Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
שיטת צביעה כפולה לזיהוי פקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות
Chapters
Summary February 4th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
פרוטוקול זה מתאר שיטה מיקרוסקופית לזיהוי פקטין באינטראקציה בין פטריית קפה.
Transcript
פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר לזהות את האינטראקציה בין הצמח לפטריה. בנוסף לצביעת הפקטין, הוא גם מדגים פגמים בפולימר דופן תא הפתוגן ומאפשר זיהוי של מבני פטריות. טכניקה פשוטה ולא מסובכת זו יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ אור והיא אינה דורשת ציוד יקר כגון מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
בנוסף, זוהי טכניקה מהירה המקבלת הבחנה מצוינת של מבני צמחים למחקרים היסטופתולוגיים. הטכניקה מזהה את האינטראקציה בין צמח לפטריה. לפיכך, הוא משתף פעולה כדי לאבחן את המחלות הנגרמות על ידי פטריות ביוטרופיות ונקרוטרופיות כגון חלודה קפה וסרקוספוריוזיס.
כדי להתחיל, לקצור כ 10 מילימטר מרובע עלה דגימה באזור האמצעי של הנגע באמצעות אזמל פינצטה, ולטבול אותו 30 מיליליטר של תמיסה מקבעת Karnovsky. הכפיפו את דגימת העלה לוואקום נמוך של 500 עד 600 מילבר למשך 15 דקות באמצעות משאבת שמן, לפחות פי ארבעה כדי להגדיל את החדירות של התמיסה המקבעת ברקמת העלה. לאחר הקיבוע, שטפו את דגימת העלים שלוש פעמים ב-0.5 מ' חיץ קקודילט מדולל במים מזוקקים במשך חמש דקות כל אחת, ולאחר מכן העבירו אותה לסדרה אתנולית מדורגת למשך 15 דקות בכל ריכוז אתנול.
כדי להעביר בהדרגה את הדגימות לגליקול מתקרילט, צרו את תמיסה A על ידי ערבוב גרם אחד של אבקת גליקול מתקרילט עם 100 מיליליטרים של שרף בסיסי תחת תסיסה מגנטית. לאחר מכן, טבלו את הדגימות ביחס אחד עד שניים של פתרון A ו-100% אתנול למשך שלוש שעות. טבלו את הדגימות ביחס אחד לאחד עבור פתרון A:100%אתנול למשך שלוש שעות, ולאחר מכן שקעו בשרף בסיסי טהור למשך יומיים עד ארבעה ימים.
הכפיפו את הדגימה לשואב ואקום נמוך לפחות ארבע פעמים ביום למשך 15 דקות, ולאחר מכן סיבוב. יש לערבב 15 מיליליטרים של תמיסה A עם מיליליטר אחד של המתקשה בכוס עם סיבוב במשך שתי דקות כדי לייצר את פתרון הפילמור B.Put 1.2 מיליליטרים של פתרון פילמור זה B בתבניות פלסטיק. באמצעות פיק עץ, העבירו את דגימות העלים הנגעים משרף בסיסי טהור לפתרון B והימנעו משימוש בפינצטה מכיוון שהן עלולות לגרום לריסוק רקמות.
הקפידו לכוון במהירות דגימות עלים בניצב לתבניות הפלסטיק מכיוון שפתרון B הופך במהירות לצמיג. כאשר הכיוון הניצב של דגימות העלים מושג, יש להמתין 30 דקות ולאחר מכן להעביר את תבנית הפלסטיק לתא פלסטיק או זכוכית המכיל ג'ל סיליקה כדי למנוע לחות. לאחר שהשרף ודגימת העלים עוברים פולימר לאחר שעתיים עד שלוש שעות, נתקו את הגוש שנוצר מתבנית הפלסטיק על ידי שיוף בסיס הבלוק בקובץ שיוף.
לאחר מכן, הדביקו את הבלוק לחתיכת עץ. חותכים את הבלוק לחמישה חלקים בעובי מיקרומטר באמצעות מיקרוטום מסתובב המצויד בלהבי פלדה בקוטר שמונה סנטימטרים. הניחו את החלקים על מגלשות זכוכית מכוסות במים מזוקקים.
לאחר מכן, העבירו את המגלשות לצלחת חמה כדי להתייבש בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס וקדמו את ההדבקה של החלקים לשקופיות הזכוכית. לאחר הייבוש, סמן את שקופיות הזכוכית בשם הפניה לבלוק ובמספר השקופית. מכסים את החלקים בשני מיליליטרים של 5% כותנה כחולה בלקטופנול ומחממים אותם על צלחת חמה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
מסירים את הצבע העודף על ידי שטיפת המגלשה שלוש פעמים בכוס מלאה במים מזוקקים. הכתימו אותו בשני מיליליטרים של 0.01%רותניום אדום במים למשך דקה אחת. מסירים את הצבע העודף על ידי שטיפת המגלשה שלוש פעמים בכוס מלאה במים מזוקקים.
הניחו טיפת מים מזוקקים על החלקים וכיסו את החלקים בהחלקת כיסוי לביצוע ניתוח מיקרוסקופיה קלה. בשיטת ההכתמה הכפולה, Hemileia vastatrix hyphae המכילה את דפנות התאים ואת תכולת הפרוטופלסטים הצפופים נראתה כחולה כהה הן בפרנכימה ספוגית והן בפרנכימה פליסיידית. תא האם של האוסטוריום וההאוזטוריה הפגינו גם הם בצבע כחול כהה.
הכתם הנגדי באדום רותניום הגדיר בבירור את ההתפלגות הפטרייתית בחללים הבין-תאיים. במהלך האינטראקציה, תא האם של Hemileia vastatrix haustorium שבר את דופן התא המארח ופיתח צוואר האוסטוריאלי מוקף בתרכובות פקטיות. אנקפסולציה עשירה בפקטין בצבע ורוד-אדום של הצוואר ההוסטוריאלי אינה יכולה למנוע היווצרות האוסטוריאלית.
במקרים מסוימים, האנקפסולציה העשירה בפקטין עטפה את האוסטוריום באופן חלקי. ובמקרים מסוימים, האוסטוריום עטוף במלואו. דופן התא העשירה בפקטין שומרת על שלמות גבול הנגע, שם הפטרייה אינה נוכחת.
שיטת ההכתמה הכפולה הדגימה את נוכחותם של תפרים בין-תאיים. באזורי אינטראקציה, נראה כי דפנות תאי פקטין איבדו את שלמותם עקב פירוק. מבני רבייה כגון קונידיה נמצאו באפידרמיס הא-אקסיאלי.
Cercospora coffeicola hyphae נמצאו בתא התת-סטומי כמבנים מסתלסלים, ונראה כי הפרנכימה הפליסיידית באזור הנגע עוברת ליזיס של דופן התא. הימנע משימוש בפינצטה מכיוון שהם עלולים לגרום לריסוק רקמות. מחקרים היסטופתולוגיים נוספים על חלודה, אנתרקנוז, סרקוספוריוזיס, סמוטציות ואינטראקציות ביוטרופיות, המיביוטרופיות ונקרוטרופיות אחרות בין צמחים לפטריות צריכים להתבצע כדי לחקור את השימוש הפוטנציאלי בטכניקה זו במערכות פאתוסיסטיות שונות.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
