijke calciumkanalen. Om deze reden is dit een uitstekend model om verschillende eigenschappen van calciumverschuivingen tussen neuronen en glia te evalueren.
Daarom maakt de combinatie van verschillende receptoren en kanalen opgeteld tot selectieve fenotypische markers tijdens de ontwikkeling met verschillende agonistische responspatronen unieke handtekeningen mogelijk in stam, voorloper, neuron, astrocyten, oligodendrocyten en microglia die werken via selectieve signaleringsapparaten.

<table><tbody><tr><td>15 mm coverslip</td><td>Paul Marienfeld GmbH &amp; Co. KG</td><td>111550</td><td>Cell suport</td></tr><tr><td>510 nm long-pass filter</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A1852</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Suplement</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>CoolSNAP digitale camera</td><td>Roper Scientific, Trenton, NJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Neon</td><td>1466</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/ F-12</td><td>Gibco</td><td>12400-24</td><td>Cell cultuur medium</td></tr><tr><td>Excel Software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>Suplement</td></tr><tr><td>Fluorescentie Microscoop</td><td>Axiovert 200; Carl Zeiss</td><td>B 40-080</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Molecular Probes</td><td>F1221</td><td>Ratiometrische Ca2+ indicator</td></tr><tr><td>Gentamicine Sulfaat</td><td>Calbiochem</td><td>1405-41-0</td><td>antibiotica</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4 apparaat</td><td>Sutter Instrument, Novato, CA</td><td>DG-4PLUS/OF30</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>Help bij celhechting</td></tr><tr><td>Metafluor software</td><td>Universal Imaging Corp. West Chester, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Vetec</td><td>129</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Isofar</td><td>310</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Vetec</td><td>306</td><td></td></tr><tr><td>PH3 platform</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT</td><td>64-0286</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Molecular Probes</td><td>P6866</td><td>Niet-ionogene, oppervlakte-actieve stof</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Help bij celhechting</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,25%</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Dissociatie enzym</td></tr></tbody></table>

verschuivingen op neuron-glia-circuit visualiseren met de calciumbeeldvormingstechniek

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Hier rapporteren we over selectieve in vitro modellen van circuits op basis van glia (astrocyten, oligodendrocyten en microglia) en /of neuronen uit perifere (dorsale wortelganglia) en centrale weefsels (cortex, subventriculaire zone, organoïde) die dynamisch worden bestudeerd in termen van calciumverschuivingen. Het model dat is gekozen om de resultaten te illustreren is het netvlies, een eenvoudig weefsel met complexe cellulaire interacties. Calcium is een universele boodschapper die betrokken is bij de meeste belangrijke cellulaire rollen. We leggen in een stapsgewijs protocol uit hoe retinale neuron-gliacellen in cultuur kunnen worden voorbereid en geëvalueerd, waarbij calciumverschuivingen worden voorgesteld. In dit model onderscheiden we neuronen van glia op basis van hun selectieve respons op KCl en ATP. Calciumdoorlatende receptoren en kanalen worden selectief tot expressie gebracht in verschillende compartimenten. Om calciumreacties te analyseren, gebruiken we ratiometrische fluorescerende matrijzen zoals Fura-2. Deze sonde kwantificeert de vrije Ca2+ concentratie op basis van Ca2+-vrije en Ca2+-gebonden vormen, met twee verschillende pieken, gebaseerd op de fluorescentie-intensiteit die op twee golflengten wordt waargenomen.

Hier gebruikten we netvliescellen in cultuur van embryonale dag 8-kuikens om te onderzoeken hoe neuronen en glia signaleren in termen van calciumverschuivingen. Culturen werden in wezen bereid zoals beschreven15,19 als gemengde neuron-gliacellen (met een dichtheid van ≥ 1 x 106 cel/schotel) in een stadium van 7 dagen in vitro (figuur 1A). Als alternatief, verrijkte neuronale cellen bereid in lage dichtheid (5 x 105</s...

Celcalciumbeeldvorming is een veelzijdige methodologie om dynamische signalering van individuele cellen te bestuderen, op gemengde populaties in cultuur of zelfs op ontwaakte dieren, gebaseerd op de expressie van calciumdoorlatende kanalen / receptoren die unieke functionele handtekeningen geven.

Verschuivingen op neuron-glia-circuit visualiseren met de calciumbeeldvormingstechniek

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in cytosolische calciumconcentraties in levende cellen te volgen om neuronale of gliaresponsen te differentiëren op basis van kaliumchloride of ATP-stimuli. Calcium is een belangrijke tweede boodschapper die betrokken is bij verschillende cellulaire processen, waaronder neurotransmissie, plasticiteit en apoptose. De komst van hoogselectieve fluorescerende calciumkleurstof, zoals Fura-2 AM, geassocieerd met de ontwikkeling van betere fluorescerende microscopen en berekeningsmethoden, leverde optische gegevens met een hoge resolutie op met een hoge mate van ruimtelijke en temporele resolutie om calciumsignalering op levende cellen en organismen in beeld te brengen.Dit protocol is aanpasbaar aan verrijkte neuron, gezuiverde glia of gemengde populatieculturen. Het houdt bij welke celtypen reageerden op bepaalde stimuli op basis van de differentiële respons op kaliumchloride en ATP. Kaliumchloride verandert het membraanpotentiaal van cellen.En dit opent spanningsafhankelijke calciumkanalen, in wezen uitgedrukt door neuronen. Aan de andere kant activeert ATP P2X7 groot deel kanaal, voornamelijk aanwezig in gliacellen. Door kaliumchloride- en ATP-stimuli te koppelen aan andere geneesmiddelen, is het mogelijk om te zien welk compartiment van het zenuwstelsel erop reageert, op basis van de toename van de intracellulaire calciumconcentratie.Voor deze procedure hebt u enkele chirurgische instrumenten of pincetten nodig. Gebruik een bioveiligheidskast en voer de beste praktijken uit om besmetting te voorkomen. Om de netvlieskweek van de kip te starten, opent u voorzichtig een bevruchte eicel aan de onderkant, waar de luchtcel zich bevindt.Verwijder de inhoud in een petrischaaltje en ga verder met de embryodonatie door onthoofding met een pincet. Zodra de kop is verwijderd, breng je het naar een schone petrischaal en voeg je er wat calcium- en magnesiumvrije oplossing aan toe. Verwijder vervolgens de ogen en zorg ervoor dat ze tijdens het proces niet worden beschadigd.Breng het oog naar een andere petrischaal met CMF-oplossing. Begin met een pincet het oog te ontleden door de lens te verwijderen. Doe vervolgens, beginnend bij het gat dat de lens achterlaat, drie of vier longitudinale sneden in het oog.Verwijder de transparante glasachtige behuizing met de nodige voorzichtigheid. Zorg ervoor dat het netvlies er niet aan vastzit. Maak vervolgens het netvlies voorzichtig los van het gepigmenteerde epitheel.Verwijder eventueel achtergebleven epitheelweefsel. Wanneer het netvlies helemaal helder is, knip het dan in kleine stukjes. Neem al het netvliesweefsel met behulp van een geautomatiseerde pipet.Centrifugeer kort het netvlies om alle CMF te verwijderen. Voeg 1 ml 0,25% trypsine toe. En incubeer het weefsel bij 37 C gedurende 10 minuten.Stop de trypsinereactie door toevoeging van 1 ml medium met 10% foetaal kalfsserum. Centrifugeer het netvlies om alle trypsine te verwijderen. Was de cellen twee of drie keer met medium dat 10% FCS bevat.Voeg vervolgens 2 ml medium per netvlies toe en dissociëer het voorzichtig mechanisch. Verdun de cellen zodat je ze goed kunt tellen met een hemocytometer. Gebruik 15 mm coverslips beschermd met poly-L-lysine en laminine om de hechting van de cel te bevorderen.Pipetteer 50 L van uw verdunde cellen op elke coverslip. Incubateer de cellen bij 37 C in 5% CO2-atmosfeer. En koel ze om het glas te bevestigen.Dit duurt ongeveer één tot twee uur. Voeg 1 ml medium toe en breng het terug naar de incubator tot de dag van het experiment. Vervang indien nodig de helft van het medium om de twee tot drie dagen.Reconstitueer een injectieflacon van 50 g Fura-2 AM met 50 L DMSO. Krebs-oplossing is een goede optie om cellen over te dragen tijdens het experiment, omdat het de fluorescentiemeting niet verstoort. Verwarm de oplossing voor op 37 voordat u begint.Voeg Poloxamer 407 toe. Voeg Fura-2 AM en DMSO toe. Soniceer het gedurende zeven minuten in een waterbad.Bereid een 6-well plaat toe door Krebs-oplossing toe te voegen aan drie putten en de werkende Fura-2-oplossing op een andere. Was de coverslip bevat uw cellen drie keer voordat u ze goed aan de Fura-2 toevoegt. Incubeer de cellen bij 37 C en 5% CO2-atmosfeer gedurende 30 minuten in een donkere incubator.Was het na incubatie nog drie keer. Breng het over naar een andere ontvanger met Krebs en bescherm het tegen het licht. Het is mogelijk om de voorbereide Fura-2 te hergebruiken om meer coverslips met cellen te incuberen.Voeg voor elke run silicium toe aan de afdekplaatsteun en -kamer om lekkage van de oplossing te voorkomen. Haal de hoeslip uit de Krebs-oplossing en was de bodem voorzichtig met gedestilleerd water om zoutkristallisatie op de microscooplens te voorkomen. Leg de coverslip op de steun en druk voorzichtig op de randen.Bevestig de coverslip-ondersteuning en -kamer aan de microscoop en begin de cellen te doordrenken met Krebs-oplossing. Selecteer de juiste cellen en kies een goed veld. Bepaal handmatig de gebieden van belang door cellichamen te selecteren op basis van hun verschillende morfologie.De variaties van de calciumconcentratie werden geëvalueerd door de verhouding van de uitgestoten fluorescentie bij 510 nm na alternatieve excitatie bij 340 en 380 nm te kwantificeren. Na het toevoegen van kaliumchloride is het mogelijk om veel cellen te zien gloeien en de fluorescentierespons op de grafiek te zien stijgen. Kaliumchloride opent spanningsafhankelijke calciumkanalen, presenteert zich voornamelijk in neuronen.Elke afzonderlijke lijn in de grafiek vertegenwoordigt het unieke interessegebied. Daarom is het mogelijk om individuele celreacties tijdens het experiment te volgen. ATP-stimuli openen de P2X7-receptor, in wezen uitgedrukt door gliacellen.Dit is een verrijkte neuroncultuur. Daarom zijn er hier weinig gliacellen. Dit is de reden waarom zo weinig cellen reageren op de ATP-stimuli.Verworven waarden werden verwerkt met behulp van de Metafluor-software. Experimentele resultaten worden uitgedrukt in een Excel-tabel, waarbij elke rij een afzonderlijke cel vertegenwoordigt en elke regel een tijdspunt. Met behulp van Excel-software is het mogelijk om calciumvariaties van individuele cellen afzonderlijk of van allemaal in dezelfde grafiek te plotten.Om de hoeveelheid reactieve cellen op een stimulus te kwantificeren, stelt u een cutoff in van 30% die de calciumbasislijnniveaus verhoogt. Hier gebruiken we netvliescellen in kweek van embryonale dag 8-kuikens om te onderzoeken hoe neuronen en glia signaleren in termen van calciumverschuivingen, na ontvangst van 50 mm kaliumchloride en 1 mm ATP-stimuli. In elk experiment werden ongeveer 100 cellen gemakkelijk geanalyseerd.Figuur A vertegenwoordigt een gemengde cultuur met zowel neuronen als glia, die gedurende een week werd gehandhaafd. Wanneer we de reacties kwantificeren, is het mogelijk om te zien dat ongeveer de helft van de geanalyseerde cellen kaliumchloride beantwoordt en de andere helft reageerde op ATP. Figuur B verwijst naar een met neuronen verrijkte cultuur.Het werd slechts drie dagen geïncubeerd, daarom hebben de meeste gliacellen nog niet gedifferentieerd. In dit geval beantwoordt 89% van de cellen kaliumchloride, waardoor de prevalentie van neuronen wordt versterkt. Figuur C toont een gezuiverde gliacultuur.Deze cellen werden gedurende 10 dagen onderhouden met gemiddelde veranderingen om de drie dagen. Na die tijd sterft het meeste neuron, waardoor alleen glia overblijven. Inderdaad, deze cultuur werd uitsluitend geactiveerd door ATP.Deze methodologie is breed gebruikt vanwege de universele eigenschappen van calcium als tweede boodschapper. De fenotypische analyse kan worden verbeterd door deze methodologie aan te vullen met immunochemie van vaste cellen na calciumbeeldvorming. Dit protocol kan ook worden aangepast aan andere gemengde celsystemen die andere calciumkanalen tot expressie brengen.De belangrijke tip is om selectieve reacties van verschillende soorten cellen te vinden die gecorreleerd zijn met hun fenotypische expressie.

visualizing-shifts-on-neuron-glia-circuit-with-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Spontane activiteit van de ontwikkeling van neuronale netwerken kan worden gemeten met behulp van AM-ester vormen van calcium-gevoelige indicator kleurstoffen. Veranderingen in de intracellulaire calcium, met vermelding van neuronale activatie, worden gedetecteerd als voorbijgaande veranderingen in de indicator fluorescentie met een-of twee-foton beeldvorming. Dit protocol kan worden aangepast voor een bereik van hun ontwikkeling afhankelijk van neuronale...

Functionele Beeldvorming Calcium in ontwikkelingslanden Cortical Networks

Werkwijze voor subventriculaire zone (SVZ) cellen geladen met calcium indicator kleurstoffen voor opname calcium activiteit beschreven. De postnatale SVZ bevat dicht opeengepakte cellen met inbegrip van neurale progenitor cellen en neuroblasten. Plaats van bad loading injecteerden we de kleurstof door druk in het weefsel voor een beter kleurstofdiffusieoverdracht.

Voorbereiding van Acute subventriculaire zone Schijfjes voor Calcium Imaging

In dit protocol, updaten we de recente vooruitgang in de beeldvorming...

Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices

Deze video introduceert de concepten achter calciumbeeldvorming en bevat een voorbeeldprotocol voor time-lapse beeldvorming van wormen in gegoten agaroseputten.

Calcium imaging: een methode om neurale activiteit in levende C. elegans te visualiseren

Source: Bancroft, E. A., et al. Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons. J. Vis. Exp. (2020) This video demonstrates the real-time visualization of calcium influx in ventral midbrain neurons derived from mouse embryos. Using a viral vector to express a calcium indicator, the neurons are imaged under a confocal microscope to track changes in fluorescence intensity during spontaneous and neurotransmitter-induced calcium activity.

Visualization of Calcium Influx in Ventral Midbrain Neurons Derived from Mouse Embryos

We beschrijven een experimentele procedure voor het meten van neuronale activiteit door dual optische ramen boven bilaterale primaire somatosensorische corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene muizen met behulp van 2-foton (2 P) microscopie in vivo.

Imaging neurale activiteit in de primaire somatosensorische Cortex met behulp van Thy1-GCaMP6s transgene muizen

Presenteren we een methode geheel-cel patch-clamp opnamen en twee-foton imaging om vast te leggen van Ca2 + transiënten in neuronale dendrites in acute hersenen segmenten combineren.

Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Netvliesprothesen hebben het vermogen om visuele waarnemingen te genereren. Om de ontwikkeling van nieuwe prothesen te bevorderen, zijn ex vivo-methoden nodig om apparaten te testen voordat ze worden geïmplanteerd. Dit artikel biedt een uitgebreid protocol voor het bestuderen van calciumactiviteit in de retinale ganglioncellaag bij blootstelling aan elektrische stimulatie.

Calciumbeeldvorming in elektrisch gestimuleerde plat gemonteerde netvliezen

Leer calciumbeeldvorming om neuron- en glia-reacties te onderscheiden in kippenretina-culturen met Fura-2 AM. Deze methode volgt calciumdynamiek na stimulatie met kaliumchloride en ATP.

Verschuivingen op neuron-glia-circuit visualiseren met de calciumbeeldvormingstechniek

Meer video's verkennen