将人干细胞衍生的GABA能神经元移植到出生后早期小鼠海马体中以减轻神经发育障碍

这种方法允许在发育健康和患病的大脑中长时间研究移植中间神经元的细胞身份、整合和功能。该协议描述了快速高效的人类干细胞衍生的GABA能中间神经元样前体的产生，这些前体存活并成熟到幼稚和转基因小鼠的海马体中。这种方法有助于我们评估在中间神经元受损的发育障碍中使用细胞疗法的治疗潜力。

首先，从人源性中间神经元前体中取出细胞培养基，并用不含钙和镁的DPBS仔细冲洗。向六孔板的每个孔中加入400微升细胞分离溶液。在培养箱中以37摄氏度孵育两到三分钟，直到细胞的边界开始看起来有光泽。

然后，向六孔板的每个孔中加入600微升新鲜N 2培养基以停止细胞分离溶液，并使用移液器机械分离细胞以获得单细胞悬液。将细胞悬液转移到塑料管中，并在室温下以180G离心四分钟。使用真空系统弃去上清液并将沉淀重悬于移植培养基中。

使用计数室和计数计数器计数悬浮液中的总细胞，并将体积调节至每微升100， 000个细胞的最终浓度。将细胞悬液保持在冰上的封闭管中，直到移植最多四个小时。麻醉后立即将幼犬放在湿冰表面上的湿纸巾上三分钟，直到上肢变白。

用移液管小心地重悬细胞，并用细胞悬浮液装入注射器。通过将幼犬放在立体定位框架上并在相反方向上使用耳杆来定位幼犬。接下来，使用浸泡在乙醇中的软组织清洁皮肤表面。

识别λ并在立体定位仪器的数字显示控制台上将坐标设置为零。将汉密尔顿注射器重新定位到所需坐标后，使用90度弯曲的胰岛素针穿透颅骨，形成一个小孔。然后，将汉密尔顿注射器放下，直到针头穿过颅骨并将背腹坐标归零。

降低针头，直到达到所需的背腹坐标。注射干细胞后，慢慢收回针头。通过用手加热小狗直到它开始移动，然后再将其归还给母亲来结束该过程。

在移植后第14天或移植后两个月均未发现针对移植细胞的免疫反应或局部炎症，这是通过使用Iba1，CD68和半乳糖凝集素-3鉴定的反应性小胶质细胞的缺失来评估的。星形胶质细胞增多的程度由神经胶质纤维酸性蛋白和炎性细胞因子（例如白细胞介素-1）以及细胞毒性淋巴细胞的缺失决定。在Cntnap2敲除小鼠中，人类干细胞衍生的神经元间样细胞在移植后存活长达九个月，并定位在注射部位。

虽然，它们也分散在同侧甚至对侧海马体中，正如在野生型小鼠中观察到的那样。该协议需要练习以确保对大脑的最小破坏和压缩，并在程序的速度和坐标的精度之间保持良好的平衡。该协议与一系列技术兼容，例如连接研究或功能读数，如电生理学或行为研究，具体取决于您的研究，感兴趣的问题。