En vevsryddingsmetode for nevronal avbildning fra mesoskopisk til mikroskopisk skala

Vår protokoll vil legge til rette for undersøkelse av nevronstrukturer fra krets til komponentskalaer, noe som er avgjørende for bedre forståelse av hjernefunksjoner. Vår clearing teknikk, ScaleSF utøver potent clearing evne, samt et høyt nivå av vev bevaring som er nødvendig for samtidig visualisering av både store og småskala strukturer. Vår protokoll er spesielt effektiv i hjernen der nevronceller viser forseggjorte prosesser, enorme lenker og arrangerer spesialiserte fine subcellulære strukturer.

Før du begynner eksperimentet, klargjør du Sca/eS-løsninger som vist i denne tabellen og dekker prøvene med folie. Start prosedyren ved å legge til åtte milliliter hver av ScaleS0- og ScaleS4-løsninger til to separate brønner av en seks brønncellekulturplate og forvarm platen til 37 grader Celsius i en inkubator. Overfør hjerneskivene til den forvarmede ScaleS0-løsningen med en spatel og inkuber skivene i to timer ved 37 grader Celsius i en ristende inkubator ved 90 RPM.

Deretter overfører du de permeabiliserte hjerneskivene i åtte milliliter PBS minus i en seks brønncellekulturplate og vasker i 15 minutter ved å holde i en orbital shaker ved 40 til 60 RPM. Gjenta dette trinnet to ganger. Overfør deretter hjerneskivene i åtte milliliter forvarmet ScaleS4-løsning og inkuber i åtte til 12 timer ved 90 RPM ved 37 grader Celsius.

For kammerforberedelse skriver 3D ut kammerrammen og mikroskoptrinnadaptere. Fest kammerrammen til en dekslelip ved hjelp av et trykkfølsomt lim. Klargjør 1,5 % agarose i ScaleS4D25(0)-løsningen.

Bland løsningen og mikrobølgeovn den til agarose er helt oppløst. La deretter løsningen avkjøles til 37 grader Celsius. Monter den ryddede hjerneskiven på bunndekslene på bildekammeret med en slikkepott.

Fjern overflødig løsning fra den ryddede skiven ved hjelp av et rent vev. Tilsett ScaleS4 gel i hjernestykket ved hjelp av en mikropipette for å fylle bildekammeret. Legg en annen deksleslip på toppen med tang etterfulgt av et stykke silkepapir og en glasssklie.

Overfør bildekammeret til et kjøleskap ved fire grader Celsius. Plasser metallvekter på glasssklie og la dem stå i 30 minutter. Etter inkubasjonen, fjern materialet fra bildekammeret og tørk av overflødig gel.

Legg bildekammeret i en Petri-tallerken på 60 millimeter glass og fest kanten av bildekammeret på flere punkter til parabolen med et trykkfølsomt lim. Hell ScaleS4-løsningen i parabolen og rist forsiktig i en time ved 40 til 60 RPM ved 20 til 25 grader Celsius. Erstatt med frisk oppløsning og fjern luftbobler på geloverflaten ved å skrape overflaten forsiktig ved hjelp av en pipettespiss.

Monter bildekammeret på et mikroskopstadium. Forbered et konfokalt laserskanningsmikroskop utstyrt med et objektivt objektiv med multi-nedsenking på 2,5 millimeter arbeidsavstand, 16x forstørrelse og 0,60 numerisk blenderåpning. Slå på alt relevant bildeutstyr, for eksempel arbeidsstasjon, mikroskop, skanner, lasere, kvikksølvlampe og start en bildebehandlingsprogramvare.

Sett korreksjonskragen på objektivlinsen for multi-nedsenking til 1,47. Senk objektivlinsen ned i oppløsningen og la den nærme seg skiven sakte. Fjern alle luftbobler som er fanget på spissen av objektivlinsen.

Finn regioner av interesse for ryddet vev ved hjelp av epifluorescence. Hvis du vil angi parametere for bildeanskaffelse, må du først bestemme bitdybden for bildeanskaffelse etter hvert som størrelsen på bildet øker med biten. Still deretter inn deteksjonsbølgelengden i henhold til utslippsspekteret.

Angi XY-oppløsning, skannehastighet og hullstørrelse. Juster også lasereffekten, detektorforsterkerforsterkningen og forskjøvet til et passende bilde er oppnådd. Bestem flisstørrelsen basert på størrelsen på avkastningen, og sørg for at hele lengden og bredden på avkastningen fanges opp.

Naviger gjennom vevet i alle plan og angi start og endepunkt for stabelen. Still inn Z-trinnstørrelsen i henhold til ønsket Z-oppløsning. Samle bildene og behandle dem ved hjelp av bildeanalyseprogramvare.

Ved hjelp av denne protokollen ble optisk rydding av en musehjerneskive med en millimeter tykkelse oppnådd. EGFP-uttrykk i hjernebarken til PV-FGL-mus viste at vevets fluorescens og strukturelle integritet ble bevart. Brytningsindekskonflikt induserte avvik forårsaket et merkbart tap av bildelysstyrke og oppløsning av EGFP-positive nevroner.

Disse nevronene ble tydelig visualisert med det kondole laserskanningsmikroskopet da korreksjonskragen ble justert for å matche denne ScaleS4-løsningen. 3D-rekonstruksjon av EGFP-merkede nevroner i musens primære somatosensoriske cortex ble gjort i en millimeter tykk hjerneskive. Individuelle dendritiske arbors dekorert med dendritiske spines ble sett ved høyere forstørrelse.

Axon terminal arborization og axonal boutons ble også observert i skiver. Refleksindeks som samsvarer mellom bildevæske og objektlinse er avgjørende for 3D-avbildning i renset vev. Vår teknikk vil lette integrering av nevronstruktur fra krets til komponentskalaer, og gi innsikt i nevronmekanismer, informasjon om behandling i hjernen.