Name: Bewertung der photosynthetischen Effizienz in photorespiratorischen Mutanten mittels Chlorophyllfluoreszenzanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie photorespiratorische Mutanten in Arabidopsis durch Chlorophyllfluoreszenzanalyse nach niedrigem CO2 identifizieren. Diese Hochdurchsatzmethode ermöglicht schnelle Quantenausbeute-Messungen für Pflanzenstressforschung.

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Diese Forschung wurde vom Louisiana Board of Regents (AWD-AM210544) finanziert.

1. Saatgutaufbereitung und Sterilisation
HINWEIS: Die Saatgutvorbereitung besteht aus Saatgutaufnahme und Saatgutsterilisation. Es ist wichtig zu beachten, dass alle diese Schritte in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden müssen, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. Alle notwendigen Materialien, Reagenzien und Wachstumsmedien müssen autoklaviert werden (siehe Materialtabelle).
<ol><li>Saatgutaufnahme und -schichtung HINWEIS: Die verwendeten Seed-Linien sind plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) und Wildtyp (WT, Col-0).<ol><li>Geben Sie die Samen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Die Samen in sterilem Wasser in einer Laminar-Flow-Haube aufnehmen und bei 4 °C bei Dunkelheit für 2 Tage schichten.</li>
	</ol></li>
	<li>Saatgutsterilisation<ol><li>Unter sterilen Bedingungen 10 ml 50% (v/v) Bleichlösung vorbereiten und etwa 20 μL Tween 20 hinzufügen. Für die Saatgutsterilisation Wasser aus den aufgenommenen Samen entfernen, 1 ml Bleichlösung in die Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die Bleichlösung mit einer Pipette.</li>
		<li>Spülen Sie die Samen in 1 ml sterilem Wasser ab, um sie zu resuspendieren. Entfernen Sie das Wasser, sobald sich die Samen auf dem Boden abgesetzt haben. Wiederholen Sie Schritt 1.6 und Schritt 1.7 siebenmal.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Samen in steriler 0,1% iger Agaroselösung.</li>
	</ol></li>
	<li>Saatgutbeschichtung<ol><li>Machen Sie ein 1 L Volumen Murashige & Skoog Basal Medium mit Vitaminen und 1,0 g / L 2-(N-morphonio) ethansulfonsäure (MS), indem Sie 5,43 g des Pulvers zu 500 ml destilliertem Wasser geben. Stellen Sie den pH-Wert zwischen 5,6 und 5,8 mit Kaliumhydroxid (KOH) ein. Mit destilliertem Wasser auf 1 L füllen.<ol><li>Die flüssige Lösung wird in 500 ml aufgeteilt und jeweils zur Hälfte in einen 1-l-Kolben gegeben, der einen magnetischen Rührstab enthält. Man fügt 5 g Agarpulver hinzu, um für jeden Kolben eine 1%ige Agarw/v-Lösung zu erhalten.</li>
			<li>Autoklav bei 121 °C und 15 psi für 30 min; Dann unter langsamem Rühren bei Raumtemperatur platzieren. Nach dem Abkühlen 25 ml MS-Agar in eine quadratische Petrischale gießen. Lassen Sie es erstarren. HINWEIS: Diese Murashige & Skoog Basal Medium Platten enthalten 1% MS-Medium mit Vitaminen und 1% Agar für die Kultivierung der Testmutanten.</li>
		</ol></li>
		<li>Schneiden Sie eine 200 μL Pipettenspitze mit einer Rasierklinge ab. Platzieren Sie einen Samen in der Mitte des vorgesehenen quadratischen Gitters für jede Testmutante oder jeden Genotyp (1 cm2 Quadrat) einer quadratischen MS-Platte (Abbildung 1) mit einer 200 μL Mikropipette. HINWEIS: Das quadratische Raster von 1 cm x 1 cm hilft, einen gleichmäßigen Abstand zwischen den Sämlingen einzuhalten und Überlappungen zu vermeiden, was bei der späteren Fluoreszenzbildgebung und -analyse wichtig sein wird.</li>
		<li>Sobald die Samen plattiert sind, wickeln Sie sie mit chirurgischem Klebeband um den Deckel, um ihn zu versiegeln, und legen Sie ihn unter den unten beschriebenen Bedingungen in die Wachstumskammer.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Pflanzenwachstum undCO2-arme Behandlung
<ol><li>Wachsen Sie die Pflanzen für 7-9 Tage bei 20 °C unter einem 8 h Lichtzyklus von 120 μmol·m−2s−1 und 16 h Dunkelheit bei 18 °C. Überprüfen Sie die Pflanzen am 6. Tag, um festzustellen, ob sie groß genug für die Bildgebung sind. Am 8. Tag nach der Beschichtung setzen Sie die Pflanzen einem niedrigen CO2 aus.</li>
	<li>Niedrige CO2 -Behandlung<ol><li>Nach den 7-9 Tagen werden vier der acht Platten aus den Bedingungen der Umgebungswachstumskammer in photorespiratorische Bedingungen von 20 °C, Dauerlichtstärken von 200 μmol·m−2 s−1 und niedrigem CO2 für 12h gelegt.</li>
		<li>Konstruieren Sie den niedrigen CO2-Zustand mit einem luftdichten transparenten Behälter mit 100 g Kalknatron, der im Boden des Behälters platziert ist. Stellen Sie den Behälter in dieselbe Wachstumskammer wie die Steuerung. Halten Sie die Kontrollanlagen 12 h lang unter 120 μmol·m−2 s−1 in CO2Umgebungstemperatur.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Konfiguration des Fluoreszenzbildgebungssystems
<ol><li>Legen Sie eine Prüfplatte (vorbereitet nach Abschnitt 1 und Abschnitt 2) zentriert unter der Kamera in einem festen Abstand in das Fluoreszenzbildgebungssystem.</li>
	<li>Navigieren Sie in der Gerätesoftware zum Live-Fenster und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Blitze , um nicht-aktinische Messblitze einzuschalten.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Zoom - und Fokuswerkzeuge , bis ein vollständiges und scharfes Bild sichtbar ist. Verwenden Sie dazu eine Bühne oder ein Regal, um den Abstand zwischen den Pflanzen und der Kamera einzustellen. Halten Sie den Zoom, den Fokus und den Abstand zur Kamera während des gesamten Experiments konstant.</li>
	<li>Stellen Sie den Wert von El. Shutter auf 0 ein und stellen Sie die Empfindlichkeit ein, um ein Fluoreszenzsignal im Bereich von 200-500 digitalen Einheiten zu erhalten. HINWEIS: Ein niedrigerer El. Shutter-Wert (0-1) stellt sicher, dass die Messblitze nicht aktinisch sind, während ein höherer Wert (2) die Auflösung des Bildes verbessert.</li>
	<li>Stellen Sie einen Belichtungsmesser in die gleiche Position, die zum Anpassen der Kameraeinstellungen verwendet wurde.</li>
	<li>Aktivieren Sie im Live-Fenster das Kontrollkästchen Super , um einen Sättigungsimpuls von 800 ms zu starten. Denken Sie daran, das Kontrollkästchen jedes Mal für einen neuen Impuls anzukreuzen.</li>
	<li>Verwenden Sie den Schieberegler, um den Prozentsatz der relativen Leistung für den Superpuls anzupassen, bis der Belichtungsmesser 6.000-8.000 μmol·m−2s−1 anzeigt.</li>
</ol>4. Entwerfen Sie das Quantenausbeuteprogramm
<ol><li>Importieren Sie Standardbetriebswerkzeuge für das Imaging-System. default.inc einschließen Light.inc einschließen HINWEIS: Die Programmsyntax, die in diesem Experiment als Referenz verwendet wird, gilt für ein FluorCam-Bildgebungssystem.</li>
	<li>Definieren Sie die folgenden globalen Variablen entsprechend den konfigurierten Lichteinstellungen: Verschluss = 0 Empfindlichkeit = 40 Super = 65</li>
	<li>Geben Sie den Zeitschritt für die Protokollierung von Daten an: TS = 20ms</li>
	<li>Sammeln Sie die Fo-Messung, indem Sie die Fluoreszenz in einem dunkel angepassten Zustand abtasten. F0duration = 2s; F0periode = 200ms; HINWEIS: F0duration definiert den Zeitbereich, über den die dunkelangepasste Fluoreszenz aufgezeichnet wird. F0periode definiert das Zeitintervall, über das die dunkeladaptierte Fluoreszenzmessung wiederholt wird.</li>
	<li>Zeichnen Sie die Fo-Messungen in Datentabellen auf. <0,F0periode.. F0duration>=>mfmsub <0s>->checkpoint,"startFo" <F0duration - F0period>=>checkpoint,"endFo"; Dabei < , stellt > den Satz von Fluoreszenzwerten dar, die nach Zeit indiziert sind. => speichert Messungen in einer Systemdatei; mfmsub stellt den gesamten Datensatz für das Experiment dar. und checkpoint erstellt eine Teilmenge für Daten bestimmter Messungen wie startFo.</li>
	<li>Sammeln und speichern Sie die FM-Messung durch Probenahme der Fluoreszenz nach einem Sättigungsimpuls. PulseDuration=960ms; ## a1=F0Dauer + 40ms a2 = a1 + 480ms; <a1>=>SatPulse(PulseDuration); <a1 + 80ms, a1 + 160ms.a1 + PulseDuration>=>mfmsub <a1 + PulseDuration + 80ms>=>mfmsub; <a2>=>checkpoint,"startFm" <a1 + PulseDuration - 80ms>=>checkpoint,"endFm" <a2 + 80ms>=>checkpoint,"timeVisual"; wobei a1 und a2 Variablen sind, um die Probenahmezeit mit dem Sättigungsimpuls zu koordinieren; a1 steht für die Startzeit der Fm-Messung; und a2 steht für die Mittelpunktszeit des Pulses.</li>
</ol>5. Messung der Quantenausbeute der behandelten Proben
<ol><li>Direkt nach der Behandlung die Platten für 15 min mit Aluminiumfolie abdecken, um die Anpassung an die Dunkelheit zu gewährleisten. Entfernen Sie die Folie, um die Quantenausbeute des Photosystems II mit einem pulsamplitudenmodifizierten Fluorometer zu messen. Platzieren Sie dann die Keimlingsplatte direkt unter der Kamera und führen Sie das Quantenausbeuteprotokoll aus, das Sie im GitHub-Repository finden.</li>
	<li>Laden Sie das quantum_yield Protokoll von GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) herunter oder verwenden Sie ein ähnlich gestaltetes Programm aus Abschnitt 4. Verwenden Sie die Software des Fluorometers, um die Programmdatei zu öffnen, indem Sie auf das Ordnersymbol klicken und zum Speicherort der Datei navigieren.</li>
	<li>Führen Sie das Quantenausbeuteprogramm aus, indem Sie auf das rote Blitzsymbol klicken.</li>
	<li>Navigieren Sie nach Abschluss des Protokolls zum Voranalysefenster . Unterteilen Sie die Platte in einzelne Sämlinge, indem Sie mithilfe der Auswahlwerkzeuge alle Pixel für jeden Sämling auf dem Plattenbild hervorheben. Klicken Sie auf Hintergrundausschluss , um alle hervorgehobenen Hintergrundpixel zu entfernen, sodass nur der Sämlingsbereich übrig bleibt.</li>
	<li>Klicken Sie auf Analysieren, um Fluoreszenzdaten für jeden Sämling auf dem Plattenbild zu generieren. Stellen Sie den Fluoreszenzwertbereich manuell ein, um konsistente Minimal- und Maximalwerte für alle Platten anzuzeigen.</li>
	<li>Klicken Sie im Reiter Experiment | auf Numerischer-Durchschnitt | exportieren Numerisch. Wählen Sie Alle Daten und nach Spalte aus, und klicken Sie auf OK, um eine Textdatei mit QY-Messungen für jeden Sämling zu generieren.</li>
</ol>6. Öffnen der Datendatei
<ol><li>Öffnen Sie die Textdatei zur Analyse in einer Tabelle. Von den Überschriften, die die Flächennummer, die Größe der Pixel, Fm, Ft, Fq und QY anzeigen, identifizieren Sie die Bereichsnummer für den Kerngenotyp (WT oder Testmutante) und QYmax. Führen Sie einen paarweisen t-Test in Bezug auf den Wildtyp durch, um die Signifikanz zu bestimmen. Daten werden als signifikant unterschiedlich interpretiert, wenn p-Werte unter 0,05 liegen.</li>
</ol>

<ol><li>Peterhansel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorespiration%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Photorespiration.</a> Arabidopsis Book. 8, 0130(2010).</li>
<li>Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+analysis+as+tool+for+the+discovery+of+transport+proteins+in+photorespiration%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration.</a> Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).</li>
<li>Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+closing+the+remaining+gaps+in+photorespiration--the+essential+but+unexplored+role+of+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards closing the remaining gaps in photorespiration--the essential but unexplored role of transport proteins.</a> Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).</li>
<li>Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+costs+of+photorespiration+to+food+production+now+and+in+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The costs of photorespiration to food production now and in the future.</a> Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).</li>
<li>South, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid+sodium+symporter+BASS6+can+transport+glycolate+and+is+involved+in+photorespiratory+metabolism+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).</li>
<li>Pick, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGG1%2C+a+plastidic+glycolate+glycerate+transporter%2C+is+required+for+photorespiration+and+defines+a+unique+class+of+metabolite+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters.</a> Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).</li>
<li>Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+proteins+enabling+plant+photorespiratory+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism.</a> Plants. 10 (5), 880(2021).</li>
<li>Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+fluorescence+screening+of+Arabidopsis+thaliana+for+CO2+sensitive+photorespiration+and+photoinhibition+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants.</a> Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).</li>
<li>Ogawa, T., Sonoike, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+mutants+using+chlorophyll+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Screening of mutants using chlorophyll fluorescence.</a> Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).</li>
<li>Kleffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+chloroplast+proteome+reveals+pathway+abundance+and+novel+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions.</a> Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).</li>
<li>Hempel, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Molecular+characterization+of+the+plastid-localized+ABC+protein+TAP1+in+Arabidopsis+thaliana%22">Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Stavanger. Ph.D. thesis (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte.

Die in diesem Artikel beschriebenen experimentellen Methoden haben einige Vorteile und Einschränkungen. Ein Vorteil ist, dass diese Methode viele Pflanzensämlinge untersuchen kann, obwohl einige Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden müssen, um eine Kontamination der Pflanzenmedienplatte während des Galvanisierungs- und Wachstumsprozesses zu verhindern. Daher ist es wichtig, die Arabidopsis-Platten mit chirurgischem Klebeband zu versiegeln. Ein weiterer Vorteil dieses Experiments ist, dass es eine kürzere photorespiratorisc...

Abiotische Stressbedingungen, die häufig auf den Feldern von Landwirten auftreten, können sich negativ auf die Ernteerträge auswirken, indem sie die photosynthetische Effizienz verringern. Schädliche Umweltbedingungen wie Hitzewellen, Klimawandel, Dürre und Bodensalzgehalt können abiotische Belastungen verursachen, die die Verfügbarkeit von CO2 verändern und die Reaktion einer Pflanze auf hohen Lichtstress verringern. Die beiden größten terrestrischen Kohlenstoffflüsse sind Photosynthese und Photorespiration, die für das Pflanzenwachstum und die Ernteerträge unerlässlich sind. Viele der wichtigen Proteine und Enzyme, die an diesen Prozessen beteiligt sind, wurden unter Laborbedingungen charakterisiert und auf genetischer Ebeneidentifiziert 1. Obwohl große Fortschritte beim Verständnis der Photosynthese und Photorespiration erzielt wurden, bleiben viele Schritte, einschließlich des Transports zwischen Pflanzenorganellen, uncharakterisiert 2,3.
Die Photorespiration, der zweitgrößte Kohlenstofffluss in Pflanzen nach der Photosynthese, beginnt, wenn das Enzym Rubisco Sauerstoff anstelle von Kohlendioxid zu Ribulose-1,5-Bisphosphat (RuBP) fixiert und die hemmende Verbindung 2-Phosphoglycolat (2PG)1 erzeugt. Um die hemmende Wirkung von 2PG zu minimieren und den zuvor gebundenen Kohlenstoff zu recyceln, haben C3-Pflanzen den multiorganellaren Prozess der Photorespiration entwickelt. Die Photorespiration wandelt zwei Moleküle von 2PG in ein Molekül 3-Phosphoglycerat (3PGA) um, das wieder in den C3-Kohlenstofffixierungszykluseintreten kann 1. So wandelt die Photorespiration nur 75% des zuvor fixierten Kohlenstoffs aus der Erzeugung von 2PG um und verbraucht dabei ATP. Infolgedessen ist der Prozess der Photorespiration eine signifikante Belastung des photosynthetischen Prozesses von 10% -50%, abhängig von der Wasserverfügbarkeit und den Temperaturen in der Vegetationsperiode4.
Die an der Photorespiration beteiligten Enzyme sind seit Jahrzehnten ein Forschungsschwerpunkt, aber nur wenige Transportproteine wurden auf genetischer Ebene charakterisiert, obwohl mindestens 25 Transportschritte am Prozess beteiligt sind 5,6,7. Die beiden Transportproteine, die direkt an der Bewegung des bei der Photorespiration erzeugten Kohlenstoffs beteiligt sind, sind der plastidische Glykolat/Glycerat-Transporter PLGG1 und der Gallensäure-Natriumsymporter BASS6, die beide am Export von Glykolat aus dem Chloroplasten 5,6 beteiligt sind.
Unter Umgebungstemperatur [CO2] fixiert Rubisco ein Sauerstoffmolekül in etwa 20% der Fälle an RuBP1. Wenn Pflanzen niedrigem [CO 2] ausgesetzt sind, steigt die Photorespirationsrate, was ein niedriges [CO2] zu einer idealen Umgebung macht, um auf Mutanten zu testen, die unter erhöhtem Photorespirationsstress wichtig sein können. Das Testen zusätzlicher mutmaßlicher Chloroplasten-Transportprotein-T-DNA-Linien unter niedrigemCO2 für 24 h und die Messung von Veränderungen der Chlorophyllfluoreszenz führten zur Identifizierung von bass6-1-Pflanzenlinien, die einen Photorespirationsmutanten-Phänotyp5 zeigten. Eine weitere Charakterisierung zeigte, dass BASS6 ein Glykolattransporter in der inneren Membran des Chloroplasten ist.
Dieser Artikel beschreibt detailliert ein Protokoll, das dem ähnelt, das ursprünglich zur Identifizierung von BASS6 als Photorespirationstransporter verwendet wurde, das aus einer Liste mutmaßlicher Transportproteine stammt, die sich innerhalb der Chloroplastenmembran befinden8 Dieses Protokoll kann in einem Hochdurchsatzexperiment zur Charakterisierung von Arabidopsis-T-DNA-Mutanten oder EMS-generierten mutierten Pflanzen verwendet werden, um Gene zu identifizieren, die für die Aufrechterhaltung der photosynthetischen Effizienz unter einer Reihe von abiotischen Belastungen wie Hitze wichtig sind. hohe Lichtbelastung, Trockenheit und CO2 -Verfügbarkeit. Das Screening von Pflanzenmutanten mittels Chlorophyllfluoreszenz wurde in der Vergangenheit verwendet, um schnell Gene zu identifizieren, die für den Primärstoffwechsel wichtigsind 9. Da bis zu 30% des Arabidopsis-Genoms Gene enthalten, die für Proteine mit unbekannter oder schlecht charakterisierter Funktion kodieren, könnte die stressinduzierte Analyse der photosynthetischen Effizienz Einblicke in molekulare Funktionen geben, die unter kontrollierten Bedingungen in mutierten Pflanzen nicht beobachtet werden10. Ziel dieser Methode ist es, Mutanten des photorespiratorischen Weges mittels einesCO2-armen Screenings zu identifizieren. Wir stellen eine Methode vor, um Mutanten zu identifizieren, die die Photorespiration nach Exposition gegenüber niedrigemCO2 stören. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass es sich um ein Hochdurchsatz-Screening für Sämlinge handelt, das in relativ kurzer Zeit durchgeführt werden kann. Die Videoprotokollabschnitte enthalten Details zur Saatgutvorbereitung und -sterilisation, zum Pflanzenwachstum und zur Behandlung mit niedrigemCO2-Wert , zur Konfiguration des Fluoreszenzbildgebungssystems, zur Messung der Quantenausbeute der behandelten Proben, zu repräsentativen Ergebnissen und zu Schlussfolgerungen.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>10810-070</td><td>Behälter für die Saatgutsterilisation</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>9012-36-6</td><td>Chemikalie zur Suspendierung von Saatgut zur Erleichterung der Beschichtung</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana Samen (abcb26)</td><td>ABRC, bestellt über TAIR www.arabidopsis.org</td> SALK_085232 <td>Arabidopsis-Samen als Versuchsgruppe verwendet</td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana Samen (plgg1-1)</td><td>ABRC, bestellt über TAIR</td><td>www.arabidopsis.org SALK_053469C</td><td>elterliche Arabidopsis-Samen&nbsp;</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana Samen (WT)</td><td>ABRC, bestellt über TAIR www.arabidopsis.org</td><td>Col-0</td><td>arabidopsis Wildtyp-Saatgut, das als Kontrollgruppe verwendet wurde</td></tr><tr><td>&nbsp; Bleichmittel&nbsp;</td><td>Clarox</td><td>generisches Bleichmittel&nbsp;</td><td>Chemikalie zur Sterilisation von Saatgut</td></tr><tr><td>Carbolime absorbierendes Mittel</td><td>Medline Produkte</td><td>S232-104-001</td><td>CO2 absorbierendes Mittel</td></tr><tr><td>Geschlossen FluorCam</td><td>Photon Systems Instruments</td><td>FC 800-C</td><td>Fluoreszenz-Imager</td></tr><tr><td>FluoroCam FC 800-C</td><td>Photon Systems Instruments</td><td>Geschlossen FluorCam FC 800-C/1010-S</td><td>Fluoreszenz-Imager</td></tr><tr><td>FluoroCam7</td><td>Photon Systems Instruments</td><td>Geschlossen FluorCam FC 800-C/1010- S</td><td>Fluoreszenz-Bildanalysesoftware</td></tr><tr><td>Gelzan (Pflanzen-Agar)</td><td>Phytotech Labs</td><td>71010-52-1</td><td>Chemikalie zur Verfestigung von MS-Medien als Platten&nbsp;</td></tr><tr><td>Glaskolben 1 L</td><td>Fisherbrand</td><td>FB5011000</td><td>Behälter für die Herstellung und das Autoklavieren von MS Media</td></tr><tr><td>Wachstumskammer</td><td>Caron</td><td>7317-50-2</td><td>Wachstumskammer für den Anbau von Pflanzen</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Basal Medium mit Vitaminen & 1,0 g/l MES (MS)Phytotech</td> <td>Labs</td><td>M5531&nbsp;</td><td>Wachstumsmedien für Arabidopsis-Sämlinge&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid (KOH)</td><td>Phytotech Labs</td><td>1310-58-3</td><td>stellt als 1 M Lösung für die pH-Einstellung</td></tr><tr><td>Spinnenlichter</td> her <td>Mean Well Enterprises</td><td>XLG-100-H-AB</td><td>Lichter, die im Lichtassay verwendet werden&nbsp;</td></tr><tr><td>Quadratische Petrischale mit Gitter, steril</td><td>Simport Scientific</td><td>D21016</td><td>zur Aufnahme von MS-Medien für Arabidopsis-Sämlinge chirurgisches</td></tr><tr><td>Klebeband</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td>Band zum Versiegeln von Platten</td></tr><tr><td>zwischen 20</td><td>Biorad</td><td>&nbsp; 9005-64-5</td><td>Tensid zur Unterstützung der Saatgutsterilisation</td></tr></tbody></table>

bewertung der photosynthetischen effizienz in photorespiratorischen mutanten mittels chlorophyllfluoreszenzanalyse

Evaluation of Photosynthetic Efficiency in Photorespiratory Mutants by Chlorophyll Fluorescence Analysis

Photosynthese und Photorespiration stellen die größten Kohlenstoffflüsse im pflanzlichen Primärstoffwechsel dar und sind für das Überleben der Pflanzen notwendig. Viele der Enzyme und Gene, die für die Photosynthese und Photorespiration wichtig sind, sind seit Jahrzehnten gut untersucht, aber einige Aspekte dieser biochemischen Wege und ihre Wechselwirkung mit mehreren subzellulären Prozessen sind noch nicht vollständig verstanden. Ein Großteil der Arbeit, die die Gene und Proteine identifiziert hat, die für den Pflanzenstoffwechsel wichtig sind, wurde unter streng kontrollierten Umgebungen durchgeführt, die möglicherweise nicht am besten darstellen, wie Photosynthese und Photorespiration in natürlichen und landwirtschaftlichen Umgebungen funktionieren. In Anbetracht der Tatsache, dass abiotischer Stress zu einer Beeinträchtigung der photosynthetischen Effizienz führt, ist die Entwicklung eines Hochdurchsatz-Screens erforderlich, der sowohl abiotischen Stress als auch seine Auswirkungen auf die Photosynthese überwachen kann.
Daher haben wir eine relativ schnelle Methode entwickelt, um nach abiotischen stressinduzierten Veränderungen der photosynthetischen Effizienz zu suchen, die nicht charakterisierte Gene mit Rollen bei der Photorespiration mithilfe von Chlorophyllfluoreszenzanalyse und niedrigem CO2-Screening identifizieren kann. Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Untersuchung von Veränderungen der photosynthetischen Effizienz in transferierten DNA (T-DNA) Knockout-Mutanten in Arabidopsis thaliana. Die gleiche Methode kann für das Screening von Ethylmethansulfonat (EMS)-induzierten Mutanten oder Suppressor-Screening verwendet werden. Mit dieser Methode können Genkandidaten für weitere Studien im pflanzlichen Primärstoffwechsel und in abiotischen Stressreaktionen identifiziert werden. Daten aus dieser Methode können Einblicke in die Genfunktion geben, die möglicherweise erst erkannt werden, wenn sie erhöhten Stressumgebungen ausgesetzt sind.

Die Ergebnisse zeigen Plattenbilder von Roh- und Fluoreszenzbildern aus dem Umgebungs- undCO2-Screening von WT- und Testmutanten. Jedes Pflänzchen ist nach Flächennummer gekennzeichnet, wobei die entsprechenden Fluoreszenzwerte als QY angegeben werden. Die Daten werden als Textdatei exportiert und können zur Analyse in einer Tabelle geöffnet werden (siehe Zusatztabelle S1). Die Mutantenlinien plgg1-1 und abcb26 wurden ausgewählt, um die positive und negative Identifizierung v...

Wir beschreiben einen Ansatz zur Messung von Veränderungen der photosynthetischen Effizienz in Pflanzen nach Behandlung mit niedrigemCO2 mittels Chlorophyllfluoreszenz.

Bewertung der photosynthetischen Effizienz in photorespiratorischen Mutanten mittels Chlorophyllfluoreszenzanalyse

Photosynthesis and photorespiration represent the largest carbon fluxes in plant primary metabolism and are necessary for plant survival. Many of the ...

Ziel dieser Methode ist es, Mutanten im photorespiratorischen Pfad mittels eines CO2-armen Screenings zu identifizieren. Wir stellen eine Methode vor, um Mutanten zu identifizieren, die die Photorespiration nach Exposition gegenüber niedrigem CO2 stören. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass es sich um ein Hochdurchsatz-Screening für Sämlinge handelt, das in relativ kurzer Zeit durchgeführt werden kann.Die folgenden Abschnitte enthalten Details zur Saatgutvorbereitung und -sterilisation, zum Pflanzenwachstum und zur CO2-armen Behandlung, zur Konfiguration des Fluoreszenzbildgebungssystems, zur Messung der Quantenausbeute behandelter Proben, zu repräsentativen Ergebnissen und Schlussfolgerungen. Saatgutaufbereitung und Sterilisation. Die Saatgutaufbereitung besteht aus Saatgutaufnahme und Saatgutsterilisation.Es ist wichtig zu beachten, dass alle diese Schritte in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um sterile Bedingungen zu erhalten. Alle notwendigen Materialien, Reagenzien und Wachstumsmedien werden autoklaviert. Die verwendeten Samenlinien sind plgg1-1, abcb26 und WT oder Wildtyp.Samen in sterilem Wasser in einer Laminar-Flow-Haube aufsaugen und dann zwei Tage lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln schichten. Unter sterilen Bedingungen 10 Milliliter 50% Volumen-zu-Volumen-Bleichlösung vorbereiten und etwa 20 Mikroliter Tween 20 hinzufügen. Entfernen Sie Wasser aus den aufgenommenen Samen, geben Sie dann einen Milliliter Bleichlösung in das Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie die Bleichlösung mit einer Pipette. Spülen Sie die Samen in einem Milliliter sterilem Wasser ab, um sie zu resuspendieren. Entfernen Sie das Wasser, sobald sich die Samen auf dem Boden abgesetzt haben.Samen in steriler 0,1%iger Agaroselösung resuspendieren. Zur Saatgutbeschichtung Basalmediumplatten mit 1%MS-Medium mit Vitaminen und 1%Agar zur Kultivierung der Testmutanten. Schneiden Sie eine 200 Mikroliter große Pipettenspitze mit einer Rasierklinge ab.Legen Sie mit einer Pipette einen Samen in die Mitte des dafür vorgesehenen quadratischen Gitters für jede Testmutante oder jeden Genotyp. Hier kommt eine quadratische Platte mit einem Raster von einem mal einem Zentimeter zum Einsatz. Dies hilft, einen gleichmäßigen Abstand zwischen den einzelnen Sämlingen einzuhalten und Überlappungen zu vermeiden, was später in der Fluoreszenzbildgebung und -analyse wichtig sein wird.Sobald die Samen beschichtet sind, wickeln Sie chirurgisches Klebeband um den Deckel, um es zu versiegeln, und legen Sie es dann in die Wachstumskammer. Pflanzenwachstum und CO2-arme Behandlung. Züchten Sie Pflanzen für sieben bis neun Tage bei 20 Grad Celsius unter einem achtstündigen Lichtzyklus von 120 Mikromol pro Quadratmeter pro Sekunde und 16 Stunden Dunkelheit bei 18 Grad Celsius.Überprüfen Sie die Pflanzen am sechsten Tag, um festzustellen, ob sie groß genug für die Bildgebung sind. Am achten Tag nach der Beschichtung die Pflanzen einem niedrigen CO2-Gehalt aussetzen. Stellen Sie die Kläranlagen 12 Stunden lang in eine versiegelte Box innerhalb der Wachstumskammer mit einer Lichtintensität von 200 Mikromol pro Quadratmeter und Sekunde.Der CO2-arme Zustand wurde mit einem luftdichten transparenten Behälter mit 100 Gramm Kalknatron, der im Boden des Behälters platziert wurde, konstruiert. Der Behälter wurde in derselben Wachstumskammer wie die Steuerung platziert. Die Kontrollanlagen bleiben 12 Stunden lang unter 120 Mikromol pro Quadratmeter und Sekunde im Umgebungs-CO2.Konfigurieren Sie das Fluoreszenzbildgebungssystem. Platzieren Sie eine Testplatte zentriert unter der Kamera in einem festen Abstand im Fluoreszenzbildgebungssystem. Navigieren Sie in der Gerätesoftware zum Live-Fenster und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Blitze, um nicht-aktinische Messblitze einzuschalten.Klicken Sie auf die Zoom- und Fokuswerkzeuge, bis Sie ein vollständiges und scharfes Bild sehen. Stellen Sie den Wert des EL-Verschlusses auf Null ein und passen Sie die Empfindlichkeit an, um ein Fluoreszenzsignal im Bereich von 200 bis 500 digitalen Einheiten zu erhalten. Stellen Sie einen Belichtungsmesser in die gleiche Position, die zum Anpassen der Kameraeinstellungen verwendet wurde.Aktivieren Sie im Live-Fenster das Kontrollkästchen Super, um einen Sättigungsimpuls zu starten, der 800 Millisekunden anhält. Verwenden Sie den Schieberegler, um den Prozentsatz der relativen Leistung für den Superpuls anzupassen, bis der Belichtungsmesser 6.000 bis 8.000 Mikromol pro Quadratmeter und Sekunde anzeigt. Messung der Quantenausbeute behandelter Proben.Direkt nach der Behandlung decken Sie die Platten mit Aluminiumfolie für 15 Minuten zur dunklen Anpassung ab. Entfernen Sie die Folie, um die Quantenausbeute von Photosystem zwei mit einem pulsamplitudenmodifizierten Fluorometer zu messen. Platzieren Sie dann die Keimlingsplatte direkt unter der Kamera und führen Sie das Quantenausbeuteprotokoll aus, das Sie in unserem GitHub-Repository finden.Laden Sie das Quantum Yield Protocol von GitHub herunter. Verwenden Sie eine Fluorometer-Software, um die Programmdatei zu öffnen, indem Sie auf das Ordnersymbol klicken und zum Dateispeicherort navigieren. Führen Sie das Quantenausbeuteprotokoll aus, indem Sie auf das rote Blitzsymbol klicken.Navigieren Sie nach Abschluss des Protokolls zum Voranalysefenster. Unterteilen Sie die Platte in einzelne Sämlinge, indem Sie alle Pixel für jeden Sämling auf dem Plattenbild hervorheben. Klicken Sie auf Hintergrundausschluss, um alle hervorgehobenen Hintergrundpixel zu entfernen, sodass nur der Sämlingsbereich übrig bleibt.Klicken Sie auf Analysieren, um Fluoreszenzdaten für jeden Sämling auf dem Plattenbild zu generieren. Stellen Sie den Fluoreszenzwertbereich manuell ein, um konsistente Minimal- und Maximalwerte für alle Platten anzuzeigen. Klicken Sie auf der Registerkarte Experiment auf Exportieren und dann auf Numerisch.Klicken Sie auf Numerischer Durchschnitt, um eine Textdatei zu generieren, die die Quantenausbeute für jeden Sämling enthält. Öffnen Sie die Textdatei und die Tabelle zur Analyse. Die Tabelle enthält die Bereichsnummer, die Größe der Pixel, Fm, Ft, Fq und QY. Zuerst müssen wir die Gebietsnummer zu ihrem entsprechenden Genotyp identifizieren, ob Wildtyp oder Testmutante, Ergebnisse.Hier sind die Plattenbilder von Roh- und Fluoreszenzbildern aus dem Umgebungs- und CO2-armen Screening von Wildtypen und Testmutanten. Jede Platte ist mit einer Flächenzahl mit entsprechenden Fluoreszenzwerten als Quantenausbeute oder QY gekennzeichnet. Die Daten werden als Textdatei exportiert und können zur Analyse in einer Tabelle geöffnet werden. Die dunkel angepassten Fv/Fm-Quantenertragseffizienzen von Wildtypen und Mutanten werden durch Box- und Whisker-Plots visualisiert.Um den statistischen Unterschied von Wildtypen und Testmutanten zu testen, wurde ein paarweiser T-Test mit einem P-Wert von weniger als 0,05 verwendet. Hier verwenden wir die photorespiratorische Mutantenlinie mit reduzierter Quantenausbeute Fv/Fm als Testmutante, um die Effizienz unserer Screening-Methode zu überprüfen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Testmutanten im Vergleich zu den Wildtypen eine signifikant geringere Quantenertragseffizienz aufweisen.Dies deutet darauf hin, dass unsere Screening-Methode in der Lage ist, photorespiratorische Mutanten mittels CO2-armem Screening zu identifizieren. Schlüsse. Eine wichtige Sache, an die Sie sich bei der Verwendung dieses Protokolls erinnern sollten, ist sicherzustellen, dass Arabidopsis-Sämlinge groß genug sind, um die Fluoreszenz zu messen, aber nicht so groß, dass sich die Pflanzen während der Bildgebung überlappen würden. Es wird bevorzugt, die Sämlinge als die ersten echten Blätter darzustellen, um zu versuchen, die Blattgröße und die Blattwinkel einheitlich zu halten.Dieses Protokoll kann als Hochdurchsatz-Screening für Sämlinge verwendet werden. Die Abbildung jeder Platte ist relativ schnell und hat das Potenzial, weit über 1.000 Sämlinge pro Tag zu screenen. Die Chlorophyllfluoreszenzanalyse ermöglichte es uns, photorespiratorische Mutanten mit einem CO2-armen Screening zu identifizieren, was für die Aufrechterhaltung der Photorespirationseffizienz wichtig ist.Dieses Protokoll ist nicht auf Arabidopsis beschränkt und hat die potenzielle Verwendung für abiotische Stressreaktionsexperimente.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Lichtsammelkomplexen in vitro. Diese integralen Membranproteine koordinieren Chlorophylle und Carotinoide und sind für die Lichternte in höheren Pflanzen und Grünalgen verantwortlich.

In-vitro-Rekonstitution der Lichtsammelkomplexe der Pflanzen und Grünalgen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für das Studium der Pflanze Wuchsverhalten und vor allem Phänotypen reproduzierbar. Wir zeigen wie Sie bieten Variable und in der gleichen Zeit stabilen Lichtverhältnissen. Richtige Analysen hängen ausreichend Probennummern und gültige statistische Auswertungen.

Analyse von Arabidopsis Thaliana Wuchsverhalten in verschiedenen Licht-Qualitäten

Wir beschreiben einen neuen technischen Ansatz zur Untersuchung photosynthetischer Reaktionen in  höheren Pflanzen mit gleichzeitigen Messungen von Chlorophyll, Fluoreszenz und Blattreflexion mit einem PAM und einem Spektralradiometer zur Detektion von Signalen aus dem gleichen Blattbereichs in Arabidopsis.

Auswertung photosynthetischer Verhaltensweisen durch gleichzeitige Messungen von Blattreflexion simultanen und Chlorophyllfluoreszenzanalysen

Das Fast Repetition Rate Fluorometer (FRRf) ist eine nützliche Methode zur Messung der Photophysiologie des Photosystems II und der Primärproduktivität. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der PSII-Photophysiologie der Epizoenalge Colacium sp. auf Substratzooplankton mit Küvettentyp FRRf.

Messung der Photophysiologie des angeschlossenen Stadiums von Colacium sp. mit einem Küvetten-Fluorometer mit schneller Wiederholungsrate

Das Protokoll führt eine Hochdurchsatzmethode zur Messung der Relaxation der nicht-photochemischen Abschreckung durch pulsamplitudenmodulierte Chlorophyllfluorometrie ein. Die Methode wird auf feldgezüchtetes Glycine max angewendet und kann an andere Arten angepasst werden, um nach genetischer Vielfalt oder Brutpopulationen zu suchen.

Hochdurchsatzanalyse der nicht-photochemischen Abschreckung in Kulturpflanzen mittels pulsamplitudenmodulierter Chlorophyllfluorometrie

Die meisten schwimmenden photoautotrophen Organismen zeigen photoinduzierte Verhaltensänderungen (Photobehavior). Das vorliegende Protokoll beobachtet das besagte Photoverhalten im Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii.

Beobachtung des Photoverhaltens bei Chlamydomonas reinhardtii

Das vorliegende Protokoll beschreibt die schrittweise Autofluoreszenz-Bildgebung und Bewertung von Phycobiliprotein-Veränderungen in Rotalgen auf der Grundlage einer Spektralanalyse. Dies ist eine markierungsfreie und zerstörungsfreie Methode, um die zelluläre Anpassung an extreme Lebensräume zu bewerten, wenn nur knappes Material verfügbar ist und Zellen unter Laborbedingungen langsam oder gar nicht wachsen.

Autofluoreszenz-Bildgebung zur Bewertung der Rotalgenphysiologie

Hier beschreiben wir ein fortschrittliches Werkzeug zur Überwachung der Chlorophyllbiosynthese in den frühen Stadien der Arabidopsis-Keimlingsentetiolierung.   Die neuartige Methodik ermöglicht eine nicht-invasive Echtzeit-Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Nicht-invasiver Assay zur Bestimmung der Chlorophyll-Biosynthese-Kinetik in frühen Stadien der Arabidopsis-De-etiolation

Dieses Manuskript beschreibt einen zerstörungsfreien, hochdurchsatzfähigen Ansatz für autonome Feldmessungen der Quanteneffizienz des Photosystems II, der spektralen Reflexion und der Pflanzenarchitektur, der eine großflächige Phänotypisierung der Kronenphotosynthese in agronomischen und Zuchtfeldversuchen ermöglicht.

Hochdurchsatz-Screening der photosynthetischen Effizienz in Nutzpflanzen im Feld mit einem autonomen Roboter

Mit hochfrequenten elektrischen Stimulation, Beschlagnahme-ähnliche Aktivität kann in induziert...

Neurocircuit Assays für Anfällen bei Epilepsie Mutanten Drosophila</em

Erfahren Sie, wie Sie photorespiratorische Mutanten in Arabidopsis durch Chlorophyllfluoreszenzanalyse nach niedrigem CO2 identifizieren. Diese Hochdurchsatzmethode ermöglicht schnelle Quantenausbeute-Messungen für Pflanzenstressforschung.

Bewertung der photosynthetischen Effizienz in photorespiratorischen Mutanten mittels Chlorophyllfluoreszenzanalyse

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