Name: Saccharina latissima Embriyosunda Hedefe Yönelik Lazer Ablasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Öğrenin, Saccharina latissima embriyolarında lazer ablasyonu yöntemiyle hücre kaderini ve embriyogenez sırasındaki etkileşimleri nasıl araştırabilirsiniz. Bu hassas teknik, kahverengi alglerde gelişim biyolojisi çalışmaları için güvenilir bir temel sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SB'nin doktora hibesi, Bretagne Bölgesi (ARED hibe numarası COH20020) ve Sorbonne Université tarafından finanse edilmektedir. I.T.is doktora hibesi, Bretagne Bölgesi (ARED hibe numarası COH18020) ve Norvegian NMBU Üniversitesi tarafından finanse edilmektedir. Bu proje, MITI disiplinlerarası programları aracılığıyla CNRS'den finansal destek almıştır. MRic, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR-10-INBS-04) tarafından desteklenen ulusal altyapı France-BioImaging üyesidir.

1. Saccharina latissima gametophytes üretimi
<ol><li>S. latissima'nın olgun sporofitlerini daha önce tarif edildiği gibi vahşi doğadan toplayın20,21. Seçilen sporofitlerin epifitlerden (bıçağın yüzeyinde görülebilen küçük organizmalar) veya iç parazitlerden (ağartılmış alanlarda veya bıçaktaki lekelerde bulunur) bulunmadığından emin olun. 
</li>
	<li>Bir neşter kullanarak, bıçağın ortasındaki en koyu kısmı (verimli spor üreten doku22) 1-5 kare parçaya (1 cm²) kesin, varsa ağartılmış lekelerden kaçının.</li>
	<li>Kesilen parçaları bir neşterin arkası ve biraz emici kağıtla nazikçe temizleyerek kalan epifitleri çıkarın.</li>
	<li>Temizlenmiş parçaları, daha önce yayınlanan rapor22'yi takiben sporları serbest bırakmak için steril doğal deniz suyuyla dolu bir cam kaba (bakınız Malzeme Tablosu) 45 dakika boyunca yerleştirin.</li>
	<li>Bıçak parçalarını çıkarın ve kalıntıları veya istenmeyen organizmaları temizlemek için deniz suyunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>Filtrat içindeki sporları plastik Petri kaplarında 20-40 spor / mL konsantrasyonuna kadar seyreltin22.</li>
	<li>Spor çözeltisini, optimum kültür koşullarıyla (13 °C, 24 μE.m-2.s-1, fotoperiyot 16:8 L:D) yapılandırılmış bir kültür kabinine (bkz. Malzeme Tablosu) yerleştirin.</li>
	<li>Sporların çimlenmesine ve gametofitlere dönüşmesine izin verin. NOT: Spor çimlenmesi kabinde 2 gün sonra görülebilir ve gametofitik hücrelerin ilk hücre bölünmesi genellikle takip eden 48 saat içinde gerçekleşir.</li>
	<li>5 gün sonra büyüme ortamını, 0,5x Provasoli çözeltisi (NSW1/2) ile zenginleştirilmiş mikro filtrelenmiş doğal deniz suyuyla değiştirin (bkz. NOT: Bu adımların tekrarlanmasını önlemek için, belirli erkek ve dişi gametofitler seçilebilir ve birkaç ay boyunca vejetatif olarak çoğaltılabilir. Gametofitler, yukarıda açıklanan aynı kültür koşullarında kırmızı ışık altında (en az 580 nm dalga boyuna sahip 4 μE.m-2.s-1)23 yetiştirildiğinde vejetatif kalır (adım 1.7).</li>
</ol>2. Oogenezin parçalanması ve indüksiyonu
<ol><li>Gametofitleri bir hücre kazıyıcı ile hasat edin.</li>
	<li>Küçük bir plastik havane kullanarak, toplanan gametofitleri 1.5 mL'lik bir tüpte 4-5 hücreli parçalara ayırın.</li>
	<li>Tüpü 1 mL NSW1/2 ile doldurun (adım 1.9).</li>
	<li>1x Provasoli çözeltisi (NSW) ile zenginleştirilmiş 3 mL doğal deniz suyuna 2,5 μL ezilmiş gametofit çözeltisi ekleyin ve bir Petri kabına yerleştirin. NOT: Daha kolay kullanım için 25 mm, cam tabanlı Petri kabı önerilir.</li>
	<li>Hazırlanan yemekleri bir kültür dolabına yerleştirin ve 24 μE.m-2.s-1 (loş ışık, fotoperiyot 16:8 L:D) şiddetinde beyaz ışık altında 13 °C'de gametogenezi indükleyin. NOT: İlk gametangia (dişi oogonia ve erkek arkegoni) 5 gün sonra gözlemlenebilir. Erkek küçük hücrelerle hiper-dallıdır ve dişi uzun filamentler oluşturan daha büyük hücrelerden oluşur15,22. İlk yumurtalar ~ 10 gün sonra gözlenir ve zigotların ilk bölünmesi genellikle takip eden 2 gün içinde gerçekleşir.</li>
	<li>İlk yumurtaları gözlemledikten altı gün sonra, bulaşıkları daha parlak beyaz ışık koşullarına aktarın: 50 μE.m-2.s-1, fotoperiyot 16: 8 L: D, hala 13 ° C'de.</li>
</ol>3. Ablasyon için embriyo seçimi ve sonraki büyümenin izlenmesi için görüntü elde etme
<ol><li>Ablasyon adımı sırasında seçilen embriyoları (yeniden) bulmak için tüm Petri kabını görüntüleyin (çanağı oküler mikroskopa geri döndürmeye gerek yoktur) ve seçilen embriyoların sonraki gelişimini izleyin. NOT: Görüntüleme için ters çevrilmiş lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın ( bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1) ve lazer ablasyonu adım 5'te açıklanmıştır.</li>
	<li>Petri kabını sahneye yerleştirin ve görsel bir işaretle yönlendirin (örneğin; kalıcı bir işaretleyici ile bir çizgi çizin).</li>
	<li>Bir embriyoya odaklanmak için 10x/0.45 hedefini kullanın. Petri kabının dört kardinal noktasının konumunu kaydedin.</li>
	<li>Kutucuk taramasını başlatın. Tüm Petri kabının iletimli/floresan görüntülerini düşük çözünürlükte elde edin: 256 x 256 piksel, çift yönlü tarama ile 1,54 μs piksel bekleme süresi ve %1,2 iletimde 561 nm lazer kullanarak 0,6x dijital yakınlaştırma. NOT: 2,5 cm'lik bir Petri kabının tamamı için tarama süresi 225 karo için ~6 dakikadır (Şekil 2). Burada, iletim ve floresan görüntüleme için 561 nm lazer kullanıldı. Floresan sinyali, konfokal fotoçarpanlar (PMT) üzerinde 580-720 nm arasında toplandı ve iletilen ışık, iletilen PMT üzerinde toplandı. 561 nm lazer bu adımda klorofili de izleyebilir, ancak gereksizdir çünkü sadece sinyal gürültüsünü ve organizmaları doğru bir şekilde ayırt etmeye yardımcı olur.</li>
	<li>Kutucuk tarama görüntüsünü kaydedin ve görüntü alma yazılımı penceresinde açık tutun (bkz.</li>
	<li>Hedefi değiştirin, Petri kabını çıkarmayın. NOT: 40x/1.2 su hedefi, Petri kabını ilk konumundan hareket ettirmeden hedefe daldırma ortamının (su) eklenebilmesi için sahnenin yan tarafına taşındı.</li>
	<li>Uygun embriyoyu seçmek için daha önce edinilen karo tarama görüntüsünde gezinin. Bu görüntüde bir embriyo tanımlandıktan sonra, sahneyi embriyonun tam konumuna getirin ve bu embriyonun iletilmiş / floresan görüntülerini yüksek çözünürlükte elde edin. NOT: Yüksek çözünürlüklü ayarlar: 512 x 512 piksel, 0,130 μm/piksel, tek yönlü tarama ile 0,208 μs piksel bekleme süresi ve %0,9 iletimde 561 nm lazer kullanarak 2x dijital yakınlaştırma.</li>
	<li>Lazer ablasyon için her embriyo adayı için karo tarama görüntüsüne açıklama ekleyin (Şekil 2B) ve lazer ablasyon adımına geçin.</li>
</ol>4. Lazer kalibrasyonu
<ol><li>Lazeri kalibre edin ve görüntü alma yazılımını "Click & Fire modu" ndaki lazer sürücüsü yazılımı ve darbeli 355 nm lazer ile senkronize edin. NOT: Bu adım, fare imlecinin lazer sürücüsü yazılımındaki konumu ( bkz. Malzeme Tablosu) ile edinme yazılımının canlı görüntüsündeki konumu arasında mükemmel senkronizasyon sağlamak için çok önemlidir.</li>
	<li>Lazer sürücüsü yazılım paketini açın ve görüntü alma yazılım paketinde Canlı'ya tıklayın.</li>
	<li>Lazer sürücüsü yazılım paketinde Edinmeyi başlat'a tıklayarak her iki yazılım paketini de senkronize edin. Canlı görüntü artık UV lazer sürücüsü yazılımına da kaydedilmektedir.</li>
	<li>AOI Seç düğmesine tıklayarak ve UV lazer sürücüsü yazılım paketindeki görüntünün kenarlarına (sağ, sol, üst ve alt) tıklayarak bir ilgi alanı (AOI) tanımlayın. NOT: Bu kalibrasyon adımından sonra, edinme yazılım paketindeki piksel boyutu, görüntü formatı ve yakınlaştırma ayarları sabit kalmalıdır.</li>
	<li>Çanak üzerinde boş bir alan seçin ve cam tabana odaklanmak için sahne alanının seviyesini numune odak düzleminin 20 μm altına indirin.</li>
	<li>Kalibrasyonu başlat'a tıklayarak ablasyon lazerini ve görüntüleme lazer yörüngelerini ayarlayın ve Manuel kalibrasyon'u seçin.</li>
	<li>Canlı görüntünün ortasında, cam kapak kapağındaki deliğe karşılık gelen siyah bir nokta görecek kadar yüksek bir lazer gücü seçin (tüm deklanşörler açık olmalıdır).</li>
	<li>Fare imleci ile bu merkezi siyah noktaya tıklayın ve hizalama prosedürünü tamamlamak için yazılım tarafından önerilen 18 ek noktaya tıklayın.</li>
	<li>Aynı kapak kapağındaki "Click & Fire modu"ndaki kalibrasyonu kontrol edin. NOT: Lazer kalibrasyonu görüntüleme parametrelerine bağlıdır. Lazer kalibre edildikten sonra, görüntüleme parametrelerinin (yani, 512 x 512 piksel, 0,130 μm / piksel, tek yönlü tarama ve 2x dijital yakınlaştırma ile 0,208 μs piksel bekleme süresi) değişmediğinden emin olun.</li>
</ol>5. Lazer ablasyon
<ol><li>İlgilendiğiniz bir embriyoyu seçin. Görüntü alma yazılımında hızlandırılmış bir kayıt başlatın.</li>
	<li>Yüksek çözünürlükte 40x/1,2 W objektifle iletilmiş/floresan görüntüler elde edin (yani, 512 x 512 piksel, 0,130 μm/piksel, mono-yönlü tarama ile 1,54 μs piksel bekleme süresi ve %0,9 iletimde 561 nm lazer kullanarak 2x dijital yakınlaştırma). Hızlandırılmış kaydı maksimum hızda alın.</li>
	<li>Hızlandırılmış kaydın başlangıcında alanı uzaklaştırın. AOI'yi yakınlaştırın.</li>
	<li>Embriyodaki ilgili hücreye zararlı ışınlamayı uygulamak için lazer sürücüsü yazılımının "Click & Fire" işlevini kullanın. Aşağıdaki parametreleri kullanın:% 45 lazer iletimi (maksimum 40 μW'ye karşılık gelir) ve 1 ms darbe süresi (adım 4). NOT: Lazer çekimi sırasında video kaydı önerilir.</li>
	<li>688 nm altında, otofloresan kloroplastların sitoplazmadan atılmasını izleyin.</li>
	<li>Hücre içeriği hücrede kalırsa, hücredeki ihlalin boyutunu artırmak için "Click & Fire" işlevini bir kez daha kullanın. Hücre içeriğinin çoğu serbest bırakılana kadar çekim sayısını minimumda tutarak tekrarlayın.</li>
	<li>Embriyo stabilize olduktan sonra hızlandırılmış kaydı durdurun (yani, başka hücre içi hareket tespit edilemez (~ 1-5 dakika).</li>
	<li>Gerekirse kutucuk tarama görüntüsündeki ek açıklamayı güncelleyin.</li>
</ol>6. Işınlanmış embriyoların büyümesinin izlenmesi
NOT: İzleme birkaç gün boyunca gerçekleştirilir.
<ol><li>Lazer ablasyondan sonra gelişen embriyo sayısını izleyerek hayatta kalma oranını belirleyin ve bunları ölenlerle karşılaştırın. NOT: Bazı embriyolar ablasyondan hemen sonra çeşitli nedenlerle ölür. Yüksek ve hızlı bir ölüm oranı genellikle uygun olmayan lazer parametrelerinin veya deney veya sonraki taşıma sırasında strese daha yüksek / daha uzun süre maruz kalmanın bir işaretidir.</li>
	<li>Her gün lazerle vurulan embriyoların uzunluğunu ölçerek ve bozulmamış embriyolarla karşılaştırarak büyüme gecikmesini belirleyin. NOT: Lazerle vurulmuş organizmaların büyüme hızı genellikle tedavi edilmemiş organizmalarınkinden daha yavaştır. Bununla birlikte, bazı (uygunsuz) lazer ayarları bir haftadan fazla büyümeyi engelleyebilir ve bundan sonra büyüme devam eder.</li>
	<li>Ablatlanmış hücrelere bitişik hücrelerin reaksiyonunu izleyerek bitişik hasarı bulun. Bazı durumlarda, patlama sonrası basınçsızlaştırma komşu hücrelerin patlamasına neden olabilir.</li>
	<li>Mikrop kontaminasyonlarını kontrol edin. Ortamdaki mikroalglerin ve bakterilerin büyümesini izleyin. Çanakta alışılmadık bir mikrop seviyesi varsa, atın ve protokolü adım 2 veya adım 3'ten tekrarlayın. NOT: Lazer ablasyondan sonra, hasarlı S. latissima embriyoları zaten oldukça streslidir ve ek dış stres mortalitenin artmasına neden olabilir. Bakteriyel veya viral salgınlar mümkündür, çünkü tedavi edilen embriyolar aksenik koşullarda büyüyemez.</li>
	<li>Fenotipi inceleyerek ve hedeflenen bölgenin gelişimindeki rolünü anlayarak atış organizmalarının küresel gelişimini kontrol edin.</li>
</ol>

<ol><li>Montell, D. J., Keshishian, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+studies+of+the+role+of+the+Drosophila+oocyte+nucleus+in+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser ablation studies of the role of the Drosophila oocyte nucleus in pattern formation.</a> Science. 254 (5029), New York, N.Y. 290-293 (1991).</li>
<li>Shivakumar, P. C., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+to+probe+the+epithelial+mechanics+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser ablation to probe the epithelial mechanics in drosophila.</a> Methods In Molecular Biology. 1478, 241-251 (2016).</li>
<li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22%5BJournal%5D)">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans.</a> Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 225-250 (1995).</li>
<li>Fouad, A. D., Liu, A., Du, A., Bhirgoo, P. D., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+laser+ablation+with+tunable+lesion+size+reveals+multiple+origins+of+seizure-like+convulsions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Thermal laser ablation with tunable lesion size reveals multiple origins of seizure-like convulsions in Caenorhabditis elegans.</a> Scientific Reports. 11 (1), 5084(2021).</li>
<li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2845(2011).</li>
<li>Mondia, J. P., Adams, D. S., Orendorff, R. D., Levin, M., Omenetto, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+femtosecond-laser+ablation+of+Xenopus+laevis+melanocytes+for+studies+of+cell+migration%2C+wound+repair%2C+and+developmental+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Patterned femtosecond-laser ablation of Xenopus laevis melanocytes for studies of cell migration, wound repair, and developmental processes.</a> Biomedical Optics Express. 2 (8), 2383-2391 (2011).</li>
<li>Reinhardt, D., Frenz, M., Mandel, T., Kuhlemeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsurgical+and+laser+ablation+analysis+of+leaf+positioning+and+dorsoventral+patterning+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microsurgical and laser ablation analysis of leaf positioning and dorsoventral patterning in tomato.</a> Development. 132 (1), 15-26 (2005).</li>
<li>Berg, C., Hage, W., Weisbeek, P., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+in+Arabidopsis+roots%3A+a+tool+to+study+cell-to-cell+communication.+Cellular+integration+of+signalling+pathways+in+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+NATO+Advanced+Study+Institute%22%5BJournal%5D)">Laser ablation in Arabidopsis roots: a tool to study cell-to-cell communication. Cellular integration of signalling pathways in plant development.</a> Proceedings of the NATO Advanced Study Institute. , https://eurekamag.com/research/003/488/003488317.php 237-250 (1998).</li>
<li>Berger, F., Taylor, A., Brownlee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+determination+by+the+cell+wall+in+early+fucus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell fate determination by the cell wall in early fucus development.</a> Science. 263 (5152), New York, N.Y. 1421-1423 (1994).</li>
<li>Bouget, F. Y., Berger, F., Brownlee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+dependent+control+of+cell+fate+in+the+Fucus+embryo%3A+role+of+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Position dependent control of cell fate in the Fucus embryo: role of intercellular communication.</a> Development. 125 (11), 1999-2008 (1998).</li>
<li>Bringloe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+and+evolution+of+the+brown+algae%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phylogeny and evolution of the brown algae.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 39 (4), 281-321 (2020).</li>
<li>Saifullah, S., Olsen, Y., Surilayani, D., Handå, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+of+the+brown+seaweed%2C+saccharina+latissima%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Joint+proceedings+of+the+2nd+and+the+3rd+International+Conference+on+Food+Security+Innovation+%28ICFSI+2018-2019%29%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate of the brown seaweed, saccharina latissima: a review.</a> Joint proceedings of the 2nd and the 3rd International Conference on Food Security Innovation (ICFSI 2018-2019). , 180-182 (2021).</li>
<li>Zhang, X., Thomsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techno-economic+and+environmental+assessment+of+novel+biorefinery+designs+for+sequential+extraction+of+high-value+biomolecules+from+brown+macroalgae+Laminaria+digitata%2C+Fucus+vesiculosus%2C+and+Saccharina+latissima%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Research%22%5BJournal%5D)">Techno-economic and environmental assessment of novel biorefinery designs for sequential extraction of high-value biomolecules from brown macroalgae Laminaria digitata, Fucus vesiculosus, and Saccharina latissima.</a> Algal Research. 60, 102499(2021).</li>
<li>Kanda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+gametophytes+of+some+japanese+species+of+laminariales%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+papers+of+the+Institute+of+Algological+Research%2C+Faculty+of+Science%22%5BJournal%5D)">On the gametophytes of some japanese species of laminariales.</a> Scientific papers of the Institute of Algological Research, Faculty of Science. 1 (2), Hokkaido Imperial University. 221-260 (1936).</li>
<li>Fritsch, F. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFritsch%2C+FE+%22The+structure+and+reproduction+of+the+algae.+Volume+2%22">The structure and reproduction of the algae. Volume 2</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1945).</li>
<li>Bartsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genus+Laminaria+sensu+lato+%3A+recent+insights+and+developments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Phycology%22%5BJournal%5D)">The genus Laminaria sensu lato : recent insights and developments.</a> European Journal of Phycology. 43 (1), 1-86 (2008).</li>
<li>Theodorou, I., Charrier, B. Chapter 2: Brown algae: ectocarpus and saccharina as experimental models for developmental biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheodorou%2C+I+%22Handbook+of+Marine+Model+Organisms+in+Experimental+Biology+-+Established+and+Emerging%22">Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology - Established and Emerging</a>. Boutet, A., Schierwater, B. , Francis & Taylor Group, CRC Press. ISBN 9780367444471 485(2021).</li>
<li>Drew, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reproduction+and+early+development+of+laminaria+digitata+and+laminaria+saccharina%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">The reproduction and early development of laminaria digitata and laminaria saccharina.</a> Annals of Botany. 24 (1), 177-189 (1910).</li>
<li>Yendo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+costaria%2C+undaria%2C+and+laminaria%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">The development of costaria, undaria, and laminaria.</a> Annals of Botany. 25 (99), 691-715 (1911).</li>
<li>Forbord, S., Steinhovden, K., Rød, K., Handå, A., Skjermo, J. Cultivation protocol for Saccharina latissima. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForbord%2C+S+%22Protocols+for+Macroalgae+Research%22">Protocols for Macroalgae Research</a>. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 14986427. ISBN-13: 978-1498796422 37-59 (2018).</li>
<li>Bartsch, I. Derivation of clonal stock cultures and hybridization of kelps. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBartsch%2C+I+%22Protocols+for+Macroalgae+Research%22">Protocols for Macroalgae Research</a>. Charrier, B., Wichard, T., Reddy, C. R. K. , CRC Press, Francis & Taylor Group. ISBN-10: 149879627. ISBN-13: 978-1498796422 61-78 (2018).</li>
<li>Theodorou, I., Opsahl-Sorteberg, H. -G., Charrier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+zygotes+and+embryos+of+the+kelp+saccharina+latissima+for+cell+biology+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of zygotes and embryos of the kelp saccharina latissima for cell biology approaches.</a> Bio-protocol. 101, 4132(2021).</li>
<li>Lüning, K., Dring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproduction+induced+by+blue+light+in+female+gametophytes+of+Laminaria+saccharina%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Reproduction induced by blue light in female gametophytes of Laminaria saccharina.</a> Planta. 104 (3), 252-256 (1972).</li>
<li>de Medeiros, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+manipulation+with+ultrashort+infrared+laser+pulses+in+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue manipulation with ultrashort infrared laser pulses in light-sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1942(2020).</li>
<li>Liang, X., Michael, M., Gomez, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mechanical+tension+at+cell-cell+junctions+using+two-photon+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Measurement of mechanical tension at cell-cell junctions using two-photon laser ablation.</a> Bio-protocol. 6 (24), 2068(2016).</li>
<li>Ebbing, A., Pierik, R., Bouma, T., Kromkamp, J. C., Timmermans, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+light+and+biomass+density+influence+the+reproduction+of+delayed+Saccharina+latissima+gametophytes+%28Phaeophyceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phycology%22%5BJournal%5D)">How light and biomass density influence the reproduction of delayed Saccharina latissima gametophytes (Phaeophyceae).</a> Journal of Phycology. 56 (3), 709-718 (2020).</li>
<li>Rabillé, H., Billoud, B., Tesson, B., Le Panse, S., Rolland, É, Charrier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brown+algal+mode+of+tip+growth%3A+Keeping+stress+under+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The brown algal mode of tip growth: Keeping stress under control.</a> PLoS Biology. 17 (1), 2005258(2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Lokal hücresel lazer ablasyon, yüksek hassasiyetle zamansal ve mekansal ablasyona izin verir. Bununla birlikte, etkinliği hedef hücrelerin erişilememesi nedeniyle engellenebilir; örneğin, tüm hücreler üç boyutlu bir embriyoya aittir. Bu protokol, tüm hücrelerin bir lazer ışını ile ayrı ayrı kolayca ayırt edilebileceği ve yok edilebileceği tek katmanlı bir lamina geliştiren alg Saccharina latissima'nın embriyosu üzerinde geliştirilmiştir.
Lazer gücü ve dalga boyu NI...

Lazer ablasyon, embriyo gelişimini incelemek için onlarca yıldır kullanılmaktadır. Embriyo hücrelerinin bir lazer ışını ile ışınlanması, embriyogenez sırasında rejeneratif potansiyeli ve hücre soyunun modifikasyonunu izlemeyi ve hedeflenen ablasyonun hücre bölünmesi ve hücre kaderi üzerindeki etkisini araştırmayı mümkün kılar. Lazer ablasyon yöntemlerinde kullanılan model organizmalar tipik olarak böcekler1,2, nematodlar3,4, omurgalılar5,6 ve bazen debitkiler 7,8 gibi hayvanlardır. Ek olarak, 1994 ve 1998 yıllarında kahverengi alg Fucus üzerinde bir lazer mikro-ablasyon yaklaşımı, hücre duvarının erken embriyonun fotopolarizasyonundaki rolünü göstermek için kullanılmıştır 9,10.
Kahverengi algler, 1.6 milyar yıl önce ökaryotik ağacın kökünde ayrılan Stramenopiles grubuna aittir. Sonuç olarak, hayvanlar ve bitkiler gibi diğer çok hücreli organizmalardan filogenetik olarak bağımsızdırlar11. Saccharina latissima, daha yaygın olarak yosun olarak bilinen Laminariales takımına aittir ve dünyadaki en büyük organizmalar arasındadır, 30 m'nin üzerindeki boyutlara ulaşırlar. Saccharina sp., gıda ve yem gibi birçok uygulama için kullanılan büyük bir deniz yosunudur ve polisakkaritleri dünya çapında tarım, farmakolojik ve kozmetik endüstrilerinde kullanılmak üzere ekstrakte edilir12, 13. Özellikle Asya'da ve daha yakın zamanda Avrupa'da yetiştirilmesi, yavruları açık denizde serbest bırakmadan önce kuluçkahanelerde embriyoların hazırlanmasını gerektirir. Tüm kelpler gibi, bir haploid gametofitin büyüdüğü ve döllenme için gametler ürettiği mikroskobik bir gametofitik fazdan oluşan bifazik bir yaşam döngüsüne ve büyük bir düzlemsel bıçağın deniz tabanına veya kayalara tutturulmuş tutucusundan geliştiği diploid makroskopik bir sporofitik faza sahiptir. Sporofit, olgunlukta haploid sporları serbest bırakır, böylece yaşam döngüsü14,15,16'yı tamamlar.
S. latissima bazı ilginç morfolojik özellikler sunar17. Embriyosu, farklı doku tiplerinin ortaya çıkmasıyla çakışan çok katmanlı bir yapı elde etmeden önce tek katmanlı bir düzlemsel tabaka15,18,19 olarak gelişir. Ek olarak, Laminariales, embriyoları maternal gametofitik dokularına bağlı kalan kahverengi alglerin tek taksonlarından biridir (Desmarestiales ve Sporochnales de15). Bu özellik, maternal dokunun bu gelişimsel süreçteki rolünü inceleme ve kahverengi alglerdeki maternal kontrol mekanizmalarını hayvanlardaki ve bitkilerdeki mekanizmalarla karşılaştırma fırsatı sunar.
Bu makalede, erken bir kelp embriyosunda lazer ablasyon için ilk tam protokol sunulmaktadır. UV ns-pulsed tekniğini içeren bu protokol, embriyogenez sırasında kendi rollerini incelemek için bireysel embriyo hücrelerinin spesifik yıkımına neden olur. Prosedür, Laminariales'te embriyogenez sırasında hücre etkileşimlerini ve hücre kaderini araştırmak için güvenilir bir yaklaşım sunar.

<table><tbody><tr><td>25 mm cam tabanlı petri kabı</td><td>NEST</td><td>801001</td><td></td></tr><tr><td>Otoklavlanmış deniz</td> <td>suyu-Astan</td><td></td> <td>şamandırasının yakınında açık denizde toplanır (48 derece; 44.934 N 003&deg; 57.702 W) Roscoff, Fransa'ya yakın, 20 m derinlikte.</td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı</td><td>MED 2</td><td>83.3951</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 40 & mikro; m</td><td>Corning / Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Kültür dolapları</td><td>Snijders Scientific Bitki Büyüme Kabini ECD01</td><td></td><td>Işık yoğunluğunun, fotoperiyodun ve sıcaklığın kontrol edilebilmesi koşuluyla başka herhangi bir marka uygundur.</td></tr><tr><td>LSM 880 Zeiss konfokal mikroskop</td><td>Carl Zeiss mikroskobu, Jena, Almanya</td><td></td><td>Ablasyon ve görüntüleme 40x/1.2 su objektifi kullanılarak gerçekleştirildi</td></tr><tr><td>Pelet havaneli</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947</td><td>Mavi polipropilen (otoklavlanabilir)</td></tr><tr><td>Provasoli</td> <td>takviyesi-Tarif</td><td></td> <td>burada mevcuttur: http://www.sb-roscoff.fr/sites/www.sb-roscoff.fr/files/documents/station-biologique-roscoff-preparation-du-provasoli-2040.pdf</td></tr><tr><td>Darbeli 355 lazer (UGA-42 Caliburn 355/25)</td><td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>Paramount</td><td>PDSS 11</td><td></td></tr><tr><td>SysCon yazılımı</td><td>Rapp OptoElectronic, Wedel, Almanya</td><td></td><td>Lazer sürücü yazılımı</td></tr><tr><td>ZEN yazılımı</td><td>Carl Zeiss mikroskobu, Jena, Almanya</td><td></td><td>SysCon yazılımı ile birlikte kullanılan görüntüleme yazılımı; Siyah 2.3 versiyon</td></tr></tbody></table>

saccharina latissima embriyosunda hedefe yönelik lazer ablasyonu

Targeted Laser Ablation in the Embryo of Saccharina latissima

Saccharina latissima'da embriyo, lamina veya bıçak adı verilen tek katmanlı bir hücre tabakası olarak gelişir. Her embriyo hücresinin gözlemlenmesi kolaydır, komşularından kolayca ayırt edilebilir ve ayrı ayrı hedeflenebilir. Onlarca yıldır, lazer ablasyon embriyo gelişimini incelemek için kullanılmıştır. Burada, kahverengi alg S. latissima'nın erken embriyoları için hücreye özgü lazer ablasyon için bir protokol geliştirilmiştir. Sunulan çalışma şunları içerir: (1) kültür koşulları da dahil olmak üzere kritik parametrelerin bir açıklaması ile Saccharina embriyolarının hazırlanması, (2) lazer ablasyon ayarları ve (3) ışınlanmış embriyonun sonraki büyümesinin hızlandırılmış mikroskopi kullanılarak izlenmesi. Ek olarak, embriyoların görüntüleme platformundan laboratuvara geri taşınması için en uygun koşullar hakkında ayrıntılar sağlanır ve bu da sonraki embriyo gelişimini derinden etkileyebilir. Laminariales takımına ait algler, Saccharina'ya benzer embriyogenez kalıpları gösterir; Bu protokol, bu taksondaki diğer türlere kolayca aktarılabilir.

S. latissima'nın gametofitleri yetiştirildi ve gametogenez, zigot ve embriyo üretmek için indüklendi. Gametogenezin indüksiyonundan on iki gün sonra, embriyolara lazer ablasyon uygulandı. Burada deney, S. latissima embriyolarının genel gelişiminde spesifik hücrelerin rolünü değerlendirmeyi amaçladı. En apikal hücre, en bazal hücre ve medyan hücreler hedef alındı. Karo taramasından sonra, ilgilenilen bir embriyo olan Petri kabının tamamı (Şekil 2A), lazer atışı için uygun bi...

Embriyodaki spesifik hücrelerin yok edilmesi, hücre kaderinde yer alan hücresel etkileşimleri incelemek için güçlü bir araçtır. Mevcut protokol, kahverengi alg Saccharina latissima'nın erken embriyosundaki hedeflenen hücrelerin lazer ablasyonu için teknikleri açıklamaktadır.

Saccharina latissima Embriyosunda Hedefe Yönelik Lazer Ablasyonu

In Saccharina latissima, the embryo&#160;develops as a monolayered cell sheet called the lamina or the blade. Each embryo cell is easy to observe, readily ...

Bu protokol erken kelp embriyosundaki ilk tam lazer ablasyon protokolüdür. Prosedür, kahverengi alglerde embriyogenez sırasında hücre kaderini ve etkileşimini araştırmak için güvenilir bir yaklaşım sunmaktadır. Lokal hücresel lazer ablasyon, hücreler üzerinde yüksek hassasiyet ve doku seviyesi ile temporal ve özel ablasyona izin verir.Bu yaklaşım, kahverengi alglerin erken embriyosundaki hücre kaderlerini ve etkileşimini incelemek için umut verici bir yöntemdir. Birkaç değişiklikle diğer alg sistemlerine uygulanabilir. Ablasyon adımı sırasında seçilecek embriyoları bulmak ve seçilen embriyoların sonraki gelişimini izlemek için tüm Petri kabını görüntüleyerek başlayın.Kutucuk taramasını başlatın. Petri kabının dört kardinal noktasının konumunu kaydedin. Metin yazısında tanımlanan parametreleri girin ve tüm Petri kabının iletilen veya floresan görüntülerini düşük çözünürlükte elde edin.Döşeme tarama görüntüsünü kaydedin ve görüntü alma yazılımı penceresinde açık tutun. Petri kabını çıkarmadan hedefi değiştirin. Taramada ilgilendiğiniz embriyoları bulun.Lazeri kalibre etmek için, lazer sürücüsü ve görüntü alma yazılım paketini açın. Ardından lazer yolunu başlatın. Lazer sürücüsü yazıl

targeted-laser-ablation-in-the-embryo-of-saccharina-latissima

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Burada sunulan yöntem, yüksek enerjili lazer darbeleri ve zamanla bu yaralanmalar ve kurtarma ileri analizi ile canlı zebrafish embriyo kesin hasar oluşur. Ayrıca genetik olarak tek etiketli veya iskelet kas hücre gruplarının sırasında ve lazer ışık kaynaklı hasar sonrası takip edilebilir göstermek.

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Source: Morsch, M.,  vd. al., Konvansiyonel UV Lazer Konfokal Mikroskopi Kullanarak Hücre Stresini ve Ölümünü Tetikleme. J. Vis. Exp. (2017) Bu videoda, transgenik zebra balıklarında tek tek nöronları hassas bir şekilde hedeflemek ve incelemek için yüksek yoğunluklu UV lazer ablasyon tekniğini keşfediyoruz. Yaralanma ve iyileşmenin hücresel dinamiklerini vurgulayarak nöronal tepkilerin nasıl hazırlanacağını, hareketsiz hale getirileceğini ve görselleştirileceğini gösteriyoruz.

Konfokal Mikroskop Kullanılarak Zebra Balığı Larvasında Seçici Tek Nöron Lazer Ablasyonu

Source: Muto, A., et al. İki Fotonlu Lazer Kullanılarak Bir Nöronal Popülasyonun Ablasyonu ve Zebra Balığı Larvalarında Kalsiyum Görüntüleme ve Davranışsal Kayıt Kullanılarak Değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Bu videoda, agarozla hareketsiz hale getirilmiş zebra balığı larvalarında floresan nöronların seçici olarak yok edilmesini sağlayan iki fotonlu bir lazer ablasyon prosedürü gösterilmektedir. İşlemden önce ve sonra...

Bir Zebra Balığı LarAva'da İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Hedeflenen Nöronal Ablasyon

Amphipod Parhyale hawaiensis kabuklu embriyoloji ve karşılaştırmalı eklembacaklı gelişim ve evrim çalışmaları için umut verici bir model organizmadır. Bu protokol Parhyale erken bölünme evresindeki embriyolar, tek blastomerlerin elle çıkarılması için bir yöntem tarif eder.

Amphipod Crustacean Sekiz hücreli embriyolardan Tek Hücre Ablasyon<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Bu protokol, çiftlik hayvanı zigotlarında sitoplazmik mikroenjeksiyonun nasıl yapılacağını gösterir. Bu teknik, nakavt hayvanlar oluşturmak için genom düzenleme araçları gibi tek hücreli embriyoya herhangi bir çözelti vermek için kullanılabilir.

Lazer destekli Hayvancılık Zigotlann Sitoplazmik Mikroenjeksiyon

Lazer ablasyon biyolojik sistemlerde rejenerasyon eğitimi için yaygın olarak uygulanan bir teknolojidir. Sunulan protokol, lazer ablasyon için standart bir lazer tarama konfokal mikroskobu ve zebrabalığı lateral hattında ki internöromast hücrelerinin yenilenmesinin daha sonra zaman atlamalı görüntülemesini açıklar.

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Embriyonik gelişim, hücre hareketinin büyük ölçekli koordinasyonunu gerektirir. İki fotonlu ekscitasyon aracılı lazer ablasyon, büyük derin hücre gruplarının mekansal olarak kontrol edilen 3 boyutlu ablasyonunu sağlar. Ek olarak, bu teknik , in vivo olarak toplu olarak göç eden hücrelerin mekanik ortamlarındaki pertürbasyonlara reaksiyonlarını araştırabilir.

Zebrafish Gastrula'da İki Foton Mikroskobu Kullanılarak Derin ve Mekansal Kontrollü Hacim Ablasyonları

Bu protokol, larva elleçlemesi için otomatik bir mikroakışkan platform ile birleştirilmiş bir lazer lezyon sistemi kullanarak zebra balığı larvalarında dokuya özgü ve yüksek oranda tekrarlanabilir yaralanmaları indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır.

Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar

Bu protokol, sağlam Drosophila larvalarında bireysel nöronların lazer hücresi ablasyonunu gösterir. Yöntem, gelişmekte olan sinir sistemindeki nöronlar arasındaki rekabeti azaltmanın etkisinin incelenmesini sağlar.

Sağlam Drosophila Larvalarında Lazer Hücre Ablasyonu Sinaptik Rekabeti Ortaya Çıkardı

Bu protokol, zebra balığı larvalarında gerçekleştirilen ve kemik rejenerasyonunu ve ablasyona karşı bağışıklık tepkisinin etkilerini incelemek için bir model görevi gören iki fotonlu bir lazer ablasyon yaklaşımını tanımlar.

Gelişmekte Olan Zebra Balığı Larvalarında Osteoblastların İki Foton Lazer Aracılı Ablasyonu

Öğrenin, Saccharina latissima embriyolarında lazer ablasyonu yöntemiyle hücre kaderini ve embriyogenez sırasındaki etkileşimleri nasıl araştırabilirsiniz. Bu hassas teknik, kahverengi alglerde gelişim biyolojisi çalışmaları için güvenilir bir temel sunar.

Saccharina latissima Embriyosunda Hedefe Yönelik Lazer Ablasyonu

Daha fazla video keşfet